Calyx से पैच दबाना समाई रिकॉर्डिंग के लिए तरीके

Biology

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Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx. J. Vis. Exp. (6), e244, doi:10.3791/244 (2007).

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Abstract

हम आयोजित एक स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र तंत्रिका टर्मिनल के Calyx पर presynaptic पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए बुनियादी तकनीकों को प्रदर्शित करता है. Presynaptic टर्मिनल से बिजली रिकॉर्डिंग कार्रवाई क्षमता, कैल्शियम चैनल धाराओं, पुटिका संलयन (exocytosis) और बाद में झिल्ली तेज endocytosis () की माप की अनुमति. neurotransmitter युक्त vesicles के संलयन पुटिका झिल्ली का कारण बनता है Calyx के कोशिका झिल्ली के लिए जोड़ा जा. कोशिका झिल्ली की मात्रा में यह वृद्धि समाई में वृद्धि के रूप में मापा जाता है. बाद में समाई में कमी endocytosis, झिल्ली तेज या Calyx झिल्ली से हटाने की प्रक्रिया को इंगित करता है. Endocytosis, Calyx की संरचना को बनाए रखने के लिए आवश्यक है और यह भी आवश्यक है vesicles कि भविष्य exocytosis घटनाओं के लिए neurotransmitter के साथ भरा जाएगा फार्म है. पकड़ा के Calyx में समाई रिकॉर्डिंग सीधे और तेजी से यह संभव vesicular जारी है और एक स्तनधारी सीएनएस तंत्रिका टर्मिनल में बाद endocytosis को मापने के लिए बनाया है. इसके अलावा, इसी postsynaptic गतिविधि एक साथ बनती रिकॉर्डिंग का उपयोग करके मापा जा सकता है. इस प्रकार presynaptic और postsynaptic एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र synapse में बिजली की गतिविधि की एक पूरी तस्वीर इस तैयारी का उपयोग करने के लिए प्राप्त है. यहाँ टुकड़ा तैयारी, पकड़ा, बुनियादी तकनीक clamping पैच के calyces की पहचान के लिए morphological विशेषताओं, और समाई के लिए exocytosis और endocytosis उपाय रिकॉर्डिंग के उदाहरण के लिए तरीके प्रस्तुत कर रहे हैं.

Protocol

पैच दबाना सेटअप:

प्रकाशिकी प्रकाशिकी बहुत महत्वपूर्ण हैं करने के लिए एक अच्छा सेल खोजने के लिए, और की स्थिति की स्थापना.

तेज किनारों, मुलायम दिखने सेल: कक्षों की एक स्पष्ट छवि प्राप्त करने की कोशिश करो.

पूरे क्षेत्र को स्कैन करने के लिए संलग्न Calyx के साथ अच्छे MNTB प्रमुख कोशिकाओं के लिए देखो. पकवान घुमाएँ विभिन्न कोणों से calyces लिए देखने. सबसे पहले, यह ठीक है गुब्बारे के आकार का टर्मिनल पर अभ्यास.

टुकड़ा की सतह पर सेल उठाओ, या 2 एन डी सेल परत में. विंदुक के साथ पहली बार 1 / 3 सेल की तीसरी लक्षित

Calyxes पहचान: एक डबल झिल्ली (चित्रा 1 देखें) के लिए देखो, और टुकड़ा पकवान बारी बारी से करने के लिए विभिन्न कोणों से देखने के लिए मदद करने के लिए पुष्टि करते हैं कि यह एक Calyx है.

चित्रा 1
चित्रा 1

Calyx की गहराई: Calyx सतह पर हो सकता है या के रूप में सतह के करीब संभव के रूप में करना चाहिए.

पट्टी के लिए उपलब्ध भूतल: खुर्दबीन पर घुंडी का प्रयोग करें ध्यान केंद्रित ठीक निर्धारित करने के लिए "/ व्यापक और गहरा" Calyx कैसे है . उदाहरण के लिए, ठीक पर ध्यान केंद्रित एक पूर्ण बारी की ~ 10% आप पर्याप्त सतह क्षेत्र से अधिक पर पैच दे देंगे.

एक presynaptic सेल पर सील: संलग्न सेल करने के लिए, पिपेट में स्थिति (0.15psi ~) दबाव की वजह से सेल की सतह पर एक "छोटे" विरूपण के लिए देखो, जोड़तोड़ उपयोग विंदुक चलाने के ऊपर, नीचे और पार, और भी में presyn टर्मिनल की सतह के लिए एक अच्छा विरूपण, तो दबाव जारी है और चूषण लागू करने के लिए, और अगर रूप में आवश्यक.

