Zebrafish तीव्र गुर्दे चोट अध्ययन लार्वा के अंतःशिरा Microinjections

Biology
 

Summary

हम 2 दिन (DPF) के बाद तीव्र गुर्दे चोट (अकी) प्रेरित fetilization zebrafish लार्वा में aminoglycoside, gentamicin, microinjecting की एक तकनीक का वर्णन. हम भी पूरे माउंट immunohistochemistry के लिए एक विधि का वर्णन करने के लिए, प्लास्टिक एम्बेडिंग और zebrafish लार्वा सेक्शनिंग अकी मध्यस्थता क्षति कल्पना.

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Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079, doi:10.3791/2079 (2010).

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Abstract

इस वीडियो लेख में हम अकी के एक zebrafish मॉडल nephrotoxicant रूप gentamicin का उपयोग का वर्णन करता है. तकनीक 2 DPF zebrafish पर नसों microinjections के होते हैं. इस तकनीक को एक कुशल और तेजी से विधि zebrafish लार्वा के खून में घुलनशील पदार्थ देने का प्रतिनिधित्व करता है, प्रति घंटे 15-20 मछली के इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है. अकी पढ़ाई के अलावा, इस microinjection तकनीक भी एंजियोग्राफी जैसे प्रायोगिक अध्ययन के अन्य प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम कम गुर्दे समारोह के दृश्य उपाय करने के लिए आवश्यक उपकरणों से तकनीक की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इसके अलावा, हम भी निर्धारण, एक छोटी नली गुर्दे मार्कर, प्लास्टिक एम्बेडिंग और लार्वा zebrafish के सेक्शनिंग के साथ पूरे माउंट immunohistochemistry की प्रक्रिया प्रदर्शित करता है. हम दिखाना है zebrafish gentamicin साथ इंजेक्शन लार्वा अकी के साथ संगत morphological विशेषताओं पता चलता है कि: edema, प्रॉक्सिमल ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं में सेल polarity के नुकसान, और tubule के morphological विघटन.

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल के भाग (२००५ Hentschel एट अल.) के द्वारा और (Weinstein एट अल. 1995) मामूली संशोधनों के साथ प्रकाशित रिपोर्ट तरीकों पर आधारित है .

भाग 1: Microinjections

Microinjection के लिए अग्रिम में सेट अप

  • मछली 2 दिन पोस्ट निषेचन (DPF) में इंजेक्ट कर रहे हैं. इसलिए, वयस्क zebrafish 3 रातों पैदा कर रहे हैं से पहले एक योजना बनाई प्रयोग करने के लिए. भ्रूण लीजिए और 28.5 पर E3 पानी (5mm NaCl, 0.17mM KCL, 0.33mM 2 CaCl, 0.33mM 4 MgSO) के साथ एक पेट्री डिश में उन्हें जगह डिग्री सेल्सियस पहले दिन के अंत में पेट्री डिश और अलग भ्रूण से मृत भ्रूण इतनी दूर है कि वहाँ पेट्री डिश प्रति 80-100 भ्रूण हैं.
  • गिलास केशिका ट्यूब (लंबाई, आयुध डिपो 0.63 / 0.20 / आईडी मिलीमीटर (मिमी) आर-6 कस्टम ग्लास टयूबिंग Drummond वैज्ञानिक कंपनी, Broomall, 9-000-3000 पीए में 4 इंच) से एक इलेक्ट्रोड खींचने के साथ खींच सुई तैयार करो. टिप व्यास 10-20 सुक्ष्ममापी होना चाहिए. (Leica S6E) के एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, एक स्थायी मार्कर के साथ लगभग 10 सुई के साथ 1mm लाइनों आकर्षित, एक शासक की मदद के साथ, और मिट्टी रैंप पर एक बड़े पेट्री डिश में सुई की दुकान.
  • आग पॉलिश एक Bunsen बर्नर लौ में एक पतली दीवार borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब (मिमी 152, 1 / 0.75 / ओवर ड्राफ्ट आईडी मिमी TW100-6, विश्व परिशुद्धता उपकरण, Inc) के टिप के भीतरी व्यास तक: पकड़े विंदुक तैयार टिप 0.4-0.5 मिमी है. इस तरह के आयाम 2 DPF zebrafish लार्वा की जर्दी थैली की अच्छी पकड़ के लिए अनुमति देता है. कांच का एक टुकड़ा लंबे संदंश का उपयोग केशिका, और Bunsen बर्नर के साथ केशिका के साथ विपरीत टिप गर्मी, यह खड़ी 1-2 सेकंड के लिए प्रकाश नीले रंग की लौ के भीतर शंकु, सबसे भाग पर रखने के एक छोर पकड़ो, रोलिंग प्राप्त करने के लिए एक भी पिघला. दोहराएँ इस खुर्दबीन के नीचे कुछ समय तो केशिका एक मंच सुक्ष्ममापी (वार्ड 94 डब्ल्यू 9910) की जांच पर. यह एक महत्वपूर्ण कदम है, यह कुछ पकड़े pipettes आग पॉलिश और बाद में उचित आकार का चयन करें करने के लिए आवश्यक हो सकता है, जब आप लार्वा से छेड़छाड़ कर रहे हैं हो सकता है. यदि आप सावधान रहे हैं, एक धारण विंदुक एकाधिक microinjection सत्रों के लिए रहता है.
  • खनिज तेल के साथ मैनुअल Microsyringe (एमएमपी, विश्व प्रेसिजन उपकरण इंक, पम्प) निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों का का पालन, भरें. विंदुक धारक एक जोस्टिक (Narishige, MN-151) जोड़तोड़, एक लोहे की प्लेट (Narishige आईपी) एक चुंबकीय स्टैंड (Narishige, 151 MN) के साथ जुड़े में डाला जाता है.

