שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx. J. Vis. Exp. (6), e244, doi:10.3791/244 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אנו מדגימים את הטכניקות הבסיסיות הקלטה תיקון presynaptic מהדק את גביע של הלד, מסוף יונקים העצבים המרכזית מערכת העצבים. הקלטות חשמל ממסוף presynaptic לאפשר מדידה של פוטנציאל פעולה, ערוץ זרמי סידן, איחוי שלפוחית ​​(exocytosis) ספיגת הקרום הבאים (אנדוציטוזה). שילוב של שלפוחית ​​המכילה הנוירוטרנסמיטר גורם קרום שלפוחית ​​שיתווספו קרום התא של גביע. גידול זה בהיקף של קרום התא הוא, כפי שהיא נמדדת עלייה קיבול. הירידה עוקבת קיבול מציין אנדוציטוזה, תהליך של ספיגת קרום או הסרה של קרום גביע. אנדוציטוזה, נחוצה כדי לשמור על המבנה של גביע והוא נחוץ גם כדי ליצור שלפוחית ​​כי יתמלאו הנוירוטרנסמיטר לאירועים exocytosis בעתיד. הקלטות קיבול על גביע של הלד אפשרו ישירות ובמהירות למדוד לשחרר שלפוחי ו אנדוציטוזה מאוחרות מסוף יונקים עצב במערכת העצבים המרכזית. בנוסף, הפעילות postsynaptic המקביל ניתן למדוד בו זמנית באמצעות הקלטות לזווג. לכן תמונה מלאה של הפעילות החשמלית presynaptic ו postsynaptic בסינפסה מערכת העצבים המרכזית הוא בר השגה באמצעות הכנה. כאן, שיטות להכנת פרוסה, תכונות מורפולוגיות לזיהוי calyces, בטכניקות נערך תיקון בסיסי clamping, ודוגמאות של הקלטות קיבול למדוד exocytosis ו אנדוציטוזה מוצגים.

Protocol

הצמד תיקון התקנה:

אופטיקה: אופטיקה חשובים מאוד למצוא תא טובה, כדי לקבוע את המיקום של זה.

נסה להשיג תמונה ברורה של התאים: קצוות חדים, רך למראה תא.

סרוק את שדה שלם כדי לחפש טוב התאים העיקריים MNTB עם גביע המצורפת. סיבוב צלחת לחפש calyces מזוויות שונות. בהתחלה זה בסדר להתאמן על מסוף, בלון בצורת.

פיק התא על פני השטח של פרוסה או שכבה 2 nd התא. היעד השלישי ראשון 1 / 3 תאים עם פיפטה

זיהוי Calyxes: חפש קרום כפול (ראה איור 1), לסובב את המנה פרוסה לראות אותו מזוויות שונות כדי לעזור לאשר כי מדובר גביע.

איור 1
איור 1

עומק Calyx: Calyx צריך להיות על פני השטח או קרוב לפני השטח ככל האפשר.

שטח זמין עבור תיקון: השתמש עדין להתמקד על כפתור מיקרוסקופ כדי לקבוע כיצד "רחב / עמוק" גביע הוא. לדוגמה, ~ 10% סיבוב מלא על המוקד את הקנס ייתן לך יותר שטח מספיק על גבי טלאי.

איטום על גבי תא presynaptic: כדי להגיע אל תא מצורף, לחפש עיוות "קטן" על פני התא עקב הלחץ pos (~ 0.15psi) ב פיפטה, להשתמש מניפולטור פיפטה לרוץ למעלה, למטה ולרוחב, ואפילו את פני השטח של הטרמינל presyn לקבל דפורמציה טוב, ואז לשחרר לחץ להחיל יניקה, אם על פי הצורך.

PULSE, תוכנית רכישת נתונים:

צריך להגדיל את גודל המאגר לפני השימוש הראשון, נדרש בכל פעם על ידי יכולת דגימה.

צריך לטעון מאקרו שונה בכל פעם.

