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 JoVE Neuroscience

Lipophilic 염료를 결합, 현장에서 하이브리드화, Immunohistochemistry, 그리고 조직학

1, 1, 2, 1

1Department of Biology, University of Iowa, 2Molecular Targeting Technologies, Inc.

Article
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    Summary

    마우스 조직에서 데이터 수집을 최대화하기 위해 다양한 기술의 조합이 제공됩니다.

    Date Published: 3/17/2011, Issue 49; doi: 10.3791/2451

    Cite this Article

    Duncan, J., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology. J. Vis. Exp. (49), e2451, doi:10.3791/2451 (2011).

    Abstract

    유전자 규제 네트워크에 깊은 상처 단일 유전자 기능을 넘어가는 것은 하나의 동물에서 결합 여러 돌연변이가 필요합니다. 두 개 이상의 유전자의 이러한 분석은 세포와 조직 표현 변경에 대한 자세한 해결을 위해 전체를 장착 개발 장기 또는 섹션에 모두 다른 유전자 또는 단백질의 immunohistochemistry의 현장 하이브리드화에 구비해야합니다. 여러 유전자 변경을 결합 조건부 유전자를 삭제하고 배아 파괴 장면을 보여 주죠을 피하기 위해 CRE 또는 flipase의 사용을 필요로합니다. 필수 번식 제도가 크게 노력을 강화하고 원하는 유전 수정의 전체 레퍼토리 매우 몇몇 동물의 결과와 함께, 변이된 유전자의 숫자에 비례 비용. 여러 변이를 운반하고 이러한 몇 가지 귀중한 표본을 얻기 위해 노력과 시간의 방대한 양을 Amortizing하면 조직 최적화를 필요로. 또한, 여러 기술을 하나의 동물을 조사하면 쉽게 표현 프로필 유전자 결함 삭제를 상호 연관시킬 수 있습니다. 우리는 주어진 동물보다 철저한 분석을 얻을 수있는 기술을 개발, 모두 전체가 탑재 장기 및 섹션에 동일한 표본에서뿐만 아니라 유전자 및 단백질 표현 같은 모든 여러 histologically 알아볼 구조를 분석할 수있는 능력. 마우스가이 기법의 효과를 입증하기 위해 이용되어 있지만 그것은 동물의 다양한 적용할 수 있습니다. 이 작업을 수행하려면 우리는 데이터의 최대한 가능한 금액을 추출하는 현장 하이브리드화, immunohistochemistry, 그리고 조직학 in lipophilic 염료 추적, 전체 마운트를 결합.

    Protocol

    1. Lipophilic 다이 사출

    조직 준비 :

    모든 조직의 해부와 조작이 적절하게 크기의 바늘과 연동 펌프를 사용 transcardial 재관류로 0.1 M 인산 완충액 (pH는 7.4)에 4 % paraformaldehyde (PFA)에서 수정된 동물에서 실시하고 있습니다. 최대 6 개월까지 조직은 냉장고에 4% PFA에 저장할 수 있습니다. 모든 준비 및 조작은 이미징을위한 글리세롤과 장착까지 0.4 % 이상 PFA로 진행됩니다. PFA의이 금액은 효과적으로 RNases을 제거하고 현장 하이브 리다이 제이션에 대한 RNA를 유지합니다.

    다이 스토리지 :

    그들은 감광성의 그대로 모든 염료는 공기 순환과 밝은 일광에 노출을 최소화하기 위해 어두운 폐쇄 구획에 보관해야합니다. 교차 오염을 방지하기 위해, 악기 별도의 집합은 각 염료를 처리하는 데 사용해야합니다.

    1. 우선, 염료에 대한 응용 프로그램 사이트는 시각 선택한 사이트 및 염료의 게재 위치에 대한 액세스를 확인하기 위해 선택과 관계없는 조직 추출해야합니다. 신청 사이트를 선택하면이 과정에서 가장 중요한 단계입니다. 고려 아래의 연결 인구 레이블을 수있는 좋은 사이트를 선택이 아닌 외부 구조는 도전하실 수 있습니다. 해부 범위에 시각적인 통제하에 주어진 넓이로 배치의 정확성 문제의 neuroanatomy 이해의 특정 수준을 필요로합니다. 염료 중 각각으로 지정된 프로젝트 (즉, 뇌, 말초 신경, 귀, 눈)에 필요한 주변 장치 또는 중앙 계획에 레이블을 중앙 또는 peripherally 삽입할 수 있습니다. Lipophic 염료는 특정 트랙으로 돌출 주어진 신경 세포 또는 모든 뉴런을 작성 모두 retrogradely 및 anterogradely, 특정 신경 세포에 속하는 모든 프로세스에 확산됩니다.
    2. MTTI에서 NeuroVue 염료 사전 로드된 쉽게 응용 프로그램에 대한 필터가 부착된로 제공됩니다. 염료는 백퍼센트 DMSO에 녹아 수 있습니다 (후드에서 동작)와 얇은 머리카락이 솔루션에 배어 있었고, 그 후에 작은 애플 리케이션을위한 건조하실 수 있습니다. 미리 필터 종이 염료 microscissors와 적절하게 크기 삼각형 조각으로 절단됩니다. 염료의 크기는 표본, 표시되는 구조의 크기, 동시에 사용되는 색상의 수를의 크기에 따라 달라집니다. 다른 구조를 라벨 피하기 위해 가능한 한 조각의 작은 잘라주십시오. 염색 종이​​로 완전히 공기가 건조 후, 어떤 염료 잔류물을 제거하거나, 지문을 알코올에 악기를 선동 처리를위한 절단 및 포셉에 대한 microsissors을 사용한 후. 이것은 원치 않는 구조 레이블을 수 있습니다 악기에 잔류 염료와 표본 오염을 막기 위해하는 것입니다.
    3. 같은 두뇌와 같은 부드러운 조직으로 삽입을위한 필터를 직접 피어스 조직 필터 삼각형의 지점을 사용하여 삽입하실 수 있습니다. 더 단단한 조직은 염색의 쉽게 삽입을 허용하기 위해 절개를하게하십시오. 조직으로 필터를 밀어 해부 바늘을 사용하지 마십시오. 이것은 조직의 부정확 배정 및 중단을 일으킬 수 있습니다. 같은 추가의 연결 인구의 라벨에 필요한 NeuroVue 염료의 다른 파장을 넣습니다.
    4. 염료를 삽입하고, 위치를 확인 후, 표본은 4% PFA와 함께 안전하게 닫힌 유리병에 배치하고 36에서 incubated ° (약 2mm 대상으로 연령과 확산 거리에 따라 2~14일 동안 짙은 어둠 속에서 C 36 하루 ° C).
    5. epiflouresence과 해부 범위는 염료가 원하는 위치로 확산하고, 보급이 불충 분한 것으로 간주 경우 표본이 인큐베이터에 다시 삽입할 수있다면 평가하기 위해 사용될 수 있습니다. 확산을 감지하는 epifluorescene하지 않고 정상적인 해부 범위를 사용하면 염료가 확산이 진정한 길이를 과소 평가합니다. 염료 농도가 엉덩이 충분히 높으면 방출 형광을 사용하면 또한 시각은 흡수 담금질을 일으킬 수 있습니다.
    6. 관심 원하는 조직은 밖으로 해부와 글리세롤로 슬라이드에 장착하고 공촛점 현미경으로 영상을위한 coverslipped 전체입니다. 공촛점 설정으로 1, 2에 설명되어 있습니다. 조직의 크기가 슬라이드 마운트 전체 억제하는 경우, 직렬 sectioning는 (아래 참조)이 필요합니다. 이미징 및 염료 스펙트럼 특성에 대한 조직의 준비에 대한 자세한 내용은 다음에서 구할 수 있습니다 : http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf

    그림 1
    그림 1. 실험의 개략도 개요. 귀에 모든 구조의 시각화 수 있도록 노출됩니다. Lipophilic 염료는 다음 주입 및 확산 수 있습니다. 확산 이후 뚜렷한 인구의 연결은 서로 다른 염료로 분류 볼 수 있습니다. 다음 현장의 하이브리드화에서 (Sox2) 귀 및 라벨의 mRNA 발현에 수행됩니다. Immunohistochemistry 그 다음 수행됩니다(Myo7, Tubulin) 단백질 발현을 시각화합니다. 원위치 하이브리드화과 immunohistochemistry에 모두 시각 수있는 histological 섹션으로 따라갔다.