Microinjection

  • इंजेक्शन मिश्रण के 20μl तैयार: 2.4μl (G8648 सिग्मा Aldrich, नमकीन घोल में 50mg/ml) gentamicin और 17.6μl 10-केडीए लूसिफ़ेर पीला (D1825 Invitrogen, dextran (नमकीन घोल में 1mg/ml) नियंत्रण मछली gentamicin नमकीन घोल के साथ प्रतिस्थापित किया गया है फ्लोरोसेंट dextran (कई अलग अलग रंग का इस्तेमाल किया जा सकता है) इंजेक्शन की सटीकता को सत्यापित करने और लार्वा कि nephrotoxicant के साथ अंतःक्षिप्त किया गया है का चयन करने के लिए पर्याप्त है.
  • 2ml खनिज तेल के साथ 2 30mm पेट्री डिश के तहत इंजेक्शन मिश्रण और मिश्रण नियंत्रण रखने के लिए, तैयार समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के.
  • 400 मिलीग्राम tricaine (एथिल-m-aminobenzoate methanesulfonate सिग्मा एक ५०४०) पाउडर 97.7 मिलीलीटर डीडी पानी, 2.1 मिलीलीटर 1M Tris (9 पीएच): चतनाशून्य करनेवाली औषधि तैयार. 7 पीएच को समायोजित करें. फ्रीजर में 4.2 मिलीलीटर की aliquots में इस शेयर समाधान, स्टोर. एक चतनाशून्य करनेवाली औषधि 4.2 मिलीलीटर 100 मिलीलीटर E3 पानी (1993 Westerfield) में tricaine शेयर समाधान पतला और कमरे के तापमान पर छोड़ के रूप में tricaine का उपयोग करने के लिए.

निम्नलिखित चरणों का एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं

  • मैन्युअली किसी भी ठीक संदंश के साथ शेष chorions हटाने और उन्हें tricaine के साथ एक पेट्री डिश में स्थानांतरित zebrafish कमरे के तापमान पर गरम anesthetize. Zebrafish microinjections शुरू करने से पहले कम से कम 15 मिनट tricaine को उजागर किया जाना चाहिए.
  • इंजेक्शन एक धार (VWR वैज्ञानिक 55411-050) का उपयोग कर सुई की नोक खोलें. बेवल बनाने और इस तरह के रूप में टिप में कटौती के बारे में 10 20μm व्यास के एक टिप खोलने प्राप्त के एक मामूली कोण पर ब्लेड पकड़ो.
  • सत्ता निर्वात, और microinjection तंत्र (विश्व परिशुद्धता उपकरणों, Inc, PV820 वायवीय picopump) की हवा की आपूर्ति चालू करें. सुई सुई micromanipulator झुकने और बेस (Word परिशुद्धता उपकरण, Inc, मॉडल M3301R, टीबी -1) पर घुड़सवार धारक में डालें.
  • सुई को भरने के लिए, खनिज तेल (फिशर रसायन, 0121-1) के साथ भरा 30mm पेट्री डिश में इंजेक्शन समाधान की एक छोटी बूंद (10μl) जगह. इतनी के रूप में मैनुअल micromanipulator मुड़ें समाधान के ड्रॉप में सुई की नोक डूब, "पकड़ / वेंट" "वेंट" ("वेंट" PV820 पर निर्वात equates) स्विच करने के लिए, और खींच द्वारा सुई भरने picopump सेट सुई की नोक के माध्यम से में हल. यह एक कुछ मिनट लग, यदि समाधान सुई में भी तेजी से हो जाता है,इसका मतलब है कि टिप के व्यास भी बड़ा है, और इंजेक्शन सही नहीं किया जाएगा. सुई के बाद भरा है, "पकड़" ("पकड़" PV820 पर इंजेक्षन equates) picopump निर्धारित किया है.
  • सुई जांचना, picopump "gated / समय" "gated, पैर पेडल प्रेस करने के लिए सुई का निर्वहन, और meniscus के लिए समय इसे लेता है (सेकंड) रिकॉर्ड करने के लिए एक अंकन से अगले (1 यात्रा स्विच सेट मिमी कुल दूरी). 3 बार दोहराएँ, औसत समय (सेकंड में) ले, और 30 (nanoliters मात्रा में (nl) 1 मिमी रेखीय दूरी करने के लिए इसी) द्वारा मूल्य विभाजित nl का एक समाधान देने के लिए आवश्यक मिलीसेकेंडों की संख्या निर्धारित करने के लिए. इस संख्या के लिए सीमा अवधि घुंडी समायोजित, और 'समय पर' के लिए "/ gated समय" स्विच को स्थानांतरित. अब picopump समाधान का एक 1nl पल्स देने के लिए सेट कर दिया जाता है.
  • खनिज तेल पकवान और खुर्दबीन के नीचे लार्वा के साथ पेट्री डिश की स्थिति निकालें. पेट्री डिश और ध्यान के केंद्र में मछली समूह.
  • Microinjector के विपरीत तरफ पुस्तिका microsyringe पंप में पकड़े विंदुक (एमएमपी, विश्व सटीक उपकरणों) प्लेस, पेट्री डिश के लिए अपने टिप अग्रिम, और माइक्रोस्कोप के ध्यान के विमान में. यह एक काफी उथले कोण के साथ बेंड, ताकि पकड़े पिपेट की बहुत टिप पेट्री डिश के नीचे छू रहा है और क्षैतिज के करीब है. व्यवस्था में किसी भी हवाई बुलबुले नहीं है, जो प्रतिक्रिया समय धीमा और एमएमपी की शुद्धता कम होगा सुनिश्चित करें.
  • खुर्दबीन पर एक उच्च बढ़ाई बदलें और हैंडल (टेड पेला 113) के साथ एक अति सूक्ष्म बरौनी उपयोग की जर्दी के साथ पकड़े विंदुक बहुत करीब लार्वा मछली पृष्ठीय पक्ष नीचे की स्थिति है. पकड़े पिपेट में वामावर्त सुक्ष्ममापी ड्राइव पुस्तिका microsyringe पंप नियंत्रित बदल कर जर्दी चूसने से लार्वा मछली पकड़ो. ख्याल रखना नहीं सुक्ष्ममापी बहुत दूर की बारी है, के रूप में जर्दी अगर पकड़े पिपेट में भी गहरी खींच फट कर सकते हैं. गठन आम कार्डिनल नस, जो जर्दी से अधिक, periderm बस के नीचे झूठ और बहुत ही उच्च रक्त के प्रवाह की साइट है पर ध्यान दें. इंजेक्शन तंत्र के micromanipulator के साथ, विकासशील आम कार्डिनल नस में सुई गाइड. यह आमतौर पर सुई प्रविष्टि के बाद वापस एक सा पुल के लिए आवश्यक है, के रूप में आम कार्डिनल नस बहुत सतही है. पैर पेडल दबाकर समाधान की 1nl इंजेक्षन, तो पकड़े विंदुक से लार्वा जारी है और यह भ्रूण पानी के लिए लौटने. यह एक महत्वपूर्ण कदम है, विशेष रूप से पहली बार है, क्योंकि यह मछली स्थिति और चूषण और रिग के दबाव को नियंत्रित करने में एक अभ्यास के एक निश्चित राशि की आवश्यकता है. यदि भ्रूण की जर्दी ठीक से पकड़े विंदुक के साथ आयोजित किया जाता है, यह रोल नहीं होगा के रूप में सुई में प्रवेश करती है.
  • Microinjection की सफलता को सत्यापित करने के लिए, एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे zebrafish के दिल में लूसिफ़ेर पीले dextran की उपस्थिति की निगरानी. लूसिफ़ेर पीले संचार प्रणाली में dissipating से पहले लगभग 20 मिनट के लिए दिल में दिखाई देता रहता है यदि nephrotoxic समाधान सही ढंग से इंजेक्शन है, इंजेक्शन के 2 घंटे के भीतर आप बहुत कम लूसिफ़ेर पीले dextran इंजेक्शन के स्थल पर शेष देखेंगे. यदि समाधान की जर्दी थैली, लूसिफ़ेर पीले dextran की एक जगह में है इंजेक्शन इंजेक्शन के स्थल पर रहेगा. (छवि 1). E3 के माध्यम से मछली लौटें.
  • दो दिन के बाद इंजेक्शन, लार्वा कम गुर्दे समारोह का एक परिणाम (छवि 2) के रूप में pericardial शोफ विकसित.

भाग 2: फिक्सेशन और ना साथ immunofluorescence + K + / ATPase एंटीबॉडी (α-6f)

  • DPF 4 में, 10 और 15 4ml कांच की शीशियों में लार्वा zebrafish (Weathon, २,२५,०१२) के बीच रखा और उन्हें 1ml सेंध आरटी में 4 घंटे के लिए (80% MeOH DMSO के 20%) में ठीक है.
  • एक वर्गीकृत MeOH / पीबीटी (0.5% Tween20 साथ पीबीएस) श्रृंखला, 50:50 75:25, 25:75, 100% पीबीटी में भ्रूण rehydrate, समाधान बाहर pipetting और उसी शीशी के लिए नए समाधान जोड़ने (1ml प्रति समाधान में शीशी), प्रत्येक समाधान में 20 मिनट. लार्वा हवा उजागर नहीं किया जाना चाहिए, एक छोटे से लार्वा को कवर जब समाधान बदलते समाधान छोड़ दें.
  • पीबीटी निकालें और 3 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान (1% DMSO के साथ Pbs, 0.5% Tween20, 10% सामान्य बकरी सीरम) के साथ 1ml डिग्री सेल्सियस nutator पर 4 में जगह.
  • एक 2ml microfuge में लार्वा स्थानांतरण. सीरम अवरुद्ध निकालें और ऊष्मायन समाधान में 300μl प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जगह (पीबीएस साथ 1% DMSO, 0.5% Tween20, 2% सामान्य बकरी सीरम) nutator पर रात में 4 ° C. हम 1:25 कमजोर पड़ने पर एक मोनोक्लोनल ना + K / + ATPase एंटीबॉडी (α-6f, सतह पर तैरनेवाला, विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, आयोवा) का उपयोग करें
  • प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और आरटी पर ऊष्मायन समाधान के साथ 3 एक्स 30 मिनट धो लो.
  • माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी cy3 विरोधी माउस, जैक्सन Immunoresearch प्रयोगशालाओं, इंक 155-165-003) के साथ सेते ऊष्मायन समाधान पर 2 घंटे के लिए 1:500 पतलाआरटी.
  • पीबीटी के साथ 3 एक्स 30 मिनट धो लें.

भाग 3: जेबी 4 के साथ प्लास्टिक एम्बेडिंग

  • , कदम प्रति 10 मिनट वर्गीकृत इथेनॉल (, 75%, 95% 100% 2 एक्स 50%) श्रृंखला के माध्यम से ऊतकों निर्जलीकरण.
  • जेबी-4 एम्बेडिंग समाधान के 25 मिलीलीटर (Polysciences 0226A) और उत्प्रेरक के 0.24g (02,618 Polysciences): घुसपैठ समाधान तैयार है. यह एक समय लेता है के लिए उत्प्रेरक, के बारे में 20-30 मिनट भंग करने के लिए. समाधान 4 में संग्रहीत किया जा सकता ° C 1 महीने के लिए.
  • 100% इथेनॉल छानना और प्लास्टिक की घुसपैठ समाधान के साथ जगह. शीशियों एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर 4 डिग्री सेल्सियस प्लेस और घुसपैठ लार्वा कांच की शीशी के नीचे सिंक करने के लिए जब तक आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं. यह प्रक्रिया आम तौर पर के बारे में 30 मिनट लगते हैं.
  • एक विदारक खुर्दबीन के नीचे जगह प्लास्टिक मोल्डिंग कप ट्रे (Polysciences, इंक 16643A): प्रोटोकॉल एम्बेड. लार्वा स्थानांतरण, घुसपैठ समाधान के लिए कवर के साथ कप में. प्लास्टिक एम्बेडिंग मीडिया के एक छोटे से प्लास्टिक ट्यूब में तैयार है. हम आम तौर पर एक समय में 4-5 मछली एम्बेड करते हैं, प्रत्येक कप के लिए एक मछली. घुसपैठ समाधान के प्रत्येक मिलीलीटर के लिए जेबी 4 एम्बेडिंग समाधान "बी" (Polysciences इंक 0226B) का 35 μl जोड़ने एम्बेड प्लास्टिक के 5-6 मिलीलीटर (प्रत्येक कप के लिए समाधान एम्बेड के 1.2 मिलीलीटर) तैयार है. घुसपैठ समाधान के प्रत्येक मिलीलीटर के लिए जेबी 4 एम्बेडिंग समाधान "बी" (Polysciences इंक 0226B) का 35 μl जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स, एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक कई बार के साथ और नीचे pipetting. यह महत्वपूर्ण है क्योंकि मिश्रित नहीं अगर अच्छी तरह से जेबी 4 ठीक से नहीं polymerize जाएगा. एम्बेडिंग प्लास्टिक के 5ml के बाद तैयार किया गया है, एक पाश्चर विंदुक के साथ नमूने के आसपास से घुसपैठ प्लास्टिक को हटा दें. प्लास्टिक एम्बेड के साथ कप भरें. प्लास्टिक कप के बाहर रसना, ब्लॉक नमूना धारक के अच्छे लगाव को यह सुनिश्चित करना चाहिए. Zebrafish गुर्दे tubules का पता लगाने के लिए, अनुप्रस्थ वर्गों सबसे अच्छा कर रहे हैं. इस प्रयोजन के लिए, मछली खड़ी एम्बेडेड रहे हैं, नीचे सिर. संभाल या ठीक संदंश के साथ एक बरौनी के सहायता के साथ, समय समय पर मछली खड़ी स्थिति है, जब तक प्लास्टिक काफी मुश्किल है कि वे अपनी स्थिति से कदम नहीं है. यह लगभग 20-30 मिनट लगते हैं. फिर, कप पर EBH-2 ब्लॉक धारक (Polysciences इंक 15899) जगह और 4 में ट्रे डिग्री सेल्सियस रातोरात छोड़. पूरा polymerization, जब आप बाहर बर्फ cubes की तरह ब्लॉक पॉप कर सकते हैं.
  • कई लार्वा के लिए वैकल्पिक एम्बेडिंग प्रोटोकॉल: पूरा जेबी-4 के साथ आधे रास्ते molds भरें और यह polymerize करने के लिए अनुमति देते हैं. 15 मिमी वर्ग molds के लिए हम 700μl पर मात्रा जेबी-4 का उपयोग करने के लिए मोल्ड भरने के आधे रास्ते. अगले, पूर्व polymerized आधा भरा molds hardener के साथ जेबी-4 लथपथ लार्वा जोड़ें. ओरिएंट सिर आचारण के लंबे पक्ष की ओर इशारा और लार्वा संरेखित साथ लार्वा आंखों लाइन अप (आप एक पंक्ति में एक ही सांचे में 10 मछली रख सकते हैं) तो. ब्लॉक polymerized के बाद आप ब्लॉक के किनारों में कटौती, ताकि पक्ष चाकू का सामना करना पड़ रहा है यह बारी कर सकते हैं और यह एक प्लास्टिक "चक" है कि सूक्ष्म तक्षणी में फिट बैठता है superglue. इस विधि के साथ आप एक ही ब्लॉक, प्लास्टिक में केंद्रित है, और पार वर्गों के लिए तैयार में लार्वा की एक बड़ी संख्या की स्थिति कर सकते हैं. केयर चाकू ब्लॉक orienting लिया जाना इतना है कि प्रत्येक मछली के बराबर वर्गों एक एकल खंड में लिया जाता है. यह जबकि आँखों के माध्यम से सेक्शनिंग पूरा किया जा सकता है: यानी ब्लॉक पूरबी इतना है कि आँखों के बराबर वर्गों प्रत्येक मछली के लिए लिया जाता है. अंतिम परिणाम यह है कि आप एक एकल खुर्दबीन स्लाइड पर कई मछली concomitantly का विश्लेषण कर सकते हैं.

भाग 4: सेक्शनिंग

  • सूक्ष्म तक्षणी के चक धारक (हम एक Shandon चालाकी थर्मो इलेक्ट्रो निगम सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग करें) में नमूना सेट
  • स्लाइड 45 से गरम सेट ° सी.
  • एक बीकर में डि पानी डालो और जगह यह सूक्ष्म तक्षणी के करीब
  • सेक्शनिंग से पहले, सुनिश्चित करें कि ब्लॉक जैसे उन्मुख है मछली का सही अनुप्रस्थ वर्गों प्राप्त हो. अभिविन्यास सिर समायोजन लीवर नमूना सिर की स्थिति को सक्षम करने से चाकू को सही घुमाया जा सकता है. मछली के सिर के माध्यम से मोटी वर्गों में कटौती से शुरू करो. जबकि आँखों के माध्यम से सेक्शनिंग ब्लॉक पूरबी इतना है कि आँखों के बराबर वर्गों प्रत्येक मछली के लिए लिया जाता है. जब छाती पर का कवच पंख वर्गों में प्रकट होते हैं, कि जब pronephric tubules शुरू. इस बिंदु से, ब्लॉक से 32 4 उम वर्गों के बारे में काटा.
  • संदंश के साथ वर्गों को ले लीजिए और उन्हें पानी के साथ बीकर में ड्रॉप संदंश के साथ पानी छूने के बिना. खंड के रूप में जल्द ही विस्तार के रूप में यह पानी की सतह हिट, अब आप इसे किसी स्लाइड पर जमा कर सकते हैं. पानी में एक 45 डिग्री कोण पर स्लाइड और संभाल के साथ एक बरौनी के मदद से अनुभाग सम्मिलित दृष्टिकोण, केवल अनुभाग की सीमाओं को छूने.
  • एक पूरी तरह से सूखे जब तक गर्म स्लाइड पर स्लाइड सेते हैं.
  • छवि epifluorescent या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग वर्गों.