צומת נוזלי אפשריים: הקלטה פתרון Presyn הוא-11mV (11mV שלילי).

Presyn: Cslow = ~ 15 pF

Rs comp עבור presyn: 10 μsec, 65% (פיצויים יותר עשוי אפשרי W / החוצה תנודות)

לפני קיבול הקלטה: הרפיה הבדיקה הנוכחית (10 mV, 10 msec לקפוץ) כדי לראות אם היא הרפיה monoexponential, כלומר, אם המונח presyn יכול להיות המודל של תא יחיד.

מסננים: הגדר בבית kHz 30 ו - 10 kHz (בסל מסנן 1 ו -2 בהתאמה) במהלך המדידה רגיעה, כדי לוודא מרכיב מהיר לא פיספס.

במהלך ההקלטות מיני, המשמש Xinsheng 10 קילוהרץ ו 5kHz. LGW שאל אותי להשתמש רק להגדיר מסנן 1 ב 30 קילוהרץ כדי לוודא שאנחנו יכולים למדוד עליית פעמי של מיני.

שמות קבצים: 7 ספרות 000mmxx, כאשר mm הוא החודש (או חודש, שנה) ו xx הוא מספר התא.

ניקוי קווי הפתרון: קווים לנקות בסוף הניסוי עם 20 מ"ל של HCl 0.1 M ואחריו 200 מ"ל ddH2O.

פתרונות חיצוניים הם ממוחזרים, מהירות המשאבה הוא 20-30 סל"ד.

(פתרון החוזרים קאמרית אמבטיה זורם חזרה לתוך צילינדר המדורג).

הגדרת 3 קווי היוצא על מנת להבטיח יניקה מספיק.

פיפטה פתרון הקלטה Presynaptic: ~ 310 מילי Osmolar

הפתרון צריך להיות Presyn ~ 310 mOsm למנוע R-גישה להגדיל במהלך הניסוי.

פתרון Presyn פיפטה שונה postsyn פיפטה פתרון (Presyn יש ATP GTP & עבור לשעבר.).

TTX-TEA פתרון (לבודד Ca זרמים):

  • נסו ליישם לאחר איטום, או אפילו תיקון, על התא, כמו תה בלוקים הפתרון K-ערוצים depolarizes התא. זה לא טוב עבור התא. מאותה סיבה, זה לא יהיה ניתן לעשות שימוש חוזר פרוסה אחרי TTX מוחל.
  • השווה את התגובה הראשונה והאחרונה של התא, או פרוסה כדי לבדוק השפעה כלשהי של שלילת קוטביות ממושכת.
  • TTX משמש ב 1 מיקרומטר במקום 0.5 מיקרומטר ולכן ההשפעה היא מהירה יותר. צריך לחכות פחות זמן לאחר שינוי פתרונות.

חיתוך Slices

Vibratome הגדרות:

  • 70Hz רעידות לרוחב
  • Amplitude: 1.0 מ"מ
  • קדימה במהירות 0.01-0.02 מ"מ / sec בזמן חיתוך פרוסות עם גביע, 0.1 אחרת עובי: 180 מיקרומטר (~ 150מיקרומטר בבעלי חיים מבוגרים)

Slices לדגור על 37 º C למשך שעה 1 (כולל זמן חיתוך), כלומר, להשאיר באמבטיה 15-20 דקות לאחר חיתוך.

Pipettes:

Presyn: 3.5-4.5 MΩ בהתחלה, 3.0-3.5 MΩ כאשר מרגישים בטוחים יותר

שימוש ידני חולץ להגדיר הגדרות. השתמש בתכונה עיכוב בגלל זכוכית עבה (עיכובים בעבודה 200 או 1)

זכוכית סוג: בורוסיליקט, תקן הקיר, אין נימה

קוטר חיצוני: 2.0 מ"מ

קוטר פנימי 1.16 מ"מ

אורך: 7.5 ס"מ

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics