Automatic Translation

This translation into Russian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

Объединение Липофильные краситель, На месте Гибридизация, иммуногистохимии, и гистологии

1, 1, 2, 1

1Department of Biology, University of Iowa, 2Molecular Targeting Technologies, Inc.

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE
     

    Summary

    Сочетание различных методов, чтобы максимизировать сбор данных от мыши ткань представлена.

    Date Published: 3/17/2011, Issue 49; doi: 10.3791/2451

    Cite this Article

    Duncan, J., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology. J. Vis. Exp. (49), e2451, doi:10.3791/2451 (2011).

    Abstract

    Выходя за рамки одной функции гена, чтобы сократить глубже в гене регуляторных сетей требуется несколько мутаций объединены в одно животное. Такой анализ двух или более генов должна быть дополнена в гибридизация других генов, или иммуногистохимии их белков, как в целом установлены развивающихся органов или разделы для подробного разрешение клеточные и тканевые изменения выражения. Объединение нескольких изменений гена требует использования CRE или flipase условно удаления генов и избежать эмбриональной летальности. Обязательные схемы размножения резко повысить усилий и затрат пропорционально числу генов, мутации в результате очень немногие животные с полным репертуаром генетических модификаций лучшего. Амортизировать огромное количество усилий и времени, чтобы получить эти несколько драгоценных образцов, которые реализуют множественные мутации требует ткани оптимизации. Более того, расследование одного животного с несколькими методами облегчает коррелируют дефекты гена удаления с выражением профилей. Нами разработана методика получения более тщательный анализ данного животного, с способность анализировать несколько различных гистологически узнаваемых структур, а также экспрессии генов и белков все из того же образца в целом как монтируется органов и секций. Хотя мышей были использованы, чтобы продемонстрировать эффективность этой техники он может быть применен к широкому кругу животных. Для этого мы объединяем липофильный краситель трассировки, целые горы на месте гибридизация, иммуногистохимии, и гистологии, чтобы извлечь максимально возможное количество данных.

    Protocol

    1. Липофильные Dye инъекций

    Ткань приготовления:

    Все ткани вскрытия и манипуляции проводятся на животных фиксировали в 4% параформальдегида (PFA) в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), по transcardial перфузии использованием перистальтического насоса с соответствующего размера иглы. Ткань может быть сохранен в 4% PFA в холодильнике до 6 месяцев. Все препараты и манипуляции проводятся на 0,4% или выше PFA до монтажа с глицерином для работы с изображениями. Это количество PFA эффективно устраняет РНКазы и сохраняет РНК на месте гибридизации.

    Dye хранения:

    Все красители должны храниться в темном закрытом отсеке, чтобы минимизировать циркуляцию воздуха и воздействия ярком дневном свете, так как они светочувствительных. Чтобы избежать перекрестного загрязнения, отдельный набор инструментов следует использовать для обработки каждого красителя.

    1. Во-первых, веб-приложение, для красителя должен быть выбран и посторонних тканей извлеченный для того, чтобы визуально подтвердить выбранное место, а также доступ для размещения красителя. Выбор веб-приложение, является самым важным шагом в этом процессе. Выбор хороший сайт для обозначения нейронов населения на рассмотрении и не посторонний структур может оказаться непростой задачей. Точность размещения в данном тракта под визуальным контролем в анатомическом театре сферы требует определенного уровня понимания нейроанатомии идет речь. Краска может помещаться либо централизованно или периферического маркировать периферической или центральной проекции, соответственно, сколько необходимо для данного проекта (например, мозга, периферических нервов, ухо, глаз). Lipophic красителей будет диффундировать во всех процессах, принадлежащих данному нейрон, как и ретроградно anterogradely, наполнение данного нейрона или все нейроны, выступающих в данном треке.
    2. NeuroVue красителя из MTTI поставляется с предварительно загружены на фильтр полосы для легкого применения. Краска также может быть распущен в 100% ДМСО (работа под капотом) и тонкие волосы могут быть промыты в этом растворе, а затем сушат в течение небольших приложений. Предустановленной фильтр красителем бумаги разрезают на соответствующего размера треугольных частей с microscissors. Размер краситель будет зависеть от размеров образца, размер структуры получить ярлык, и количество цветов, используемых одновременно. Не забудьте вырезать как небольшие куска, чтобы избежать маркировки других структур. После использования microsissors для резки и щипцы для обработки красителем агитировать инструменты в спирте, чтобы удалить какой-либо красителя вычетов, то высохнуть полностью, или мазок с бумагой. Это сделано во избежание загрязнения образца с остаточной красителя на инструментах, которые могут этикетке нежелательных структур.
    3. Для вставки в мягкие ткани, такие как мозг фильтр может быть непосредственно вставляются с помощью точки фильтр треугольник, чтобы проникнуть в ткани. Для более жесткой ткани делают надрез, чтобы облегчить введение красителя. Не используйте рассекает иглы выдвинуть фильтр в ткани. Это может привести к неточным размещения и разрушение тканей. Вставьте альтернативные длины волн NeuroVue краситель, сколько необходимо для маркировки дополнительные нейронные популяции.
    4. После введения красителя, и проверка его положение, образцы помещают в плотно закрыть флакон с 4% PFA и инкубировали при 36 ° С в темноте в течение 2-14 дней в зависимости от возраста и диффузии расстояния должны быть охвачены (примерно 2 мм на день при температуре 36 ° С).
    5. Рассекает область с epiflouresence могут быть использованы для оценки, если краситель имеет диффузную в нужное место, и образец может быть помещен обратно в инкубатор, если диффузия считается недостаточным. Использование нормального рассекает сферу без epifluorescene для обнаружения диффузии будет недооценивать истинная длина краситель имеет диффузную. Кроме того, если концентрация красителя достаточно высока, чтобы ослов визуально это может привести к поглощению закалки при использовании излучаемого флуоресценции.
    6. Желаемой ткани интерес рассечена, и весь установлен на слайд с глицерином и coverslipped для работы с изображениями с конфокальной микроскопии. Конфокальной настройки, как описано в 1, 2. Если ткань размером тормозит весь монтаж на слайд, серийный секционирования необходимо (см. ниже). Более подробную информацию о подготовке ткани для работы с изображениями и красителя спектральные свойства доступны по адресу: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf

    Рисунок 1
    Рисунок 1. Схема обзор эксперимента. Ухо подвергается позволяет визуализировать все структуры. Липофильные красителя затем вводится и позволили диффузным. После диффузии различных нейронных популяций можно увидеть помечены различными красителями. Далее, в гибридизация (Sox2) осуществляется на ухо и этикетки экспрессии мРНК. Immunohistochemistry Затем проводится(Myo7, тубулина) для визуализации экспрессии белка. Вслед за гистологических срезов, в котором как в точке, гибридизации и иммуногистохимии могут быть визуализированы.

    2. В гибридизация

    В случае, если вы хотите начать с в гибридизация (после чего трассировки с липофильных красителей будет невозможно), обратитесь к ткани подготовки в части 1. Каждый мыть, если не указано, осуществляется с 2 мл раствора при комнатной температуре на инвертор / смесителя. Будьте уверены, чтобы работать в чистой, свободной РНКазы окружающей среды.

    1. Дегидрировать и увлажняет образцы через градуированные серии метанола.
      1. 100% 1 час ночи при 4 ° C (опционально: хранить пробы при температуре -20 ° С на 100% метанола)
      2. 75% х 5 мин. @ 4 ° C
      3. 50% х 5 мин. @ 4 ° C
      4. 25% х 15 мин. @ 4 ° C (или до ткани стоков)
      5. Передача образцов 2 мл Eppendorf трубки (РНКазы бесплатно).
    2. Вымойте три раза PBS (1x PBS) и включите духовку на гибридизации для использования в будущем (60 ° С).
      1. PBS х 5 мин.
      2. PBS х 5 мин.
      3. PBS х 5 мин.
    3. Дайджест ткани с 2 мкл 20 мг / мл протеиназы К акции (Амбион Cat # AM2546) в 2,0 мл свежей PBS.
      Фактическое время пищеварения PK зависит от возраста эмбриона. Ниже приводится приблизительная оценка раза. Пищеварение необходимо внимательно следить, как deproteination является важным шагом. Заместитель пищеварения приведет к снижению проникновения зонда в то время как чрезмерное пищеварения приведет к потере структурной целостности. Хорошим показателем пищеварение изменение ткани от непрозрачного до почти ясно.
      Таблица 1. Протеиназы К пищеварения время на мышь ткани.
      AGE (эмбриональных день) Время (мин)
      E8.5 6
      E9.5 10
      E10.5 13
      E11.5 15
      E12.5 17
      E14.5 18
      E16.5 + 20 +
    4. Стоп пищеварения путем инкубации образцов в 4% PFA в течение 5 мин.
    5. Стирать в PBS.
      1. PBS х 1 мин.
      2. PBS х 5 мин.
      3. PBS х 5 мин.
      4. PBS х 5 мин.
    6. Отменить PBS обращая особое внимание на устранение в максимально возможной степени.
    7. Prehybridize образцов: инкубировать при температуре 60 ° С на инвертор в 1,8 мл смеси гибридизации, по крайней мере 1 час. Установить IsoTemp тепла блока до 85 ° C для дальнейшего использования.
      1. Как один час приближается, денатурации ДНК спермы лосося (Invitrogen Cat номер 15632-011) путем инкубации при температуре 85 ° С в течение 10 мин. Установите на льду до использования.
    8. После по меньшей мере 1 час prehybridization, добавить 200 мкл денатурированного оцДНК и примерно 100ng из DIG-меченых riboprobe для каждого образца. Скрещиваться течение ночи при 60 ° С в гибридизации духовке.
    9. Замените гибридизации смешать с 2 мл 2X SSC. Установите блоки IsoTemp тепла до 37 ° С до 70 ° C для дальнейшего использования.
      1. Промыть 2X SSC х 10 мин. При 60 ° С в гибридизации духовке.
      2. Промыть 2X SSC х 10 мин. При 60 ° С в гибридизации духовке.
      3. Промыть 2X SSC х 10 мин. При 60 ° С в гибридизации духовке.
      4. Промыть 2X SSC х 60 мин. При 70 ° С в блок тепла IsoTemp.
      70 ° C удаляет любые эндогенной активности щелочной фосфатазы. Это, пожалуй, самым значительным шагом на пути уменьшения фона. Часть (г) может быть разбит на два 30 мин. моет свести к минимуму повреждения тканей.
    10. Промыть PBS х 5 мин. Оттепель РНКазы фермента на льду для будущего использования.
    11. Замените PBS и добавьте 1,0 мкл РНКазы ферментов (Fermentas EN0531 10 мг / мл) х 60 мин. @ 37 ° С в IsoTemp тепла блок (90 мин. Инкубационный период предпочтительнее, если датчик имеет высокую концентрацию).
    12. Отменить PBS / РНКазы и промыть 4 раза.
      1. 1X промывочного раствора х 10 мин.
      2. 1X промывочного раствора х 10 мин.
      3. 1X промывочного раствора х 10 мин.
      4. 1X промывочного раствора х 60 мин. При 70 ° С в блок тепла IsoTemp.
    13. Инкубируйте в 1X Блок буфера в течение 1 часа.
      1. В это время подготовить 2,0 мл буфера блока и 1 мкл (1:2000) Анти-дигоксигенин антител в образце. Обратить кратко и пусть сидят при 4 ° С до использования.
    14. Через 1 час буфера блока отказаться и добавить 2,0 мл предварительно поглощается блок буфера + антитела к образцам.
    15. Инкубируйте ночь.
    16. Отменить решение блока.
    17. Промыть 1X промывочный буфер.
      1. 1X промывочный буфер х 5 мин.
      2. 1X промывочный буфер х 5 мин.
      3. 1X промывочный буфер в течение 1 часа 5-6 х изменений.
    18. Промыть 1X промывочный буфер в одночасье.
    19. Промыть 1X detectioн буфера в течение 10 мин.
    20. Передача образцов в буфер для обнаружения и пластины.
    21. Удалить буфера и обнаружить с Б. М. Фиолетовый (Roche 11442074001) до желаемого сигнала получается (с более длинными зондами это может означать, на ночь). Б. М. фиолетовый светочувствительных накрыть фольгой или коробку.
      • Смешайте Б. М. Фиолетовый перед использованием.
      • Убедитесь, что образцы свободное плавание и не пристало скважин.
      • Проверьте сигнал через 1 час.
    22. Промыть образцов с 1X буфере обнаружения в скважинах х 5 мин.
    23. Изображение или хранить образцы в 4% PFA при 4 ° C.

    * Образцы могут быть отображены на данном этапе и / или после иммуногистохимии этапе работы мастера (часть 3).

    Решения:

    • Нуклеазы свободной воды: Смешайте 1 мл DEPC (Sigma) с 1 л стерильной воды сверхчистых. Автоклав.
    • 1X PBS: Смешайте 1 PBS пакета (Sigma) в 1 л воды без нуклеаз и фильтр стерилизуют.
    • 1X Промывочный раствор: смешайте 450 мл нуклеазы свободной воды + 50 мл 10-кратный промывочный раствор и фильтр стерилизуют.
    • Гибридизация Mix: 50% формамид по объему (25 мл), 50% 2Х SSC по объему (25 мл), 6% декстрана сульфата массы (3G).
    • 1X Обнаружение буфера: Смешайте 50 мл 10X буфера обнаружения с 450 мл воды без нуклеаз и фильтр стерилизуют.
    • 1X Блок буфера: 5 мл 10X Малеиновый буфера кислота (Рош буфера набора), 40 мл нуклеазы свободной воды, 5 мл 10X буфера блока.
    • 2X SSC: Смешайте 50 мл 20х SSC с 450 мл воды без нуклеаз и фильтр стерилизуют.
    • Градуированные метанол: Развести 100% метанола с нуклеазы свободной воды до 75%, 50% и 25% концентрации.

    3. Иммуногистохимия

    Шаги 1 и 2 можно опустить, если часть 2 был завершен. В этом случае, убедитесь, что все глицерин или другие монтажные среды смывается. Заметим, что не все антитела все еще будет в состоянии обнаружить их эпитопа после переваривания протеиназы К. У нас есть шорт-лист антитела, которые могут быть использованы в сочетании с в гибридизация в тканях млекопитающих, поскольку они сохраняют свою специфику (см. таблицу 2).

    1. Градуированные серии этанола, чтобы избавить ткани липофильных красителей (если не завершена осуществить в части 2):.. 50% 5мин этанол, 70% этанола 5 мин, 95-100% этанола на ночь или по мере необходимости, пока желаемого эффекта, 70% этанола 5 мин., 50% этанола, 5 мин.
    2. Увлажняет путем постепенного добавления PBS в течение 5-10 минут.
    3. Блок ткани в течение 1 часа в 2,5% нормальной козьей сывороткой (NGS) и 0,5% Тритон Х-100 @ RT на шейкере.
      (1:1 5% NGS: 1,0% TritonX-100 в 1x PBS)
    4. Инкубируйте с первичным антителом (ы) разводят в блоке решения 48-72 часов при 4 ° С на шейкере.
    5. Промыть PBS за 1 час х 3 изменения.
    6. Блок, как в шаге 3.
    7. Инкубируйте с вторичными антителами (ы) разводят в блоке решения для 12-24 часа при 4 ° С на шейкере (Alexa Fluor ® красителей из Invitrogen были использованы).
    8. Вымойте, как в шаге 5. (Вариант:.. Счетчик пятно с Hoechst ядерной пятно в качестве первого мытья разбавленным 10 мг / мл акции 1:2000 в PBS Следуйте с 1 часа моется в PBS х 2-3 изменениях @ RT на шейкере)
    9. Получение изображений: Образцы могут быть отображены на этом этапе как с передачей и epifluorescent микроскопии, преимущественно использованием конфокальной системы визуализации для дополнительного разрешения. Для этого мы обычно все уши монтирования в использовании глицерина в качестве покровных прокладки чтобы избежать чрезмерного сжатия тканей. В дополнение или вместо всего этого изображения горы, образцы могут быть внедрены в эпоксидной смоле и серийно секционного для дополнительного гистологического деталей. Чтобы извлечь выгоду из объединенного целого смонтировать / раздел анализа, избежать отбеливания флуоресцентного сигнала в конфокальной шаг изображений.

    Решения

    • Этанол решений: развести 100% этилового спирта в дистиллированной воде до конечной концентрации 50% и 70%.
    • Блок Решение: 1:1 разведения 5% NGS: 1,0% TritonX-100 в 1x PBS (окончательный рабочий концентрациях: 2,5% NGS, 0,5% TritonX-100).
    • 1X PBS: Смешайте 1 PBS пакета (Sigma) в 1 л дистиллированной воды.
    • 5% NGS: Оттепель 2,5 NGS мл и смешивают с 47,5 мл 1x PBS. Хранить при температуре 4 ° С.
    • 1,0% TritonX-100: Смешайте 49,5 мл 1x PBS с 0,5 мл TritonX-100 (выйти на шейкере @ RT перемешать в течение 1 часа). Хранить при температуре 4 ° С.
    • Hoechst пятно решение складе: Растворите 10 мг красителя Hoechst на миллилитр 1x PBS.
    Таблица 2. Антитела, которые работают с протеиназы К переваривается ткани.
    Cat # Пункт Продавец
    25-6790 Анти-миозина-VIIA Поликлональные Proteus Biosciences
    25-6791 Анти-миозина-VI Поликлональные Proteus Biosciences
    9661 Расколотая каспазы-3 Поликлональные Сотовые сигнализации
    T7451 Анти-ацетилированный тубулина Monoclonдр. Сигма
    PRB-238C Prox1 поликлональных Covance

    4. Гистология

    Гистология может быть введена после того, часть 1 увеличить разрешение липофильный краситель трассировки в толстых тотальных таких как мозг несовершеннолетних или после завершения Части 2 или 3. Для серийных срезах мозга, мы рекомендуем Compresstome VF-700 микротома (Precisionary инструменты Inc, Гринвилл, Северная Каролина), чтобы получить равномерную толщину сечения. Замороженные срезы меньше оптимального из-за большей красителя утечки во время секционирования процессе 3. Подготовка серийных срезов и монтаж в глицерине 4 является предпочтительным методом подготовки ткани при тотальных или поверхности крепления не позволяют адекватной визуализации тканей регионах, представляющих интерес. Ткань также может впоследствии быть встроены в эпоксидной смоле и нарезать на 1-2 мкм толщиной с использованием стекла или алмазные ножи для ПЭМ. При использовании этой методики наиболее иммунофлюоресценции останется и даже более стабильным после пластических вложение, однако, все липофильные трассировка будет полностью потерял на этом этапе, как они растворяются в смоле алкоголя и эпоксидной смолы. Примите меры предосторожности, как образцы будут светочувствительных пока они не будут внедрены.

    Для Compresstome VF-700 микротома секционирования, следуйте рекомендациям Precisionary инструменты Инк

    Эпоксидные Встраивание / Секционирование:

    1. Фиксация: 2,5% gluteraldehyde / 1% PFA в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), 1 час, чтобы за одну ночь.
    2. В флаконе образца стекла обезвоживает ткани: 30% этанола (5min.), 50% этанола (5min.), 70% этанола (5min. на ночь), 95% этанола (5x 10 минут каждый.), А абсолютный этанол (5x 10мин . каждый).
    3. Переходные растворителей: 1:1 абсолютного этилового спирта: окиси пропилена (ПО) в течение 5 мин.
    4. Растворитель: PO только 5x 10мин. каждая.
    5. Проникновение со смолой:
      1. 1:01 ПО: смолы ночь на шейкере.
      2. Налейте раствор образца (ов) в плоские формы вложения и выйти на счетчик 4-6 часов для испарения ПО. Кроме того, удалить крышку флакона и оставьте на шейкере в течение 4 часов (хорошо работает с большим ткани).
      3. Передача образцов до 100% смолы в течение 4 часов.
    6. Добавить в смоле в окончательной форме с этикеткой. Полимеризации путем инкубации при температуре 60 ° С в течение 24-48 часов.
    7. Вырезать блок с лезвием, сколько необходимо для минимизации посторонних смолы. Вырезать 1-2 мкм серийных срезов на ультрамикротоме (Ultracut E-Reichert Jung был использован). Горы и изображения с помощью epifluorescent микроскопии.
      Дополнительно: Пятно часть секций с гистологической окраски (синие т.е. Stevenel), если желаемое (реализовать иммунофлюоресценции не будет устойчивым в этих разделах).

    Решения

    • Этанол решений: развести 100% этилового спирта в дистиллированной воде до 30%, 50%, 70% и 95% концентрации.
    • Фиксация решение: смешать 2,5 мл 50% Gluteraldehyde, 5 мл 10% параформальдегида, и 42,5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4 (конечные концентрации: 2,5% gluteraldehyde, 4% PFA). Хранить при температуре 4 ° С.
    • Эпоксидная смола: Сделайте согласно инструкции, прилагаемой к Poly / Кровать 812 Вложение Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc # 08792-1). Хранить при -20 ° C.

    5. Представитель Результаты

    Рисунок 2
    Рисунок 2. Липофильные красителя размещения и обработки изображений в эмбриона мыши. Три различных длин волн липофильных красителей вводили и инкубировали чтобы визуализации тройничного нерва (TN), языкоглоточного нерва (GN), и блуждающий нерв (VN) центральной проекции. ) Липофильные размещения красителя в периферической части три черепных нервов, чтобы диффузия в ствол головного мозга для визуализации своих центральных процессов. TN помечена NeuroVue красный, GN: NeurVue Maroon, В. Н.: NeuroVue Jade. Б) То же мыши, как в () после инкубации. Некоторые диффузии можно увидеть микроскопии светлого. С) То же мыши, как в (А и В). Задний мозг была расчленена и плоские смонтирован. Некоторые маркировка центральных процессов трех нервов помечены можно увидеть микроскопии светлого. D) конфокальной образ (С). С использованием конфокальной специфические нейроны можно увидеть, а также использование трех различных красителей позволяет для оценки распределения каждой группы населения по отношению к другим. Красители были обследованы последовательно. NeuroVue Джейд была отображаемого в возбуждении 488 нм и излучения 500-550 нм. NeuroVue Красной отображаемого в возбуждении 535 нм и излучения 550-600 нм. NeuroVue Maroon был отображаемого в возбуждении 643 нм и эмиссии на 650-700 нм.

    Рисунок 3
    Рисунок 3. Схема обзор эксперимента. Ухо подвергается позволяет визуализировать все структуры. Липофильные красительзатем вводят и позволили диффузным. После диффузии различных нейронных популяций можно увидеть помечены различными красителями. Далее, в гибридизация (Sox2) осуществляется на ухо и этикетки экспрессии мРНК. Immunohistochemistry Затем проводится (Myo7, тубулина) для визуализации экспрессии белка. Вслед за гистологических срезов, в котором как в точке, гибридизации и иммуногистохимии могут быть визуализированы.

    Discussion

    В этом видео мы продемонстрируем метод объединить четыре техники в целях максимизации сбора данных и сплоченность путем сопоставления данных в рамках данного животного (рис. 3). Такой подход позволит сократить количество разведения и при этом время, необходимое для получения публикуемые данных при одновременном повышении информацию о совместной локализации и корреляционного эффектов мутантов. Хотя эмбриональных мышах были использованы в этом видео, взрослой мыши, а также других животных, таких как курица, Xenopus, и данио рерио могут быть проанализированы с помощью этих методов, а также. При использовании других видов протеиназы К пищеварения, возможно, должны быть изменены. Здесь мы используем различные флуоресцирующие красители NeuroVue специально этикетки до трех нейронных популяций, представляющих интерес. Польза от этих красителей является то, что они могут быть использованы в мутантных мышей, которая может быть проблематичным, когда полагаться исключительно на иммуногистохимии, которые могут или не могут быть затронуты мутациями, которые будут проанализированы, и они называют нейроны ретроградно и anterogradely 5. Недавнее исследование, также увеличилось число нейронов населения, которые могут быть помечены одновременно до шести 2. После, липофильный краситель трассировки же тканью, затем могут быть проанализированы с использованием на месте гибридизации, для анализа транскрипции генов и может быть в дальнейшем проанализированы с помощью иммуногистохимии для белка распределения. Последний анализ может быть дополнен подробным гистологии, который может добавить к характеристике фенотипа 6. Это многофакторный анализ имеет потенциал, чтобы получить новые идеи через корреляционного анализа в пределах одного животного, которое в противном случае могут быть невероятным или по крайней мере, нуждающиеся в более обширные протоколы и мышь разведения.

    Disclosures

    Мышь ткань была собрана в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными в Университете штата Айова Институциональные уходу и использованию животных комитета (ACURF 0804066).

    Acknowledgements

    Конфокальной изображения были получены в Университете штата Айова Карвер центр для работы с изображениями. Финансирование было предоставлено SBIR гранта (MH079805) для BF Дополнительная поддержка для разведения мышей для этого проекта была предоставлена ​​NIDCD (5R01DC00559007) для BF

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    in situ Hybridization:
    PC DIG wash + block buffer set Roche Group 1585762
    Premix 20x SSC Buffer Roche Group 1666681
    Proteinase K 20mg/ml Ambion AM2546
    Diethyl Pyrocorbonate (DEPC) Research Products International Corp. D43060
    Formamide Sigma-Aldrich F9037
    Dextran Sulfate Research Products International Corp. D20020
    BM Purple Roche Group 11442074001
    Anti-Dig-AP Fab fragments Roche Group 11093274910
    RNase A enzyme 10mg/ml Fermentas EN0531
    RNase Away Research Products International Corp. 7003
    Salmon Sperm DNA 10mg/ml Invitrogen 15632-011
    Stericup Filter Unit 0.22μm; 500ml EMD Millipore SCGVU05RE
    Filter Discs 0.2μm; 25mm Whatman, GE Healthcare 6780-2502
    Phosphate buffered saline PH 7.4 packets Sigma-Aldrich P-5368
    Immunohistochemistry:
    Goat Serum Sigma-Aldrich G9023
    Triton X-100 Sigma-Aldrich T8532
    H–chst Dye Polysciences, Inc. 9460
    Histology:
    Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit Polysciences, Inc. 08792-1
    Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205
    Gluteraldehyde Solution 50% Fisher Scientific G151
    DPX Mountant Fluka 44581
    Rocker MidSci 55D1114
    Heat Block Fisher Scientific 11-715-125D
    Rotator Thermo Fisher Scientific, Inc. 400110Q
    Incubator set to 60° Fisher Scientific 11-690-625D
    Dye tracing:
    Microscissors Geuder G-19775
    Fine Forceps E.M.S 72680-F
    NeuroVue dye: Maroon, Red, Jade MTTI FS-100(1,2,6)
    1X phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P-5368
    Dissecting scope Leica Microsystems M205 FA
    Incubator set to 36° Fisher Scientific 11-690-506DQ
    Confocal Microscope Leica Microsystems LSM 510
    Slides Surgipath 00240
    Coverslips Surgipath 00106
    RPI Glycerol G22025-0.5
    Paraformaldehyde (4% and 0.4%) Fisher Scientific T353-500

    References

    1. Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes. Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).
    2. Tonniges, J. Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing. Journal of Microscopy. (2010).
    3. Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis. J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).
    4. Gurung, B., Fritzsch, B. Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection. J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).
    5. Fritzsch, B., Nichols, D. H. DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice. Hear Res. 65, 51-60 (1993).
    6. Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea. PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter