膜片钳从花萼电容录音方法

Biology

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Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx. J. Vis. Exp. (6), e244, doi:10.3791/244 (2007).

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Abstract

我们展示举行,哺乳动物的中枢神经系统的神经终端的花萼突触前膜片钳记录的基本技巧。从突触前终端电器录音允许的动作电位,钙通道电流,囊泡融合(胞吐)和随后的膜摄取(内吞作用)的测量。含有神经递质囊泡的融合导致囊膜被添加到细胞膜的花萼。在细胞膜量的增加是增加电容测量。随后的电容减少,表明细胞内吞,膜吸收或去除花萼膜的过程。内吞作用,是需要保持的花萼结构和形式将与未来的胞吐事件充满神经递质的囊泡,它也是必要的。萼举行的电容录音,可以直接和快速测量水泡在哺乳动物中枢神经系统的神经末端的释放和随后的内吞作用。此外,相应的突触后活动可同时测量通过使用配对录音。因此,一个完整的画面,在中枢神经系统的突触前和突触后的电活动是可以实现的,使用该制剂的。这里介绍的方法,片制备,鉴定举行,基本的膜片钳技术盏形态特征,和电容录音来衡量胞外分泌和内吞作用的例子。

Protocol

膜片钳安装:

光学:光学找到一个良好的细胞,并确立它的地位是非常重要的。

尝试获取细胞的清晰的图像:锋利的边缘,软前瞻性细胞。

扫描整个领域寻找良好MNTB附有萼主要细胞。旋转盘,从不同的角度去寻找盏。首先,它是确定实践气球形的终端。

接片表面的细胞,或在第二届细胞层。目标细胞的前1 / 3 吸管

识别Calyxes:寻找一个双膜(见图1),旋转片盘,从不同的角度看到它,以帮助确认这是一个花萼。

图1
图1

花萼深度:花萼应在表面上,或尽可能接近地表。

表面修补:用细焦点显微镜旋钮,以确定如何“宽/深”的花萼。例如,一个优良的重点全面转向〜10%会给你足够的表面积修补上。

密封到突触前细胞:为了得到细胞贴附 ,寻找一个“小”由于POS压力移液器(〜0.15psi)在细胞表面的变形,使用机械臂运行吸管向上,向下和跨,甚至进入presyn终端的表面,以获得良好的变形,然后释放压力和运用吸,如果必要的。

脉冲,数据采集程序:

第一次使用前需要增加缓冲区的大小,每当采样能力的要求。

需要加载修改宏每次。

液体接界电势:Presyn 11mV(负11mV)的录音解决方案。

Presyn:Cslow =〜15 PF

RS比赛presyn:10微秒,65%(更多的补偿可能的W /出振荡)

录制前电容:测试电流松弛(10毫伏,跳10毫秒),看看是否松弛是单指数,即pre​​syn长期是否可以通过单一的车厢为蓝本。

过滤器:在30千赫和10千赫(Bessel滤波器1和2)测量时放松,以确保快速的组件是不是错过了设置。

迷你录音期间,新生使用10 kHz和5kHz的。友好社问我,在30 kHz的使用,以确保我们可以测量小型上升时间仅过滤器1套。

文件的命名:7位数000mmxx,其中mm是月份(或年份和月份)和XX细胞数量。

清洗液线:用20毫升0.1 M的盐酸试验结束时清洗线其次是200毫升ddH2O。

外部解决方案的回收 ,泵的转速为20-30转。

(从沐浴室返回的解决方案重新流回量筒)。

设置3传出线路,以确保足够的吸力。

移液器突触前录音解决方案:〜310毫 Osmolar

Presyn解决方案的需求〜310 mOsm,以防止在实验过程中的R -访问增加。

Presyn液是从postsyn移液器解决方案(Presyn有ATP和GTP的前。)不同的。

TTX茶解决方案(隔离钙电流):

  • 尝试密封后,甚至修补申请,到细胞,如茶溶液中K座通道和去极化的细胞。这不是良好的细胞。出于同样的原因,它可能不会被TTX的应用后,可以重用切片。
  • 比较的第一个和最后一个反应的细胞,或切片检查,任何长时间的去极化的影响。
  • TTX的是使用1μM,而不是0.5微米,所以效果更快。需要等待更短的时间内改变后的解决方案。

切割片

Vibratome设置:

  • 70Hz的横向振动
  • 振幅:1.0毫米
  • 前进速度0.01-0.02毫米/秒,同时降低与花萼片,另有0.1厚度:180微米(〜150在老年动物微米)

片孵育37 º C为1小时(包括切削时间),即在15-20分钟,浴后切割离开。

移液器:

Presyn:3.5-4.5MΩ首先,3.0-3.5MΩ时感觉更自信

使用拉马手动设置设置。使用延迟的功能,因为玻璃厚(工作延误的200或1)

玻璃类型:高硼硅,标准的墙上,没有灯丝

外径:2.0毫米

内径1.16毫米

长度:7.5厘米

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