पल्स, डेटा अधिग्रहण कार्यक्रम:

पहले का उपयोग करने से पहले बफर आकार में वृद्धि, और नमूना क्षमता से जब भी आवश्यक चाहिए.

संशोधित मैक्रोज़ हर बार लोड करने की आवश्यकता है.

तरल संभावित जंक्शन: Presyn रिकॉर्डिंग समाधान है - 11mV (नकारात्मक 11mV).

Presyn: Cslow = pF 15 ~

Presyn रुपये COMP के लिए: 10 μsec, 65% (अधिक मुआवजा संभव w / बाहर दोलनों हो सकता है)

इससे पहले रिकॉर्डिंग समाई: टेस्ट वर्तमान विश्राम (10 mV, 10 मिसे कूद) को देखने के लिए कि क्या छूट monoexponential है, अर्थात्, कि क्या presyn शब्द एक एकल कम्पार्टमेंट द्वारा modeled किया जा सकता है है.

फिल्टर: 30 kHz और 10 kHz के विश्राम माप के दौरान (बेसल फिल्टर 1 और 2 क्रमशः), के लिए यकीन है कि एक तेजी से घटक बाहर याद नहीं है पर सेट करें.

मिनी रिकॉर्डिंग के दौरान, Xinsheng 10 kHz और 5kHz इस्तेमाल किया. LGW मुझसे पूछा 30 kHz पर केवल फिल्टर 1 सेट का उपयोग करने के लिए यकीन है कि हम मिनी के उदय के समय को मापने कर सकते हैं.

फ़ाइलें नामकरण: 7 अंकों 000mmxx (या महीने और वर्ष) जहां मिमी महीने है और xx सेल नंबर है.

सफाई समाधान लाइन्स: 0.1 एम एचसीएल का 20 मिलीलीटर के साथ प्रयोग के अंत में साफ लाइंस 200 मिलीलीटर ddH2O द्वारा पीछा किया .

बाहरी समाधान पुनर्नवीनीकरण रहे हैं, पंप गति 20-30 rpm है.

(स्नान कक्ष से लौटने के समाधान स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर में वापस बहती है).

3 निवर्तमान लाइनों के लिए पर्याप्त चूषण सुनिश्चित सेट.

पिपेट presynaptic रिकॉर्डिंग समाधान: ~ 310 milli Osmolar

Presyn समाधान करने के लिए ~ 310 आर प्रयोग के दौरान उपयोग में वृद्धि को रोकने के mOsm की जरूरत है.

Presyn विंदुक समाधान postsyn विंदुक समाधान (Presyn एटीपी और पूर्व के लिए जीटीपी है.) से अलग है.

TTX - चाय का समाधान (Ca धाराओं अलग):

  • सील, या भी पट्टी के बाद लागू करने की कोशिश करो, सेल पर समाधान कश्मीर चैनलों ब्लॉक में चाय के रूप में और सेल depolarizes. इस सेल के लिए अच्छा नहीं है. उसी कारण से, यह संभव नहीं हो टुकड़ा पुन: उपयोग के बाद TTX लागू किया जाता है हो सकता है.
  • सेल, या लंबे समय तक विध्रुवण के किसी भी प्रभाव की जांच करने के लिए टुकड़ा की पहली और आखिरी प्रतिक्रिया की तुलना करें.
  • TTX 1 के बजाय सुक्ष्ममापी 0.5 सुक्ष्ममापी पर प्रयोग किया जाता है ताकि प्रभाव तेजी है. समाधान बदलने के बाद कम समय तक इंतजार करने की आवश्यकता है.

काटना स्लाइसें

Vibratome सेटिंग्स:

  • 70Hz पार्श्व कंपन
  • आयाम: 1.0 मिमी
  • अग्रेषित 0.01-0.02 मिमी / सेकंड की गति जबकि Calyx के साथ स्लाइसें काटने, 0.1 अन्यथा मोटाई: 180 (सुक्ष्ममापी 150 ~बड़े जानवरों में सुक्ष्ममापी)

स्लाइस 1 (काटने के समय भी शामिल है) घंटे, अर्थात् काटने के 15-20 मिनट के बाद स्नान में छोड़ के लिए 37 º सी में सेते हैं.

Pipettes:

Presyn: पहली बार में MΩ 3.5-4.5 3.0-3.5 MΩ जब और अधिक आत्मविश्वास महसूस

खींचने पुस्तिका का प्रयोग करने के लिए सेटिंग्स सेट. देरी सुविधा का उपयोग करें क्योंकि कांच मोटी है (200 या 1 काम की देरी)

ग्लास के प्रकार: Borosilicate, मानक दीवार, कोई फिलामेंट

बाहरी व्यास: 2.0 मिमी

इनर व्यास 1.16 मिमी

लंबाई: 7.5 सेमी

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