भाग 5: प्रतिनिधि रिसults

जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, इंजेक्शन मछली थोड़ा फ्लोरोसेंट dextran दिल और संचार प्रणाली में दिखाई (इस लूसिफ़ेर पीला मामले में) के साथ संख्या 1 में जैसे दिखाई देते हैं. यदि इंजेक्शन भी गहरी है, इंजेक्शन सामग्री देखा जा जर्दी थैली में ध्यान केंद्रित कर सकते हैं, या दिल अत्यधिक रक्तस्राव के कारण पंचर किया जा सकता है है. यदि पकड़े विंदुक सही ढंग से किया जाता है, मछली रोल या कदम नहीं जब इंजेक्शन, और यह एक और अधिक सटीक इंजेक्शन की अनुमति देगा. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है एमएमपी में किसी भी हवाई बुलबुले नहीं है, जो प्रतिक्रिया समय धीमा और प्रणाली की शुद्धता कम होगा सुनिश्चित करें. आम तौर पर, gentamicin nephrotoxicity का एक परिणाम के रूप में, इंजेक्शन मछली का 80% pericardial के edema (छवि 2) विकसित. हम एक phenotype आधारित वर्गीकरण प्रणाली, जो मध्यम edema के साथ मछली में स्पष्ट pericardial शोफ दिखाने, लेकिन नहीं दूसरों phenotypes नमूदार, जबकि गंभीर edematous मछली pericardial और ट्रंक के edema दिखाने के साथ मामूली अक्ष वक्रता उदारवादी का उपयोग करें. ना के खिलाफ एक गुर्दे की छोटी नली एंटीबॉडी का उपयोग + K + / ATPase (α-6f) हम अनुप्रस्थ वर्गों में क्षतिग्रस्त tubules सेल और क्षतिग्रस्त tubules में ट्यूबलर व्यवधान polarity के एक स्पष्ट के रूप में नियंत्रण (छवि 3) की तुलना में नुकसान के साथ, कल्पना कर सकते हैं. यह पैटर्न कई अनुप्रस्थ वर्गों के माध्यम से संगत है. आदेश में गुर्दे tubules सही अनुप्रस्थ वर्गों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है एम्बेडिंग के दौरान मछली को सही ढंग से स्थिति. जब वर्गों की तुलना, छाती पर का कवच पंख और प्रॉक्सिमल जटिल tubules संरचनात्मक मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 Nephrotoxin microinjection. (ए) एक 10kDa dextran के सफल इंजेक्शन लूसिफ़ेर पीले करने के लिए संयुग्मित आम कार्डिनल नस, सफेद तीर में बेहोश अभिव्यक्ति के साथ. (बी) गलत इंजेक्शन, लूसिफ़ेर पीला है कि संचार प्रणाली, लाल तीर में नहीं फैलने करता संयुग्मित 10kDa dextran की एक जमा में जिसके परिणामस्वरूप.

चित्रा 2
चित्रा 2 की मध्यस्थता के edema Gentamicin. (ए) नियंत्रण लार्वा zebrafish इंजेक्शन. Gentamicin (ख) मध्यम या (सी) गंभीर edema के साथ लार्वा zebrafish इंजेक्शन. सभी लार्वा छोड़ दिया करने के लिए पूर्वकाल के साथ 4 DPF पर हैं और पृष्ठीय ऊपर है. काले तीर बी और सी में pericardial शोफ को इंगित

चित्रा 3
चित्रा 3 अकी immunohistochemistry. ना + K / + ATPase 48 घंटे के पद नियंत्रण में gentamicin (4 DPF लार्वा) इंजेक्शन (ए, बी) और (सी, डी) gentamicin इंजेक्शन लार्वा के लिए α-6f एंटीबॉडी धुंधला हो जाना . ए, सी 20X बढ़ाई और बी और डी के एक और सी basolateral polarity और छोटी नली व्यवधान, डी में सफेद तीर के नोट नुकसान में सही tubules के 3X डिजिटल magnifications के रूप में बी की तुलना में कर रहे हैं

Discussion

इस वीडियो लेख में हम एक अकी मॉडल के लिए एक अंतःशिरा microinjection gentamicin मध्यस्थता zebrafish लार्वा में प्रॉक्सिमल ट्यूबलर नुकसान बनाकर, तकनीक का प्रदर्शन किया. Pericardial और / या सकल edema के गठन में इस नुकसान का परिणाम है, एक पानी के संतुलन को विनियमित करने में असमर्थता को दर्शाती है. हम भी एक एंटीबॉडी है कि विभेदित गुर्दे tubules (मजूमदार एट अल 2000.) के निशान के साथ एक immunohistochemistry प्रयोग का वर्णन, सेल polarity के नुकसान और क्षतिग्रस्त गुर्दे में प्रॉक्सिमल tubule के व्यवधान दिखा. अंतःशिरा microinjections zebrafish लार्वा के खून में एक घुलनशील पदार्थ देने के लिए एक कारगर तरीका का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस तकनीक पदार्थों की एक किस्म की शुरूआत के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है और एक फ्लोरोसेंट मार्कर वर्दी इंजेक्शन की सहायता के साथ अनुरूप परिणाम के लिए अनुमति देता है पर कई बार दोहराया जा सकता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य (NIH) R01DK069403 और P30DK079307 अनुदान के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α6F mouse monoclonal Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2 Polysciences, Inc. 15899
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments, Inc. TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing Drummond Scientific 9-000-3000
Catalyst Powder Polysciences, Inc. 02618
Cy3 Jackson ImmunoResearch 155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable Molecular Probes, Life Technologies D1825
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Eyelash Ted Pella, Inc. 113
Gentamicin sulfate Sigma-Aldrich G8648
Glass vials 4ml Weathon 225012
Iron plate Narishige International IP
JB-4 Embedding Solution A Polysciences, Inc. 0226A
JB-4 Embedding Solution B Polysciences, Inc. 0226B
Joystick micromanipulator Narishige International MN 151
Magnetic stand Narishige International MN-151
Manual microsyringe pump World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus World Precision Instruments, Inc. PV820
Micromanipulator World Precision Instruments, Inc. M3301R
Microtome Thermo Fisher Scientific, Inc. Shandon Finesse
Mineral oil, light Fisher Scientific 0121-1
Pipette puller Kopf Instruments 720
Plastic molding cup tray Polysciences, Inc. 16643A
Razor blade VWR international 55411-050
Slide warmer Labline Instruments
Stage micrometer WARD’s Natural Science 94 W 9910
Tilting base World Precision Instruments, Inc. TB 1
Tricaine powder Sigma-Aldrich A-5040
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Microscope Leica Microsystems S6F Dissecting microscope
Microscope Leica Microsystems M205FA Fluorescent microscope

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References

  1. Hentschel, D. M., Park, K. M. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, (5), F923-F929 (2005).
  2. Majumdar, A., Lun, K. Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia. Development. 127, (10), 2089-2098 (2000).
  3. Weinstein, B. M., Stemple, D. L. Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish. Nat Med. 1, (11), 1143-1147 (1995).
  4. Westerfield, M. The Zebrafish Book. University Oregon Press. Oregon. (1993).

Comments

3 Comments

  1. I would like to ask which kind of knife is used for sectioning. I have problems getting good sections and wonder if the knife is the reasson. Thank you in advance, Eric

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    Posted by: Anonymous
    August 27, 2010 - 6:02 AM
  2. We buy our knives from DKK (Delaware Diamond Knife), the knives we have are:
    Disposable tungsten carbide knives and a 3 knife package costs $5²5
    There is no cat number in their website, however, DKK told us the Cat. Number: NEWDISP3PK

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 2, 2010 - 10:34 AM
  3. We use standard glass knives and a Leica RM²165 microtome for cutting JB-4 plastic blocks. To make the knives you need a glass knife maker, a Leica EM KMR3 or equivalent knife maker. These are the same type of knife used in EM facilities to make thick sections from Epon embedded samples. The knife maker can be $6-10K so if you want to go this route it might be easiest to buy some glass bars and arrange to use a knife maker in a core EM facility. EM supply companies sell useful plastic boxes for storing 10-15 knives after you make them.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 2, 2010 - 11:25 AM

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