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Hind-Limb orthotopique transplantation chez le rat

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Immunology and Infection

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Summary

Nous décrivons ici le rat procédure de transplantation orthotopique arrière-membre, ce qui semble être l'étalon-or

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Sucher, R., Oberhuber, R., Margreiter, C., Rumberg, G., Jindal, R., Lee, W. A., Margreiter, R., Pratschke, J., Schneeberger, S., Brandacher, G. Orthotopic Hind-Limb Transplantation in Rats. J. Vis. Exp. (41), e2022, doi:10.3791/2022 (2010).

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Abstract

Allotransplantation de tissus composites (ATC) représente désormais une option thérapeutique valable après la perte d'une main, l'avant-bras ou de chiffres et est devenu une entité thérapeutique nouvelle dans la chirurgie reconstructrice. Cependant, à long terme de fortes doses de plusieurs médicaments immunosuppresseurs est nécessaire pour assurer la survie du greffon, portant le risque d'effets secondaires graves qui licols application plus large. Progression de plus dans ce domaine peuvent dépendre meilleure compréhension de l'immunologie fondamentale et de lésions de reperfusion d'ischémie dans les greffes de tissus composites.

À ce jour, la transplantation orthotopique des membres postérieurs chez le rat a été le modèle de rongeur préféré pour la reconstruction de transplantation (RT), cependant, il est une procédure extrêmement exigeant qui demande des compétences de microchirurgie extraordinaire pour le rattachement de la vascularisation, les os, les muscles et les nerfs.

Nous avons introduit la technique de la coiffe des anastomosés à ce modèle, offrant une approche rapide et fiable à la transplantation chez le rat des membres postérieurs. Cette technique simplifie et raccourcit la procédure chirurgicale et permet aux chirurgiens ayant l'expérience de microchirurgie de base pour réaliser avec succès l'opération avec la survie élevé et faible taux de complications. La technique semble être bien adapté pour immunologiques ainsi que l'ischémie reperfusion (IRI) des études.

Protocol

Fonctionnement des donateurs et Hind-Limb récolte

  1. Pour la procédure opératoire d'un ensemble d'instruments de microchirurgie stériles sont utilisées. Le chirurgien doit porter des vêtements appropriés, y compris des gants stériles, qui doivent être modifiés avant le début de la procédure chirurgicale.
  2. Le rat est anesthésié par une injection intrapéritonéale de pentobarbital (50mg/kg IP) et placé en décubitus dorsal sur un champ d'opération chauffée, ce qui facilite une température corporelle des animaux stables pendant toute la procédure chirurgicale.
  3. Avant l'incision de la peau a déposé de l'opération est aseptisée trois fois avec les deux, un désinfectant et de l'alcool. Pour éviter les cornées des animaux de se dessécher, les yeux sont lubrifiés avec une pommade ophtalmique (Vidisic) avant la chirurgie.
  4. Une incision cutanée est faite à travers l'aine droite à peu près au niveau du ligament inguinal. Les vaisseaux fémoraux sont disséqués avec bipolaire et la dissection; branches profondes sont ligués avec 8-0 soie.
  5. 300μl (50 UI) d'héparine sont injectées dans la veine du pénis pour l'anti-coagulation.
  6. Vaisseaux fémoraux sont ligaturées au niveau du ligament inguinal et couper en aval de la ligature.
  7. Le membre postérieur est rincée avec de la glace-froid (4 ° C) HTK solution (5 ml) par l'artère fémorale de plus de 5 minutes.
  8. Tous les groupes musculaires sont très divisés avec des ciseaux et une ostéotomie est réalisée avec un électrique tournante vu au niveau du tiers distal du fémur.
  9. Le membre récolté est ensuite immergée dans 20 ml de solution glacée HTK pour la préservation et de stockage à froid jusqu'à la transplantation.

Récipiendaire de fonctionnement et la transplantation

  1. Le rat est anesthésié par une injection intrapéritonéale de pentobarbital et placé en position couchée sur le champ opératoire.
  2. Une incision cutanée est faite à travers l'aine droite à peu près au niveau du ligament inguinal. Les vaisseaux fémoraux sont disséqués avec bipolaire et la dissection.
  3. Vaisseaux fémoraux sont ligués en distal que possible, mais en amont de la cuve décollage épigastrique. Clamps vasculaires sont placés au niveau du ligament inguinal sur l'artère et la veine.
  4. Un brassard polyéthylène est tiré sur l'artère (diamètre intérieur du brassard: 0.912 mm, boutons de manchette épaisseur de paroi: 0.010 mm, longueur du brassard: 2,0 mm) et la veine (diamètre intérieur du brassard: 1.151 mm; manchette épaisseur de paroi: 0.010 mm, longueur manchette : 2,0 mm). Le bord de la lumière du vaisseau est alors tiré avec un dilatateur des navires et l'artère et la veine fémorales sont éversée sur tout le corps de la coiffe (environ 2mm) et fixé avec un circonférentielle 8-0 ligature de soie.
  5. Pour faire place à la branche des bailleurs de fonds du membre destinataire est enlevé avec dissection des groupes musculaires et ostéotomie est effectuée à la mi-fémur.
  6. Le membre donateur est retirée de la solution HTK et de la transplantation débute avec ostéosynthèse du fémur à l'aide d'une aiguille de calibre 18 (longueur: 1.5-2.0 cm) comme une tige intramédullaire.
  7. Groupes de muscles ventraux sont étroitement approchée avec Vicryl 4-0 ou Prolène sutures interrompues.
  8. Anastomoses vasculaires sont réalisées en tirant la veine des bailleurs de fonds et de l'artère de la veine des bénéficiaires et complexe brassard. Un circonférentielle 8-0 ligature de soie est de nouveau placé pour sécuriser l'anastomose.
  9. La pince est relâchée veineuse suivie par la pince artérielle, et la reperfusion est visualisée par le retour de la couleur à l'extrémité du membre et du pied, ainsi que le flux pulsatile dans l'artère.
  10. Les autres groupes musculaires dorsales sont ré-approchée avec Vicryl 4-0 ou Prolène sutures interrompues.
  11. La peau est fermée avec Vicryl 4-0 ou prolène sutures interrompues.
  12. Le rat receveur est placé sur un coussin chauffant et surveillé de près jusqu'à la guérison.
  13. Animaux bénéficiaires reçoivent des antibiotiques prophylactiques (céfazoline, 20 mg / jour, IM) et Buprenex (0,1 mg / kg, SC) pendant trois jours après la greffe.

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Discussion

Des décennies de recherches expérimentales ont précédé et permis la transplantation réussie main de l'homme dans le passé récent. En 1978, Shapiro et al. développé un modèle orthotopique postérieurs greffe des membres chez le rat, bien adapté à l'étude de divers aspects pathologiques, physiologiques et immunologiques ainsi que les résultats fonctionnels des greffes de tissus composites. Nous avons modifié la partie la plus difficile de la procédure, à savoir l'anastomose vasculaire, en introduisant une technique coiffe non suture. Par rapport à la technique de suture classique, il simplifie et raccourcit la procédure chirurgicale et permet aux chirurgiens d'expérience de microchirurgie de base pour effectuer la procédure avec un taux de survie élevé (80-90%).

Sans la variabilité des anastomoses suturées, le risque d'hémorragie, thrombose, et plicature du pédicule sont diminuées. Constriction ou de la turbulence à l'endroit où le sang se heurte d'abord avec la lumière passant à travers le brassard est un nouveau risque potentiel de la technique la coiffe, bien que cela peut être minimisé avec une sélection brassard de taille appropriée. Par ailleurs, les inadéquations de petite taille peuvent facilement être manipulés avec une anastomose manchette, ce qui réduit encore le risque inhérent à la suture des navires de différents diamètres. Certaines des considérations les plus importantes pour une anastomose coiffe succès sont donnés ci-dessous:

  1. Une seule injection de pentobarbital (50 mg / kg IP) devrait être suffisante pour anesthésier l'animal pendant 90 minutes. Dans le cas où l'opération dure plus de 70-80 minutes une dose supplémentaire de 15mg/kg IP devraient être appliquées. Profondeur de l'anesthésie peut être testé pendant l'opération en répétant le test toe-pincement réflexe.
  2. L'ostéotomie de l'arrière des membres donateurs / bénéficiaires des membres postérieurs doivent être effectués à la mi-fémur pour atténuer ostéosynthèse lors de la transplantation.
  3. Une sélection minutieuse des tailles brassard est d'une importance cruciale pour la revascularisation réussie.
  4. Afin d'éviter les thromboses, l'héparine (50IU) doit être administré au donateur 1 minute avant la perfusion du greffon.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nembutal® OVATION Pharmaceuticals
Heparin Immuno Ebewe Pharma
Custodiol HTK Solution Essential Pharmaceuticals
Adventitia Scissors ASSI ASSI®SAS-21 R-8T
Forceps ASSI ASSI®JFC-7
Dilator Forceps ASSI ASSI®D-5AZ
Polymide Tubes River Tech Medical #17; #19

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. J Surg Res. 24, (6), 501-506 (1978).
  2. Petruzzo, P. The international registry on hand and composite tissue transplantation. Transplantation. 86, (4), 487-492 (2008).
  3. Schneeberger, S. First forearm transplantation: outcome at 3 years. Am J Transplant. 7, (7), 1753-1762 (2007).

Comments

1 Comment

  1. I'm a medical Laboratory Scientist, a young graduate of Virology working in Microbiology, National Hospital, Abuja, Nigeria, Africa. My interest is on tissue culture technology, please, how i get your assistance? Please contact me as follows: +²34-8064²²9²75

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 14, 2010 - 3:24 AM

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