がくからパッチクランプの静電容量の録音のための方法

Biology

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Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx. J. Vis. Exp. (6), e244, doi:10.3791/244 (2007).

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Abstract

私たちは、開催のがくにおけるシナプス前のパッチクランプ記録、哺乳類の中枢神経系の神経終末のための基本的な手法を示します。シナプス前終末からの電気の録音は、活動電位、カルシウムチャネル電流、小胞融合(エキソサイトーシス)と、その後の膜の取り込み(エンドサイトーシス)の測定を可能にする。神経伝達物質を含む小胞の融合は、小胞膜ががくの細胞膜に追加されます。細胞膜の量のこの増加は、容量の増加として測定されます。静電容量で、その後の減少は、エンドサイトーシス、萼の膜から細胞膜への取り込みや削除のプロセスを示している。エンドサイトーシスは、がくの構造を維持するために必要であり、それはまた将来のエキソサイトーシスのイベントのための神経伝達物質で満たされる小胞を形成する必要がある。ハンドヘルドのがくでの容量の記録により、直接、急速に小胞放出と哺乳類の中枢神経系の神経終末の後続のエンドサイトーシスを測定するために作られている。さらに、対応する後シナプス活性が同時にペアの録音を使用して測定することができます。したがって、中枢神経系のシナプスにおけるシナプス前及びシナプス後の電気的活動の全体像は、この準備を用いて達成可能です。ここでは、スライスの準備、開催される基本的なパッチクランプ技術の腎杯の識別のための形態学的特徴、及びエキソサイトーシスとエンドサイトーシスを測定する静電容量の記録の例のための方法が提示されます。

Protocol

パッチクランプの設定:

光学系:良いセルを見つけるために、そしてそれの位置を確立するために光学系は非常に重要である。

鋭いエッジ、柔らかそうに見えるセル:セルのクリアな画像を取得してください。

添付の萼との良好なMNTB主細胞を探すためにフィールド全体をスキャンします。別の角度から腎杯を探すために皿を回転させる。最初は、それは風船の形をした端末上で練習するOKです。

スライスの表面にあるセルを選択、または第2の細胞層に。ピペットで細胞の最初の1 / 3 回を対象と

がくの識別:(図1を参照)二重膜を探して、そしてそれが萼であることを確認するためのさまざまな角度からそれを見るためにスライス皿を回転させる。

図1
図1

がくの深さ:がくが表面上にあるか、できるだけ表面に近いはず。

パッチ適用に使用できる表面:判断するために顕微鏡で使用して微フォーカスノブ方法"深さ/幅の"がくです。例えば、ファインフォーカスのフルターン〜10%があなたの上にパッチを適用するのに十分な表面積よりも多くを与える。

シナプス前細胞の上にシール:アタッチされたセルを取得するには、ピペットのposの圧力(〜0.15psi)による細胞表面上に"小さな"変形を探して、ダウンして全体で、ピペットを実行するためのマニピュレータを使用して、とさえへ必要に応じてとのような良好な変形を得るためにpresyn端子の表面には、その後、圧力を解放し、吸引を適用します。

PULSE、データ取得プログラム:

最初に使用する前にバッファサイズを増やす必要がある、とするたびに容量をサンプリングすることによって必要。

修正されたマクロたびにロードする必要があります。

液体ジャンクショ​​ンポテンシャルPresyn録音ソリューションは、(11mV負)- 11mVです。

Presyn:Cslow =〜15 pFの

presyn用のRSカンプ:10マイクロ秒、65%(以上補償可能性のあるW /外振動)

記録容量の前に:テスト現在のリラクゼーション(10 mVの、10ミリ秒のジャンプが)緩和がmonoexponentialであるかどうかを確認するために、すなわち、presynの用語は、単一の区画でモデル化できるかどうか。

フィルタ:高速なコンポーネントが上を逃したしていないことを確認するため、緩和測定中に30 kHzと10 kHz(各ベッセルフィルタ1と2)で設定します。

ミニ録音中に、新生は10 kHzと5kHzのを使用。 LGWは、我々はミニの立ち上がり時間を測定することができることを確認するために30 kHzでのみフィルター1セットを使用するように私に尋ねた。

ファイル命名規則:7桁のmmは月000mmxx、(または月と年)とxxはセル番号です。

ソリューションラインを清掃:0.1 M塩酸20 mlの実験の終了時にクリーンアップラインズは、200ミリリットルddH2Oが続きます。

外部ソリューションがリサイクルされ 、ポンプの速度は、20〜30 rpmです。

(入浴室から戻って解決策は、メスシリンダーに逆流)。

十分な吸引を確保するために3の発信回線を設定します。

ピペットシナプス前レコーディングソリューション:〜310ミリ浸透圧

Presynソリューションは、実験中にR -アクセスの増加を防ぐために〜310 mOsmである必要があります。

Presynピペット溶液はpostsynピペット溶液(PresynはEXのATPとGTPを持っている。)とは異なります。

TTX - TEA溶液(カルシウム電流を単離すること):

  • ソリューションのブロックK -チャネルにおけるTEAとして、セルの上に、シール、あるいはパッチ適用後に適用しようと細胞を脱分極。これは、細胞にとって好ましいことではありません。同じ理由で、それは、TTXが適用された後に、スライスを再利用できないことがあります。
  • セル、または持続性脱分極の影響を確認するためにスライスの最初と最後の応答を比較する。
  • 効果が速くなるように、TTXは1μMの代わりに0.5μMで使用されています。ソリューションを変更した後、短い時間を待機する必要があります。

切断スライス

ビブラトームの設定:

  • 70Hzの横振動
  • 振幅:1.0ミリメートル
  • 萼で、スライスをカットしながら前進、0.1以外の場合厚さ0.01〜0.02ミリメートル/秒のスピード:180μmのを(〜150高齢動物の程度)

スライスは、1時間(カット時間を含む)、すなわち、15〜20分切削後のお風呂に残すために37℃でインキュベートする。

ピペット:

Presyn:最初MΩ3.5から4.5、3.0から3.5MΩもっと自信

設定値を設定するには、引き手のマニュアルを使用してください。ガラスが厚いため、遅延機能を使用します(200または1作業の遅延)

ガラスのタイプ:ホウケイ酸、標準の壁、無フィラメント

外径:2.0ミリメートル

内径1.16ミリメートル

長さ:7.5センチメートル

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