عبر الاحليل تحريض العدوى ماوس المسالك البولية

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وهذا الفيديو شرح طرق للحث على transurethrally التهابات المسالك البولية والماوس تحديد مدى الإصابات الناجمة عن ذلك.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection. J. Vis. Exp. (42), e2070, doi:10.3791/2070 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تزرع سلالات بكتيرية Uropathogenic الفائدة على أجار. عموما ، uropathogenic

Protocol

أولا إعداد القسطرات الإحليلي

  1. لكل الماوس المثانة والكلى لأخذ عينات ، ومكان 5-6 حبات الفولاذ المقاوم للصدأ (المثانة ، و 1.6 مم أو مزيج 0،9-2،0 ملم) او الخرز أكسيد الزركونيوم (الكلى ، وحجم 0.5 ملم) في أنبوب واحد cryovial ، على التوالي. الأوتوكلاف الأنابيب التي تحتوي على حبة.
  2. بعد أنابيب بارد لدرجة الحرارة المحيطة ، إضافة microliters من 200 برنامج تلفزيوني العقيمة على كل حبة غير القابل للصدأ الأنابيب التي تحتوي على الحديد و 400 microliters من برنامج تلفزيوني العقيمة على كل حبة الزركونيوم الانبوب المحتوية على أكسيد.
  3. نحن نستعد إحليلي القسطرة كما وصفها المعلق وHultgren 13. الأوتوكلاف زوج نظيف من مسطح الرأس ملقط ومقص غرامة (القزحية أو نوع مشابه) والسماح للصكوك لتبرد لدرجة حرارة المحيط. مسح أسفل الأسطح لتدفق الصفحي هود مع الايثانول 70 ٪. في غطاء المحرك ، وقطع 30 سم (تقريبا) جزء من أنابيب البولي ايثيلين. المكان جو معقم و مطهر إبرة معقمة قياس 30 (إبرة طويلة 1 / 2 بوصة) على محقنة معقمة سم 3. التقط واحدة من نهاية قطع أنابيب البولي ايثيلين مع ملقط تعقيمها ، وحرك الأنبوب على الإبرة حتى يلتقي المحور. قطع الأنابيب بحيث حوالي 2 سم يمتد إلى أبعد من رأس الإبرة. إزالة القسطرة من المحاقن وضعها في طبق بتري معقمة.
  4. للحد من احتمالات التلوث المتبادل ، ونحن جعل واحدة لكل القسطرة الماوس. بعد أن يتم بذل كل القسطرة ، تعقيم التعرض لهم من قبل في طبق بتري كشفت اشعة فوق البنفسجية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. لا تنظر مباشرة في مصابيح الأشعة فوق البنفسجية أو تعريض أي جزء من الجسم في حين يتم تنشيط غطاء المصابيح. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، يمكن تخزين القسطرة على المدى الطويل في طبق بتري. نوصي ختم الطبق مع Parafilm للمساعدة في الحفاظ العقم.