    2. 원위치 하이브리드화에

    당신은 (lipophilic 염료로 추적하는 것은 불가능하게됩니다 이후) 현장 하이브리드화에서 시작하려는 경우에는 제 1 조직 준비를 참조하십시오. 각 세척이 표시되지 않는 인버터 / 믹서에 상온에서 용액 2 ML로 수행됩니다. 깨끗하고 RNase 자유로운 환경에서 작동해야합니다.

    1. 등급 메탄올 시리즈를 통해 샘플을 rehydrate 후 탈수합니다.
      1. 100 % 일시간 하루 @ 4 ° C (옵션 : 100 % 메탄올에서 -20 ° C에서 저장 샘플)
      2. 75% X 5 분. @ 4 ° C
      3. 50 % X 5 분. @ 4 ° C
      4. 25% X 15 분. @ 4 ° C (또는 조직 싱크까지)
      5. 2 ML eppendorf 튜브 (RNase 무료)에 샘플을 전송합니다.
    2. PBS (1X PBS)에 세 번 씻어과 향후 사용 (60 ° C)에 대해 하이브 리다이 제이션 오븐을 켜십시오.
      1. PBS X 5 분.
      2. PBS X 5 분.
      3. PBS X 5 분.
    3. 2.0 ML 신선한 PBS의 ML / 20mg 주식 Proteinase K (앰비온 캣 # AM2546) 2 μL와 다이제스트 조직.
      실제 PK의 소화 시간은 배아의 나이에 따라 달라집니다. 다음은 시대의 대략적인 견적입니다. deproteination가 중요한 단계로 소화가 밀접하게 모니터해야합니다. 여 - 소화가 구조 무결성의 손실이 발생합니다 반면 아래 - 소화는 가난한 프로브 침투하게됩니다. 소화의 좋은 지표는 거의 취소 불투명에서 조직의 변화이다.
      표 1. 마우스 조직에서 Proteinase K의 소화 시간.
      AGE (배아 일) 시간 (분)
      E8.5 6
      E9.5 10
      E10.5 13
      E11.5 15
      E12.5 17
      E14.5 18
      E16.5 + 20 +
    4. 5 분 4% PFA에 샘플을 잠복기로 소화를 중지합니다.
    5. PBS로 세척.
      1. PBS X 1 분.
      2. PBS X 5 분.
      3. PBS X 5 분.
      4. PBS X 5 분.
    6. 가능한 한 많이 제거하기 위해 특별한주의를 기울이고 PBS를 폐기하십시오.
    7. 샘플을 Prehybridize : 60 품어 ° 최소한 1 시간 동안 1.8 ML의 하이브리드화 믹스의 인버터에 C. 85 ° C 나중에 사용하기 위해 IsoTemp 열 블록을 설정합니다.
      1. 일시간이 nears으로, 85에서 부화하여 변성 연어 정자 DNA (Invitrogen 고양이 번호 15632-011) ° 10 분 C. 사용 전까지 얼음 설정합니다.
    8. prehybridization 최소 1 시간 후, 200 μL 변성 ssDNA 각 샘플을 발굴 - 레이블 riboprobe 약 100ng를 추가합니다. 60 ° C 하이브 리다이 제이션 오븐에에서 하룻밤 잡종.
    9. 2 ML 2X SSC와 하이브리드화 믹스를 교체합니다. 37 IsoTemp 열 블록을 설정 ° C와 70 ° C 나중에 사용하기 위해.
      1. 2X SSC X 10 분과 씻으십시오. @ 60 ° C 하이브 리다이 제이션 오븐 인치
      2. 2X SSC X 10 분과 씻으십시오. @ 60 ° C 하이브 리다이 제이션 오븐 인치
      3. 2X SSC X 10 분과 씻으십시오. @ 60 ° C 하이브 리다이 제이션 오븐 인치
      4. 2X SSC X 60 분과 씻으십시오. @ 70 ° C IsoTemp 열 블록에.
      70 ° C는 내생 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 활동을 제거합니다. 이것은 아마도 배경을 줄이는 방향으로 가장 중요한 단계입니다. 부품 (D는) 2 30 분에 고장 수 있습니다. 조직의 손상을 최소화하기 위해 씻는다.
    10. PBS X 5 분 함께 씻으십시오. RNase에게 나중에 사용하기 위해 얼음에 효소를 녹여.
    11. PBS를 교체하고 RNase 효소 1.0 μL (Fermentas EN0531 10mg / ML) × 60 분을 추가합니다. @ 37 ° C IsoTemp 열 블록 (프로브가 높은 농축 경우 90 분. 잠복기가 좋습니다) 인치
    12. PBS / RNase A를 취소하고 4 번 씻으십시오.
      1. 1X 세척 솔루션 X 10 분.
      2. 1X 세척 솔루션 X 10 분.
      3. 1X 세척 솔루션 X 10 분.
      4. 1X 세척 솔루션 X 60 분. @ 70 ° C IsoTemp 열 블록에.
    13. 1 시간 1X 블록 버퍼에 품어.
      1. 이때, 블록 버퍼의 2.0 ML 및 샘플 당 1 μL (1:2000) 안티 Digoxigenin 항체를 준비합니다. 간략 반전과 4에 앉아 보자 ° C를 사용까지.
    14. 1 시간 폐기 블록 버퍼 후 및 샘플 2.0 ML 사전 흡수 블록 버퍼 + 항체를 추가합니다.
    15. 밤새 품어.
    16. 블록 솔루션을 폐기하십시오.
    17. 1X 세척 버퍼로 씻으십시오.
      1. 1X 세척 버퍼 X 5 분.
      2. 1X 세척 버퍼 X 5 분.
      3. 일시간 X 5-6 변경 1X 세척 버퍼.
    18. 하룻밤 1X 세척 버퍼로 씻으십시오.
    19. 1X detectio와 린스10 분 N 버퍼.
    20. 잘 판에 검출 버퍼에 샘플을 전송합니다.
    21. 버퍼를 제거하고 원하는 신호 강도가 (이상 프로브와 함께이 하룻밤 사이에있을 수도 있음을 의미) 취득까지 BM 퍼플 (로체 11,442,074,001)로 감지합니다. BM 보라색은 호일이나 상자 밝은 민감한 커버입니다.
      • 잘 사용하기 전에 BM 퍼플을 섞는다.
      • 샘플은 무료 부유하고 우물에 붙어하지 않는 것이 있는지 확인합니다.
      • 일시간 이후에 신호를 확인하십시오.
    22. 웰스 X 5 분 안에 1X 감지 버퍼로 샘플을 씻어.
    23. 4 4퍼센트 PFA ° C.에 이미지 또는 저장 샘플

    * 샘플은이 단계에서 몇 군데 및 / 또는 immunohistochemistry 단계 이후 (아래 부 3) 추가하실 수 있습니다.

    솔루션 :

    • Nuclease 무료로 물 : 1L 살균 ultrapure의 물을 혼합 1 ML DEPC (시그마)를. 압력솥.
    • 1X PBS : 1L nuclease 무료 물 필터에 믹스 한 봉지 PBS (시그마)는 소독.
    • 1X 와시 솔루션 : 믹스 450 ML nuclease 무료 물 + 50 ML 10X 씻어 솔루션과 필터 소독.
    • 하이브 리다이 제이션 믹스 : 볼륨 (25 ML)에 의해 50 % 포름 아미드, 볼륨에 의해 50% 2X SSC (25 ML), 질량에 의해 6퍼센트 dextran 황산 (3G).
    • 1X 감지 버퍼 : 믹스 50 ML 검출 10X 버퍼 450 ML nuclease 무료 물 필터는 소독.
    • 1X 블록 버퍼 : 5 ML 10X Maleic 산성 버퍼 (로체 버퍼 세트), 40 ML nuclease 무료 물, 5 ML 10X 블록 버퍼.
    • 2X SSC : 믹스 50 ML 20X SSC 450 ML nuclease 무료 물 필터 소독.
    • 등급 메탄올 : nuclease 75 % 무료로 물, 50 %, 25 %의 농도로 100 % 메탄올을 희석.

    3. Immunohistochemistry

    부품 2가 완성된 경우에는 1 단계와 2 단계는 생략할 수 있습니다. 이 경우, 모든 글리세롤 또는 기타 설치 매체가 씻어되었는지 확인합니다. 모든 항체가 여전히 proteinase K의 소화 후 자신의 에피토프를 감지할 수있게됩니다. 우리는 그들이 (표 2 참조) 자신의 특이성을 유지 등 포유 동물 조직의 현장 하이브리드화에서 함께 사용할 수있는 항체의 짧은 명단이있다.

    1. lipophilic 염료의 조직 (파트 2의 효과에 완료되지 않은 경우)를 제거하기 위해 등급 에탄올 시리즈 :.. 50 % 에탄올 5 분, 70 % 에탄올 5 분, 95-100% 에탄올은 하룻밤 혹은 필요에 따라 원하는 효과 70 % 에탄올 5 할 때까지 분., 50 % 에탄올 5 분.
    2. 점차적으로 5~10분에 PBS를 추가하여 Rehydrate.
    3. 2.5 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 쉐이크에서 0.5 % 트리톤 X - 100 @ RT에서 1 시간을위한 조직을 차단합니다.
      (1:1 5 % NGS : 1.0 % 1X PBS에서 TritonX - 100)
    4. 블록 솔루션을 흔드는에 48-72 시간 @ 4 ° C에서 희석 기본 항체 (S)와 부화.
    5. 1 시간 × 3 변경 내용을 PBS로 씻으십시오.
    6. 3 단계에서와 같이 블록.
    7. 12 - 24에 대한 차단 용액에 희석 보조 항체 (S)와 함께 품어 @ 4 ° C 쉐이크에 (Invitrogen에서 알렉사 플루어 ®의 염료가 사용되었다).
    8. 5 단계로 씻으십시오. (옵션 :.. 카운터 첫번째 세척이 10mg / PBS에 ML 주식 1:2000 1 시간과 함께에 따라 희석으로 얼룩 Hoechst와 얼룩 핵 PBS X 2-3 변경 쉐이크에서 @ RT로 씻는다)
    9. 이미징 : 표본이 우선적으로 해결을위한 추가 공촛점 이미징 시스템을 사용, 전송 및 epifluorescent 현미경 모두이 단계에서 몇 군데하실 수 있습니다. 이 작업을 수행하려면 우리는 일상적으로 스페이서로 coverslips를 사용하여 글리세롤의 전체 마운트 귀를은 조직의 압축을 통해 방지할 수 있습니다. 대신이 모든 마운트 이미지를 추가하거나, 표본은 에폭시 수지에 포함된 수 있으며, 추가 histological 대한 자세한 내용은 순차적으로 sectioned. 통합 전체 마운트 / 섹션 분석의 혜택을, 공촛점 이미징 단계에서 형광 신호를 표백하지 마십시오.

    솔루션

    • 에탄올 솔루션 : 50 % 및 70 % 최종 농도로 증류수에 희석 100 % 에탄올.
    • 차단 솔루션 : 1시 1분 희석 5 % NGS : 1.0 % 1X PBS (최종 작업 농도 : 2.5 %의 NGS, 0.5 % TritonX - 100)에 TritonX - 100.
    • 1X PBS : 1L 증류수에 혼합 한 PBS 패킷 (시그마).
    • 5 % NGS : 해동 2.5 ML의 NGS와 47.5 ML 1X PBS로 섞는다. 4 스토어 ° C.
    • 1.0 % TritonX - 100 : 혼합 49.5 ML 1X PBS와 0.5 ML TritonX - 100 (1 시간 동안 섞어 쉐이크 @ RT에두고). 4 스토어 ° C.
    • Hoechst 얼룩 재고 솔루션 : 1X PBS의 밀리리터 당 10mg Hoechst 염료를 해산.
    표 2. 그 proteinase K 소화 조직에서 작동 항체.
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    25-6791 안티 - 마이 오신 - VI Polyclonal 프로 테우스 Biosciences
    9661 죽습 Caspase - 3 Polyclonal 세포 신호
    T7451 안티 Acetylated Tubulin의 Monoclon알 시그마
    PRB - 238C polyclonal Prox1 Covance

    4. 조직학

    조직학 그러한 청소년 두뇌 또는 부품 2 또는 3의 완료 후에 두꺼운 전체 마운트에 추적 lipophilic 염료의 해상도를 높이기 위해 제 1 부 이후에 도입하실 수 있습니다. 시리얼 두뇌 섹션 위해 우리는 균일 섹션 두께를 얻기 위해 Compresstome VF - 700 마이크로톰을 (Precisionary 인 스트 루먼트 주식 회사, 그린빌, 노스 캐롤라이나)하는 것이 좋습니다. 냉동 섹션 인해 sectioning 처리 3 중 큰 염색 누출에 덜 최적입니다. 전체 마운트 또는 표면 마운트 관심의 조직 영역의 적절한 시각화를 허용하지 않는 경우 시리얼 섹션의 준비와 글리세롤 4 장착은 조직 준비 선호하는 방법입니다. 조직은 또한 이후 에폭시 수지에 포함된과 TEM에 대한 유리 또는 다이아몬드 나이프를 사용하여 1-2 μm의 두께로자를 수 있습니다. 그들은 알코올과 에폭시 수지에 용해으로이 기법을 사용하면 대부분의 immunofluorescence 남아 플라스틱 삽입 후 더욱 안정되며, 그러나 모든 lipophilic 트레이싱은 전적으로이 단계에서 손실됩니다. 그들이 임베디드 때까지 샘플 빛이 민감한되므로주의하십시오.

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    에폭시 퍼가기 / Sectioning :

    1. 고정 : 하루에 1 시간 0.1M 인산 버퍼에 2.5 % 글루 테르 알데히드 / 1% PFA (산도 7.4).
    2. 30 % 에탄올 (5min.), 50 % 에탄올 (5min.), 70 % 에탄올 (야간에 5min.), 95 % 에탄올 (5 배 10 분 각각). 그리고 절대 에탄올 (5 배 10 분 : 유리 샘플 유리 탈수 조직에서 . 각).
    3. 솔벤트 전환 : 1시 1분 절대 에탄올 : 5 분 프로필렌 옥사이드 (PO).
    4. 솔벤트 : PO에만 5 배 10 분. 각.
    5. 수지로 침투 :
      1. 1시 1분 PO : 쉐이크에 수지 하룻밤.
      2. 평면 포함 주형으로 샘플과 솔루션 (들)을 붓고 및 PO 증발시키는 카운터 4-6 시간을 두십시오. 또는, 병을 뚜껑을 제거하고 4 시간 (큰 조직과 잘 작동합니다)에 대한 쉐이크에 둡니다.
      3. 4 시간 100 %의 수지에 샘플을 전송합니다.
    6. 레이블을 사용하여 최종 금형에 수지에 삽입할 수 있습니다. 24-48시간 60 ° C에서 잠복기에 의해 중합.
    7. 관계없는 수지를 최소화하기 위해 필요에 따라 면도날로 블록을 잘라 버릴거야. Ultramicrotome (Ultracut E 레이처트 - 정가 사용되었다)에 1-2 음 시리얼 섹션 컷. 마운트 및 epifluorescent 현미경을 사용하여 이미지.
      옵션 : histological 얼룩과 섹션의 일부 (예 : Stevenel의 파란색) 스테인 원하는 경우 (immunofluorescence 이러한 섹션에 지속되지 않습니다 실현).

    솔루션

    • 에탄올 솔루션 : 30 %, 50 %, 70 %, 및 95 %의 농도로 증류수에 100 % 에탄올을 희석.
    • 고정 솔루션 : 믹스 2.5 ML 50 % 글루 테르 알데히드, 5 ML 10 % Paraformaldehyde, 그리고 42.5 ML 0.1M 인산염 버퍼 산도 7.4 (최종 농도 : 2.5 %의 글루 테르 알데히드; 4% PFA). 4 스토어 ° C.
    • 에폭시 수지 : 폴리 / 침대 812 퍼가기 Media/DMP-30 키트 (Polysciences 주식 회사 # 08792-1)과 함께 제공된 지시에 따라합니다. -20 ° C.에 저장

    5. 대표 결과

    그림 2
    그림 2. 마우스 배아의 Lipophilic 염색 배치 및 이미징. 세 가지 파장 lipophilic 염료가 주입 및 삼차 신경 (TN), glossopharyngeal 신경 (GN), 그리고 미주 신경 (VN) 중앙 예측의 시각화를 허용하도록 incubated했다. ) 3 두개골 신경의 주변 부분에 Lipophilic 염료 배치는 중앙 프로세스의 시각화를위한 brainstem에 보급을 허용합니다. NeurVue 마룬하고, VN : NeuroVue 자드 TN은 NeuroVue 빨강, GN와 함께 표시됩니다. (A) 후 부화 같이 B) 같은 마우스. 일부 확산은 브라이트 현미경과 함께 볼 수 있습니다. C) 동일한 마우스처럼 (A와 B). hindbrain는 해부와 평면 탑재되었습니다. 표시된 세 가지 신경의 핵심 프로세스 중 일부 라벨은 브라이트 현미경과 함께 볼 수 있습니다. (C)의 D) 공촛점 이미지. 공촛점 특정 뉴런의 사용이 볼 수로, 그리고 세 가지 염료의 사용은 다른 관련하여 각 인구 분포의 평가를 위해 수 있습니다. 염료는 순차적으로 몇 군데 있었다. NeuroVue 자드는 488 nm의 및 배출 500-550 nm의의 여기에서 몇 군데했다. NeuroVue 레드는 535 nm의 및 배출의 여기 550-600 nm의에서 몇 군데했다. NeuroVue 마룬은 643 nm의 및 650-700 nm의에서 방출의 여기에서 몇 군데했다.

    그림 3
    그림 3. 실험의 도식 개요. 귀는 모든 구조의 시각화 수 있도록 노출됩니다. Lipophilic 염색은다음 주입 및 확산 수있었습니다. 확산 이후 뚜렷한 인구의 연결은 서로 다른 염료로 분류 볼 수 있습니다. 다음 현장의 하이브리드화에서 (sox2) 귀 및 라벨의 mRNA 발현에 수행됩니다. Immunohistochemistry은 다음 단백질 발현을 시각화 (Myo7, Tubulin) 수행됩니다. 원위치 하이브리드화과 immunohistochemistry에 모두 시각 수있는 histological 섹션으로 따라갔다.

    Discussion

    이 비디오에서는, 우리는 주어진 동물 내의 데이터 (그림 3)를 연관하여 데이터 수집 및 cohesiveness을 극대화하기 위해 네 개의 기술을 결합하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 번식의 양을 줄일 수 및 공동 현지화 및 돌연변이의 상호 영향에 대한 정보를 개선하면서 따라서 시간이 획기 데이터를 얻기 위해 필요했습니다. 배아 생쥐이 동영상, 성인 마우스뿐만 아니라 닭고기, xenopus 및 zebrafish 같은 다른 동물에서 널리 사용 되었으나뿐만 아니라 이러한 기술을 사용하여 분석하실 수 있습니다. 다른 종을 사용하는 경우 proteinase K는 소화 변경해야 할 수도 있습니다. 우리가 특별히 관심을 세 가지의 연결 인구 최대 라벨 다른 fluorescing NeuroVue의 염료를 사용합니다. 이 염료의 장점들은 단독 또는 분석하기 위해 돌연변이에 의해 영향을받을 수도 있고받지 않을 수도 있습니다 immunohistochemistry에 의존하면 문제가있을 수 있습니다 돌연변이 생쥐에서 사용할 수 있으며, 그들은 retrogradely 및 anterogradely 5 뉴런 레이블을. 최근 연구는 또한 6 2 동시에 표시 수있는 신경 세포의 인구의 수를 증가하고 있습니다. 후, 관심 같은 조직을 추적 ​​lipophilic 염료는 다음 유전자 전사의 분석, 현장 하이브리드화 사용하여 분석할 수 있으며, 이후 단백질 배포 immunohistochemistry를 사용하여 분석하실 수 있습니다. 후자 분석 표현형 특성화 6 추가할 수 있습니다 자세한 조직학에 의해 보충 수 있습니다. 이 multifactorial 분석 달리 황당한 또는 적어도 더 광범위한 프로토콜과 마우스 번식을 필요로 할 수있는 동일한 동물 사이 상호 분석을 통해 새로운 통찰력을 얻을 수있는 가능성이있다.

    Disclosures

    마우스 조직은 아이오와 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 (ACURF 0,804,066)에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수집되었다.

    Acknowledgements

    공촛점 이미지는 이미징을 위해 아이오와 카버 센터의 대학에서 취득했다. 기금이 프로젝트에 대한 쥐를 번식 BF 추가 지원하는 SBIR 그랜트 (MH079805)에 의해 제공된는 BF에 NIDCD (5R01DC00559007)에 의해 제공된

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    in situ Hybridization:
    PC DIG wash + block buffer set Roche Group 1585762
    Premix 20x SSC Buffer Roche Group 1666681
    Proteinase K 20mg/ml Ambion AM2546
    Diethyl Pyrocorbonate (DEPC) Research Products International Corp. D43060
    Formamide Sigma-Aldrich F9037
    Dextran Sulfate Research Products International Corp. D20020
    BM Purple Roche Group 11442074001
    Anti-Dig-AP Fab fragments Roche Group 11093274910
    RNase A enzyme 10mg/ml Fermentas EN0531
    RNase Away Research Products International Corp. 7003
    Salmon Sperm DNA 10mg/ml Invitrogen 15632-011
    Stericup Filter Unit 0.22μm; 500ml EMD Millipore SCGVU05RE
    Filter Discs 0.2μm; 25mm Whatman, GE Healthcare 6780-2502
    Phosphate buffered saline PH 7.4 packets Sigma-Aldrich P-5368
    Immunohistochemistry:
    Goat Serum Sigma-Aldrich G9023
    Triton X-100 Sigma-Aldrich T8532
    H–chst Dye Polysciences, Inc. 9460
    Histology:
    Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit Polysciences, Inc. 08792-1
    Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205
    Gluteraldehyde Solution 50% Fisher Scientific G151
    DPX Mountant Fluka 44581
    Rocker MidSci 55D1114
    Heat Block Fisher Scientific 11-715-125D
    Rotator Thermo Fisher Scientific, Inc. 400110Q
    Incubator set to 60° Fisher Scientific 11-690-625D
    Dye tracing:
    Microscissors Geuder G-19775
    Fine Forceps E.M.S 72680-F
    NeuroVue dye: Maroon, Red, Jade MTTI FS-100(1,2,6)
    1X phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P-5368
    Dissecting scope Leica Microsystems M205 FA
    Incubator set to 36° Fisher Scientific 11-690-506DQ
    Confocal Microscope Leica Microsystems LSM 510
    Slides Surgipath 00240
    Coverslips Surgipath 00106
    RPI Glycerol G22025-0.5
    Paraformaldehyde (4% and 0.4%) Fisher Scientific T353-500

    References

    1. Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes. Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).
    2. Tonniges, J. Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing. Journal of Microscopy. (2010).
    3. Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis. J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).
    4. Gurung, B., Fritzsch, B. Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection. J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).
    5. Fritzsch, B., Nichols, D. H. DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice. Hear Res. 65, 51-60 (1993).
    6. Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea. PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).

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