经尿道诱导小鼠尿路感染

Immunology and Infection

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Summary

此影片将展示transurethrally诱导小鼠尿路感染及造成的感染程度量化的方法。

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Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection. J. Vis. Exp. (42), e2070, doi:10.3791/2070 (2010).

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Abstract

生长在琼脂利益肾盂肾炎的菌株。一般而言,肾盂肾炎

Protocol

一,准备尿道导管

  1. 对于每个鼠标膀胱和肾脏进行采样,5-6不锈钢珠(膀胱,1.6毫米大小0.9-2.0毫米混合)或氧化锆珠(肾,0.5毫米大小),分别放置在一个离心管管。高压灭菌的含珠管。
  2. 管冷却至室温后,加入200微升无菌PBS,每个不锈钢含珠管和400微升无菌PBS每个氧化锆珠含管。
  3. 我们准备由红,侯德群13所述的尿道导管。高压灭菌一双干净的平头镊子和剪刀(光圈或类似)的罚款,并让仪器冷却到环境温度。层流罩与70%的乙醇擦拭表面。在油烟机,切一个30厘米的聚乙烯管材(近似)段。 3毫升无菌注射器,无菌的地方无菌30号针头(1 / 2英寸长针)。用灭菌镊子拿起削减聚乙烯管材的一端滑入针管,直到它符合枢纽。切管,使约2厘米的延伸超出针尖。取出导管,注射器,并在无菌培养皿。
  4. 要减少交叉污染的可能性,我们每个鼠标一个导管。所有导管后,他们发现培养皿中接触到至少30分钟的紫外线照射消毒。不要直视紫外线灯或灯被激活时,暴露在罩体的任何部分。紫外线照射后,导管可长期存储在培养皿中。我们建议用封口膜密封盘,以帮助保持无菌。

二。动物接种

  1. 小鼠实验操作前至少一个星期到达,以避免应力引起的混杂因素。雌性小鼠的使用,因为雄性小鼠尿道是非常困难的导尿的。 CBA / J是一​​个普遍使用,尿路感染易感自交系小鼠品系。老鼠应使用8周和12岁之间,因为这是免疫成熟的窗口前衰老。在实验的第一天,浸成一小瓶冷冻细菌股票无菌接种环结束。刮了一个小接种适当的琼脂平板上,连胜了。一般而言,肾盂肾炎大肠杆菌大肠杆菌 (UPEC)和其他菌株可过夜卢里亚Bertani(LB)琼脂在37℃周围空气中的C。 UPEC菌株成长为坚实,黄白色半透明的菌落在LB琼脂。立即返回细菌股票冰柜。肾盂肾炎的菌株,可随着时间的推移变得不那么致命的反复,串行文化。因此,我们建议每一个实验裸奔新鲜琼脂平板。
  2. 在实验的第2天,确认后适当的菌落形态,至少5毫升肉汤培养物中挑选单菌落琼脂平板和地方过夜。 LB培养基可用于大多数肾盂肾炎的菌株(37℃,周围空气中的200 RPM)。保持宽松的肉汤培养管的上限,允许曝气。
  3. 在实验的第3天,第一肉汤培养和肉汤培养的10%再次过夜(一般为37 ° C和200 RPM),以提高I型菌毛的表达。串行肉汤培养有利于优化细菌uropathogenicity,因为I型菌毛已被证明是一个关键致病因子在体内 1尿路病原体。保持宽松的肉汤培养管的上限,允许曝气。
  4. 在实验的第4天,从第3天测量的肉汤培养的OD 600。如果尚未被测试的菌株,执行了至少7原木(用PBS进行稀释,LB琼脂上执行的文化,37 ° C孵育过夜)10倍连续稀释电镀确定外径 600和CFU之间的关系/毫升。 0.4-0.5外径600作为一个经验法则,通常对应于1 - 2X10 7 CFU每50微升。一旦外径600 CFU /毫升之间的关系已经确定,可以调整肉汤培养物的OD 600对应所需的50微升的PBS CFU每鼠。 10微升,而不是50,接种,减少回流到kidneys6导致了一些工作建议。然而,大多数出版物使用鼠标微升50%。一般来说,10 6 108 CFU /鼠标,但每个细菌/小鼠品系组合需要经验体内测试所需的CFU范围。
  5. 为了帮助确保不作废,接种滴入后立即,老鼠应该被剥夺的水至少全身麻醉诱导前30分钟。另一个关键的动作是诱导scruffing小鼠麻醉诱导排尿前,轻轻地按较低的abdomEN。 2〜2.5%异氟醚是安全的诱导剂量为8-12星期岁的女CBA的小鼠,维持1.8-2%的异氟醚麻醉。
  6. 一旦实现了麻醉,小鼠被放置在他们的头插在异氟醚含氧连接到一个头锥仰卧位。按摩小腹疏散膀胱中的尿液。如果膀胱是比较空的,这个演习可能不会产生尿液。下腹及会阴部,用70%乙醇浸泡。
  7. 1无菌40cc的注射器没有针头是用来绘制所需的细菌接种。下一步,无菌导尿管无菌注射器放在。多余的管被切断导管,用一把剪刀,只有1-2毫米的管道,以便保持远端针尖。然后,注射器是挖掘和柱塞,用注射器直立删除所有气泡郁闷。抑菌润滑dollop果冻是喷到无菌培养皿或无菌注射器包装内。导管的尖端(附注射器)浸在果冻。在相同的实验测试,如果有多个细菌菌株正在小心,不要使用相同的果冻下降,润滑导管含有不同菌株。
  8. 使用立体显微镜的放大倍数(0.8倍到5倍变焦范围),麻醉鼠标阴蒂是在非主导的手轻轻抓住一双细齿镊,并提出头侧揭露深粉红色的尿道口(图1)。注射器(附加导管)是掌握在占主导地位的手,握铅笔和导管尖端在从事尿道口在45度角。阴蒂是捉襟见肘,沿长轴注射器有效的“加载”到导管尿道。这一演习是必要的,因为鼠标尿道是多余的。应该很容易滑动导管进入膀胱(集线器,图2),可以轻轻飞旋,以帮助导航尿道多余的褶皱。一旦是hubbed导管,注射器,可降低,直到它与鼠标长轴平行。非主导的手可以放下镊子,以帮助稳定的立场是用来为主导的导管和注射器慢慢注入接种(至少5秒钟)。如果流体导管周围流动注射过程中,无论是膀胱全部或导管的阴道(只是尾椎尿道)。注射液,应立即停止,并仔细检查导管的位置。导管在尿道,如果给定的鼠标不应该被包括在实验中。另一方面,可以重新定位和错位的阴道的导管,重新尝试注射。注射后,导管和注射器慢慢地从鼠​​标撤回。
  9. 为了减少早期接种后排尿,这可能撤离管理的细菌,从而导致变量的感染水平的可能性,一些研究人员在麻醉状态下保持30分钟后,经尿道前列腺电inoculation10的小鼠。手术后,小鼠恢复连续观测,以确认返回正常的呼吸方式和活动,在一个干净的变暖毯。一旦动物已经完全恢复抓取的能力,他们可能会返回到床上用品,含笼。

三。在受感染的组织测量的CFU

  1. 各种鼠标UTI的出版物,报告从6小时到一个星期或更长的时间接种后的培养结果。需要凭经验确定每个细菌/小鼠品系组合的最佳时间点。尿scruffing无菌培养皿中的鼠标,获得文化。收集的尿液应保持在任何时候都冰。多的尝试,取得了很多时间,尿可能是必要的,因为鼠标排尿频繁,小批量(30-100微升每无效),并强调依赖。
  2. 取得尿标本后,我们牺牲了使用异氟醚和颈椎脱位的小鼠。腹部是在无菌条件下打开。如果尿标本未成功获得早期,往往可以被吸出少量的尿液经膀胱壁使用30号针头和注射器。
  3. 一个或两个肾脏取出,剁碎成至少4件(每件作品应不少于50微克)无菌培养皿中,并放入锆珠/ PBS含离心管放在冰上。膀胱取出,剁碎到至少4件,并放置到不锈钢珠/ PBS离心管放在冰上。组织/磁珠/ PBS离心管置于搅拌机均质机的子弹和组织匀浆使用“8”的速度设定为一分钟。这是常见的一些组织碎片后仍然同质化。只要50-100微升液体匀浆可吸管,固体碎片不一定是一个问题。如果同质化的时间是增加一些样品,关键是做所有组织,以保持同质化的一致性。我们利用一颗子弹搅拌机均质机,因为它避免了交叉污染的可能性,是较快速处理个别样品使用一个标准的均质之一,并没有明显的热量匀浆的样品。
  4. 在微孔板应至少有两个或三个收集的尿液和组织匀浆稀释十倍。初步的实验中,它可能是审慎的做法,使至少7个10倍稀释。文化可达100微升尿,膀胱,和/或肾匀浆适当的琼脂。尿液标本可能是由于体积有限,可能有必要把其体积为100微升之前执行10倍稀释。如果这是必需的,初始稀释(前10倍稀释)将需要为细菌产量的最终计算的因素。我们宁可培养统一企业曙红亚甲蓝或麦康凯琼脂(在37 ° C孵育过夜),因为这些媒体是革兰氏阴性菌生物的选择性。 UPEC菌株麦康凯琼脂上生长,因为他们的能力发酵乳糖的中央脐,粉红色菌落。
  5. 培养过夜后,每块板的菌落计数。对于连续稀释的样本,含有50-100个菌落的平板稀释被认为是最准确的计数。 “返回”计算,每组织CFU,每毫克组织,或每毫升。

四。代表性的成果

图1
图1。起重钳(照片上方超越)头侧的阴蒂与暴露尿道口(暗粉色组织)

图2
图2。尿道插管。双歧阴蒂,可以看到正上方的导管。

图3
图3。膀胱CFU计数8周龄雌性CBA / J小鼠肾盂肾炎大肠杆菌经尿道感染后第2天大肠杆菌 。膀胱被同质化和麦康凯琼脂上连续稀释电镀CFU / ml的确定。钻石表明个别小鼠CFU /毫升,单杠表示位数CFU / ml为。

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Discussion

经尿道的细菌接种的小鼠泌尿道感染的感应,是一个历史悠久但技术要求高的程序11。红和侯德群最近发表的鼠标尿路感染13经尿道前列腺电技术的一个很好的回顾。在本文中,我们试图进一步说明这个实验方法的更细点。

初学者可练习他们的技术,由执行中线剖腹探查术,暴露膀胱,注入了墨汁在PBS(1%)的稀溶液中,观察膀胱蓝色着色。我们发现,一个完整的膀胱是最困难的问题来处理与尿道注射在小鼠之一,而且最好是通过水的匮乏和麻醉前排尿上文所述的战略预防。在我们的手中,<10%的小鼠表现出溢出的尿液在尿道注射。另一个潜在的绊脚石,是外伤性导尿,可导致尿道穿孔,膀胱接种剂量不当,甚至动物死亡。温和的技术和耐心是关键,在导管插入术;成功导尿不应该要求迫使导管进入膀胱。

最后,一​​些实验室可能不希望使用的子弹搅拌机均质机或其他“中等吞吐量”均质机,无论是由于样本数低或成本的考虑。一个折衷的解决办法是使用标准的匀浆,每个样品之​​间的清洁设备。最经济的解决方案是使用玻璃研磨机,我们成功地采用了之前切换到子弹搅拌机均质机。无论组织均匀化方法使用,细致,无菌的,一致的技术获得可重复性的结果至关重要。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

作者想雪莉谢和珍妮弗佩恩承认他们的专家技术援助。通过小儿泌尿外科学会和斯坦福大学的儿科研究基金的拨款,这项工作成为可能。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) E&K Scientific 640201
Caps for cryovial tubes, with ’O’ ring E&K Scientific 440011-N
Bullet Blender Next Advance BBX24
Zirconium Oxide Beads (0.5mm) Next Advance ZROB05
Stainless Steel Beads (1.6mm) Next Advance SSB16
Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) Next Advance SSB14B
CBA/J Mice, 8-12 week old female Jackson Laboratory 000656
Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) EMD Millipore EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)
LB agar
LB broth EMD Millipore 1.10285.0500
Isoflurane (Aerrane) Baxter Internationl Inc. NDC 10019-773-60
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-601
Eosin-methylene blue (EMB) agar powder Himedia Laboratories MM022-500G
MacConkey agar powder Difco Laboratories 212123
LB agar powder Difco Laboratories 244520
Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] BD Biosciences 427401
30 gauge needles, 1/2 inch BD Biosciences 305106
1 ml tuberculin Slip-Tip syringe BD Biosciences 309602
3 ml Luer-Lock syringe BD Biosciences 309585

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References

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Comments

3 Comments

  1. Very nice demonstration, Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 7, 2012 - 10:09 AM
  2. please make the whole video visible..Its very improtant for me..

    Reply
    Posted by: Kalpana R.
    February 6, 2014 - 2:24 AM
  3. this video is very important for me,please show the whole video

    Reply
    Posted by: azo p.
    June 22, 2014 - 11:20 PM

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