II. تلقيح الحيوانات

  1. وينبغي أن تصل الفئران على الأقل قبل أسبوع من التلاعب التجريبية بغية تجنب التوتر الناجم عن عوامل خارجية. وتستخدم الفئران الإناث لأن مجرى البول الماوس الذكور من الصعب للغاية يقثطر. CBA / J هي المستخدمة عادة ، التهاب المسالك البولية ، عرضة السلالة الفطرية الماوس. وينبغي أن تستخدم الفئران بين 8 و 12 أسبوعا من العمر ، لأن هذا هو الإطار من النضج المناعية قبل الشيخوخة. في اليوم الأول من التجربة ، وتراجع في نهاية حلقة عقيمة بتلقيح إلى قارورة من الأسهم البكتيرية المجمدة. كشط بإعداد قيحة الصغيرة والخروج متتالية على صفيحة آغار المناسبة. عموما ، uropathogenic E. يمكن زراعتها القولونية (UPEC) وغيرها من سلالات بين عشية وضحاها على آجار (LB) ، لوريا Bertani عند 37 درجة مئوية في الهواء المحيط. سلالات UPEC صلبة تنمو المستعمرات الأصفر والأبيض ، وشفافة على آجار LB. العودة فورا للسهم البكتيرية للمجمد. ويمكن للسلالات بكتيرية Uropathogenic تصبح أقل ضراوة مع مرور الوقت مع الثقافات وكرر التسلسلي. وبالتالي ، فإننا نوصي بها لوحة streaking آغار جديدة لكل تجربة.
  2. في يوم 2 من التجربة ، وبعد التأكد من مناسبة مورفولوجيا مستعمرة ، واختيار واحدة من لوحات المستعمرات آغار ومكان في لا يقل عن 5 سم مكعب من ثقافة مرق بين عشية وضحاها. ويمكن استخدام مرق LB عن سلالات بكتيرية أكثر uropathogenic (37 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة في الهواء المحيط). تبقي مباراة دولية فضفاضة على الأنابيب ثقافة مرق للسماح للتهوية.
  3. في يوم 3 من التجربة ، وتأخذ 10 ٪ من حساء الثقافة أولا والثقافة في مرق بين عشية وضحاها مرة أخرى (عادة 37 دورة في الدقيقة و 200 درجة مئوية) ، لتعزيز النوع الأول الشعرة التعبير. مرق الثقافات المسلسل تساعد على تحسين uropathogenicity البكتيرية ، وقد ثبت منذ النوع الأول من الشعرة ليكون عاملا حاسما لuropathogens الفوعة في الجسم الحي 1. تبقي مباراة دولية فضفاضة على الأنابيب ثقافة مرق للسماح للتهوية.
  4. في يوم 4 من التجربة ، وقياس OD 600 من ثقافة مرق من يوم 3. إن لم تكن معروفة من قبل لسلالة بكتيرية التي يجري اختبارها ، نفذ عشرة أضعاف تخفيف الطلاء على المسلسل لا يقل عن 7 سجلات (التخفيفات تنفيذها مع برنامج تلفزيوني ، والثقافات التي أجريت على آجار LB ، 37 درجة مئوية خلال الليل الحضانة) لتحديد العلاقة بين التطوير التنظيمي 600 و CFU / مل. كقاعدة عامة من الإبهام ، والتطوير التنظيمي 600 من 0،4-0،5 يتوافق عادة إلى 1 2x10 - 7 في 50 CFU microliters. مرة واحدة وقد تم تحديد العلاقة بين التطوير التنظيمي 600 و كفو / مل ، يمكن للمرء أن ضبط ثقافة مرق إلى 600 OD المقابلة لCFU المطلوب في الماوس في 50 microliters من برنامج تلفزيوني. وقد اقترح بعض الأعمال التي تلقيح 10 microliters ، بدلا من 50 ، ويؤدي إلى أقل الجزر في kidneys6. ومع ذلك ، فقد ذكرت معظم المنشورات استخدام 50 microliters في الماوس. عموما ، ويتراوح CFU المنشود بين 10 6 و 108 CFU / الماوس ، ولكن كل تركيبة سلالة بكتيرية / الماوس يحتاج إلى اختبار تجريبي في الجسم الحي.
  5. للمساعدة على ضمان أن لا يفرغ قائح على الفور بعد تقطير ، ينبغي حرمان الفئران من الماء على الأقل 30 دقيقة قبل تحريض التخدير العام. آخر مناورة رئيسية هي للحث على يفرغ قبل تحريض التخدير قبل scruffing الفئران والضغط بلطف السفلي abdomأون. اثنين الى 2.5 ٪ isoflurane هو جرعة آمنة للتحريض 8-12 اسبوع الفئران CBA الإناث ، تليها التخدير الصيانة مع 1،8-2 ٪ isoflurane.
  6. متى تم تحقيق التخدير ، ويتم وضع الفئران في موقف ضعيف مع رؤوسهم تدرج في الرؤوس متصلة isoflurane المحتوية على الأوكسجين. يتم تدليك أسفل البطن لاجلاء البول من المثانة. إذا كانت المثانة فارغة نسبيا ، وهذا قد لا تسفر عن مناورة البول. هي غارقة في أسفل البطن والعجان مع الايثانول 70 ٪.
  7. ويستخدم حقنة معقمة 1 سم بدون ابرة لوضع اللقاح المطلوب البكتيرية. المقبل ، يتم وضع قسطرة جو معقم و مطهر معقم الإحليل على حقنة. يتم قطع الأنبوب الزائدة قبالة القسطرة مع زوج من مقص بحيث 1-2 ملليمتر فقط من الأنابيب تبقى القاصي إلى رأس الإبرة. ثم ، يتم استغلالها في المحاقن والمكبس من الاكتئاب مع تستقيم حقنة لإزالة جميع الفقاعات. وجبة بوظة من جراثيم التشحيم هلام متدفق على طبق بتري معقمة أو داخل المجمع المحاقن المعقمة. وتراجع غيض من القسطرة (مع حقنة المرفقة) في الهلام. إذا كان يتم اختبار العديد من السلالات البكتيرية في التجربة نفسها ، يجب الحرص على عدم استخدام قطرة من نفس جيلي لتليين القسطرة التي تحتوي على سلالات مختلفة.
  8. باستخدام مجهر ستيريو (0.8x إلى مجموعة التكبير 5X) للتضخم ، يتم اغتنامها غطاء البظر بلطف من الفأرة تخدير في اليد غير المهيمن مع زوج من غرامة ملقط مسنن وأثار رأسيا لفضح العميق الصماخ الإحليل الوردي ( الشكل 1). واستوعب المحقنة (مع القسطرة المرفقة) في اليد المهيمنة مع قبضة قلم رصاص وتعمل غيض من قسطرة في مجرى البول الصماخ بزاوية 45 درجة. ويمتد غطاء البظر على طول المحور الطويل للحقنة ، على نحو فعال "تحميل" على مجرى البول القسطرة. هذه المناورة هو ضروري منذ الإحليل الماوس زائدة عن الحاجة. ينبغي أن تنزلق بسهولة قسطرة في المثانة (إلى المحور ، الشكل 2) ، ويمكن مدور بلطف للمساعدة في التنقل في طيات زائدة من مجرى البول. بمجرد hubbed القسطرة ، يمكن خفض حقنة حتى يتم بالتوازي مع محور طويل من الماوس. يمكن للجهة غير المهيمنة إسقاط ملقط للمساعدة في استقرار الوضع في القسطرة والمحاقن وجهة المهيمنة تستخدم لحقن اللقاح ببطء (لا يقل عن 5 ثوان). إذا رأيت السوائل المتدفقة حول القسطرة خلال الحقن ، وإما في المثانة ممتلئة أو القسطرة في المهبل (الذيلية لمجرد مجرى البول). وينبغي وقفها على الفور الحقن والقسطرة موقف درست بعناية. إذا كان القسطرة في مجرى البول ، يجب ألا تعطى الماوس يتم تضمينها في التجربة. من ناحية أخرى ، يمكن تعديل أوضاعها قسطرة في غير محله في المهبل ، وحاول إعادة الحقن. بعد الحقن ، ويتم سحب القسطرة ببطء والمحاقن من الماوس.
  9. للحد من احتمال يفرغ بعد التلقيح المبكر ، والتي قد تدار اجلاء البكتيريا ويؤدي بالتالي إلى مستويات العدوى متغير ، وبعض المحققين الحفاظ على الفئران تحت التخدير لمدة 30 دقيقة بعد inoculation10 عبر الاحليل. بعد الجراحة ، ويجب استرداد الفئران على بطانية الاحترار نظيفة مع المراقبة المستمرة لتأكيد عودة أنماط التنفس الطبيعي والنشاط. مرة واحدة الحيوانات تعافى تماما من القدرة على الزحف ، قد عادوا إلى الفراش المحتوية على الأقفاص.

III. قياس CFU في الأنسجة المصابة

  1. وأفادت مختلف المنشورات UTI الماوس على النتائج ثقافة في الفترة من 6 ساعات لمدة أسبوع واحد أو أكثر آخر التلقيح. النقاط الوقت الأمثل يجب أن يتم تحديد تجريبيا لكل تركيبة سلالة بكتيرية / الماوس. يتم الحصول على البول للثقافة باطلة scruffing بواسطة الماوس فوق طبق بتري معقمة. يجب أن تبقى البول التي جمعت على الجليد في جميع الأوقات. قد محاولات عدة للحصول على البول على مدى عدة ساعات باطلة يكون ضروريا ، لأن يفرغ الماوس بشكل متكرر ، وحجم منخفض (3-10 microliters في الفراغ) ، والتي تعتمد على الضغط.
  2. بعد الحصول على عينات البول باطلة ، ونحن نضحي الفئران باستخدام خلع isoflurane وعنق الرحم. جو معقم و مطهر فتح البطن. إذا لم تكن عينة البول التي تم الحصول عليها بنجاح باطلة في وقت سابق ، ويمكن في كثير من الأحيان كمية صغيرة من البول يمكن أن يستنشق عبر جدار المثانة باستخدام إبرة قياس 30 و المحاقن.
  3. تتم إزالة إحدى الكليتين أو كليهما ، المفروم إلى ما لا يقل عن 4 قطع (كل قطعة يجب أن تكون أقل من 50 ميكروغرام) على طبق بتري معقمة ، ووضعها في الزركونيوم حبة / PBS cryovials المحتوية على الجليد. يتم إزالة المثانة ، المفروم إلى ما لا يقل عن 4 قطع ، ووضعها في الفولاذ المقاوم للصدأ حبة / PBS cryovials المحتوية على الجليد. نسيج / حبة / PBS المحتوية cryovials يتم وضعها في خلاط رصاصة الخالط والمتجانس الأنسجة باستخدام "8" وضع السرعة لمدة دقيقة واحدة. ومن الشائع لبعض أجزاء الأنسجة لتبقى بعد التجانس. طالما يمكن pipetted 5-10 microliters جناسة من السائل ، وشظايا صلبةليست بالضرورة مشكلة. إذا زاد الوقت عن تجانس بعض العينات ، من المهم جدا أن تفعل ذلك بالنسبة لجميع الأنسجة من أجل الحفاظ على اتساق التجانس. نحن نستخدم رصاصة خلاط الخالط لأنه يتجنب احتمال التلوث المتبادل ، وأكثر سرعة من تجهيز العينات الفردية واحدة تلو الأخرى باستخدام الخالط القياسية ، وليس الحرارة بشكل كبير من العينات التي يجري المتجانس.
  4. وينبغي بذل ما لا يقل عن اثنين أو ثلاثة من عشرة أضعاف التخفيفات البول التي تم جمعها والنسيج الخليط في طبق microtiter. لإجراء التجارب الأولية قد يكون من الحكمة لجعل لا يقل عن سبعة عشرة أضعاف التخفيفات. ثقافة ما يصل الى 100 microliters البول والمثانة ، و / أو الكلى الخليط على أجار المناسبة. منذ البول العينات قد تكون محدودة الحجم ، قد يكون من الضروري جلب كميات ل100 microliters قبل تنفيذ عشرة أضعاف التخفيفات. إذا تطلب الأمر ذلك ، فإن التخفيف الأولي (قبل عشرة أضعاف تمييع) ضرورة أن يؤخذ في الاعتبار الحسابات النهائية للغلة البكتيرية. نحن نفضل UPEC على زراعة يوزين - الميثيلين الأزرق أو آغار ماكونكي (حضانة ليلا 37 درجة مئوية) ، لأن هذه وسائل الاعلام هي انتقائية للكائنات سلبية الغرام. سلالات UPEC تنمو على آغار ماكونكي كما مسرر مركزيا المستعمرات الأحمر الوردي ، وذلك بسبب قدرتها على تخمر اللاكتوز.
  5. بعد الثقافة بين عشية وضحاها ، عد CFU عن كل لوحة. لعينات المخفف متسلسل ، تعتبر لوحة تحتوي على تخفيف 5-10 المستعمرات العد الأكثر دقة. "عودة" حساب CFU في الأنسجة ، ولكل مليغرام من الأنسجة ، أو لكل مليلتر.

رابعا. ممثل النتائج

الشكل 1
الشكل 1. الصماخ الإحليلي (النسيج وردي غامق) كشفها بواسطة رفع غطاء البظر رأسيا مع ملقط (خارج أعلى الصورة)

الشكل 2
الشكل 2. مقسطر مجرى البول. ويمكن رؤية مشقوق البظر فقط فوق القسطرة.

الشكل 3
الشكل 3. CFU المثانة التهم 2 بعد أيام من العدوى عبر الاحليل من 8 اسابيع الفئران CBA / J أنثوية E. uropathogenic القولونية. وكانت متجانسة والعزم قربة كفو / مل بواسطة الطلاء تخفيف تسلسلي على آغار ماكونكي. الماس تشير كفو / مل الفئران الفردية ، شريط أفقي يشير متوسط ​​CFU / مل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحريض البولية عدوى المسالك الماوس بواسطة التلقيح عبر الاحليل من البكتيريا هو إجراء المنشأة منذ فترة طويلة لكنه طالب تقنيا 11. وعلقت Hultgren نشرت مؤخرا استعراضا ممتازة من التقنيات عبر الاحليل العدوى الماوس المسالك البولية 13. في هذه الورقة ، ونحن نحاول توضيح مزيد من النقاط الدقيقة لهذا النهج التجريبي.

قد المبتدئين الممارسة تقنيتهم ​​البطن عن طريق أداء خط الوسط لفضح المثانة ، حقن محلول مخفف من الحبر الهند (1 ٪ في برنامج تلفزيوني) ، ومراقبة لتلوين الزرقاء في المثانة. لقد وجدنا أن المثانة الكامل هو واحدة من المشاكل الأكثر صعوبة في التعامل معها خلال حقن فأر مجرى البول ، ويمنع على أفضل وجه الحرمان واستراتيجيات المياه يفرغ ما قبل التخدير المذكورة أعلاه. في أيدينا ، <10 ٪ من الفئران يحمل فيض من البول خلال حقن مجرى البول. آخر كتلة عثرة محتمل هو قسطرة الصدمة ، والذي يمكن أن يؤدي إلى ثقب مجرى البول ، جرعات غير لائق من قائح المثانة ، وحتى وفاة الحيوان. أسلوب لطيف والصبر مفتاح خلال قسطرة ، قسطرة ناجحة ينبغي أبدا تتطلب إجبار قسطرة في المثانة.

أخيرا ، قد يكون بعض المختبرات لا ترغب في استخدام رصاصة خلاط الخالط أو غيرها "سرعة متوسطة" الخالط ، إما بسبب انخفاض أعداد العينات أو اعتبارات التكلفة. والحل الوسط هو استخدام معيار الخالط وتنظيف الجهاز بين كل عينة. الحل هو الأكثر اقتصادا استخدام المطاحن الزجاج ، وهو ما يعمل بنجاح قبل التحول إلى رصاصة خلاط الخالط. بغض النظر عن الأسلوب تجانس النسيج المستخدمة ، والدقيق ، تقنية العقيم ، ومتسقة وحاسمة لتحقيق نتائج يمكن استنساخه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

فإن الكتاب أن نعترف Shelly شيه وباين جنيفر لمساعدتها التقنية للخبراء. وقدم هذا العمل ممكنا من خلال منح مقدمة من جمعية جراحة المسالك البولية للأطفال وأبحاث طب الأطفال الصندوق ستانفورد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) E&K Scientific 640201
Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring E&K Scientific 440011-N
Bullet Blender Next Advance BBX24
Zirconium Oxide Beads (0.5mm) Next Advance ZROB05
Stainless Steel Beads (1.6mm) Next Advance SSB16
Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) Next Advance SSB14B
CBA/J Mice, 8-12 week old female Jackson Laboratory 000656
Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) EMD Millipore EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)
LB agar
LB broth EMD Millipore 1.10285.0500
Isoflurane (Aerrane) Baxter Internationl Inc. NDC 10019-773-60
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-601
Eosin-methylene blue (EMB) agar powder Himedia Laboratories MM022-500G
MacConkey agar powder Difco Laboratories 212123
LB agar powder Difco Laboratories 244520
Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] BD Biosciences 427401
30 gauge needles, 1/2 inch BD Biosciences 305106
1 ml tuberculin Slip-Tip syringe BD Biosciences 309602
3 ml Luer-Lock syringe BD Biosciences 309585

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
  2. Rouschop, K. M. Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract. J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).
  3. Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli. Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).
  4. Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).
  5. Hvidberg, H. Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies. Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).
  6. Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
  7. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).
  8. Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).
  9. Bishop, B. L. Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells. Nat Med. 13, 625-630 (2007).
  10. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).
  11. Hagberg, L. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect Immun. 40, 273-283 (1983).
  12. Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
  13. Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).

Comments

3 Comments

  1. Very nice demonstration, Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 10:09 AM
  2. please make the whole video visible..Its very improtant for me..

    Reply
    Posted by: Kalpana R.
    February 6, 2014 - 2:24 AM
  3. this video is very important for me,please show the whole video

    Reply
    Posted by: azo p.
    June 22, 2014 - 11:20 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics