어쿠스틱 막 Microparticle 기술을 사용하여 개발 사용자 지정 중국어 햄스터 난소 - 숙주 세포의 단백질 Assays

Bioengineering
 

Summary

복잡한 매트릭스에서 더 민감한, 재현성, 자동 검색 결과에 대한 바이브 플랫폼에서 사용자 정의 assays의 개발을 설명합니다. 유니버설 카트리지는 assays 쉽게 사용자 정의 assays 사용하기 위해 적응 수 있습니다. 이 다재 다능한이 소설 assays 본 동영상에 exemplified 기존의 수동 assays의 자동 버전의 신속한 개발 및 검증이 가능합니다.

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Dickerson, M., Leong, K., Sheldon, K., Madison, L. Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology. J. Vis. Exp. (48), e2493, doi:10.3791/2493 (2011).

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Abstract

독특한 단백질에 대한 사용자 정의 assays은 종종 시간이 많이 걸리는 수동 검색 및 엘리사 또는 대체 플랫폼 개발의 복잡으로 인해 서양 blots로 quantitation 기술로 제한됩니다. BioScale의 독점 음향 막 MicroParticle (AMMP) 기술은 더 나은 감도, 재현성 및 자동 작동을 제공 샌드위치 immunoassays 쉽게 바이브 플랫폼에서 사용하기 위해 개발된 수 있습니다. 예를로 제공,이 프로토콜은 사용자 정의 중국어 햄스터 난소 - 숙주 세포의 단백질 (CHO - HCP) 분석을 개발하기위한 절차를 설명합니다. 여기에 설명된 일반 원칙은 immunoassays의 다양한 발전을 위해 다음 수 있습니다.

계산하는 센서 표면에 microparticles의 바인딩에 의한 진동 주파수의 변화를 측정하여 AMMP 분석 측정 항원 농도. 그것은 네 개의 주요 컴포넌트로 구성되어 있습니다 : 기능화 팔 센서 칩이 포함되어 있습니다 (1) 카트리지 (2) 항체 라벨 자기 microparticles, 기능화 칩의 표면 (4)의 항원을 포함하는 샘플에 바인딩 (3) hapten 태그 항체 관심. BioScale의 바이오 센서는 별도의 유체 경로의 8 각 세포막을 포함하는 공진 장치입니다. 점막 대량의 표면에 축적이 주파수 변경이 추가 대량의 금액을 quantitate하는 데 사용됩니다에 대한 응답으로 진동 주파수를 변경합니다.

센서 방지 hapten 항체로 작용합니다 immunoassays의 다양한 사용을 촉진합니다. 검정 특정 항체 한 항체 및 다른 비오틴에 hapten 태그의 공유 결합 활용을 통해 수정할 수 있습니다. 비오틴 레이블은 hapten - 태그 항체와 함께, 샌드위치에서 analyte를 캡처하는 데 사용됩니다, 결합 자기 구슬을 streptavidin 수있는 항체를 바인딩하는 데 사용됩니다. 단지 anti-hapten/hapten 상호 작용을 통해 칩을에 바인딩합니다. 각 분석의 끝에 센서가 96 - 웰 플레이트에서 열 순서 분석을 가능하게 희석 염산과 청소됩니다 실행합니다.

여기, 우리는 bioprocess 개발을위한 사용자 정의 CHO - HCP AMMP 분석을 개발하는 방법을 제시한다. AMMP의 assays을 개발하거나 AMMP assays로 기존의 assays를 수정하는 것은 복잡한 샘플 및 감소 연산자는 시간에 더 나은 성능 (재현성, 감도)를 제공할 수 있습니다. 프로토콜 개발을위한 단계를 보여줍니다 및 토론 섹션 대표 결과를 검토합니다. 분석 최적화 및 사용자 정의 매개 변수의보다 깊이 설명 BioScale에 문의하십시오. 이 키트는 잔여 단백질, 제품 titer, 그리고 CHO - HCP와 같은 일반 bioprocess 개발 assays을 제공합니다.

Protocol

1. MicroParticle 준비

  1. 비오틴 NHS 화학을 사용하여 레이블 항체
  2. Biotinylation의 정도 결정
  3. Biotinylated 항체와 공액 Streptavidin 비즈
    1. 1~2분에 대한 vortexing하여 원래의 약병에 비즈를 Resuspend
    2. microcentrifuge 관으로 나누어지는 구슬 원하는 볼륨을
    3. 비즈에게 PBST로 3 회 씻어 :
      1. 이분에 대한 자석에 구슬이 들어있는 튜브를 배치
      2. 자석에 튜브로 흡인하여 표면에 뜨는를 제거합니다. 구슬을 방해하지 않도록주의
      3. 자석에서 튜브를 제거하고 1 ML의 PBST를 추가
      4. 구슬을 resuspend 20 초 소용돌이
      5. 뚜껑에서 비즈를 제거하는 5 초 동안 원심 분리기
      6. 두 번 더 2.3.1-2.3.5를 반복
    4. 자석에 세 번째 세척 장소 관 후 PBST를 기음
    5. 비즈로 biotinylated 항체를 추가하고 resuspend
    6. 필요한 경우하는 것이 PBS 300 μL에 biotinylated 항체의 볼륨을 가져 오십시오. 항체 볼륨이 이미있다면 큰 300 μL는 PBS를 추가하지 마십시오
    7. 와동 흔드는 또는 튜브 회전에서 RT 30 분 비드 / 항체 서스펜션을 품어
    8. 3 단계에서와 같이 PBST로 3 번 씻으십시오.
    9. biotinylated BSA와 구슬 블럭
      1. 세번째 세척이 10 μg / MG biotinylated BSA를 추가 후, PBS 필요한 경우 300 μL로 볼륨을 조정하고, 30 분 동안 교반과 부화
    10. 3 단계에서와 같이 PBST로 3 회 씻어
    11. PBS/0.05 %의 BSA 100 μL에 비즈를 Resuspend. 나트륨 azide는 장기 보관을 위해 추가할 수 있습니다
  4. 표준 NHS 플루오레신 프로토콜을 사용하여 탐지 항체를 fluoresceinate
  5. Fluorescination에 노출된 정도를 확인하는

2. HCP - 개발

  1. 작업 솔루션을 준비 :
    1. 플루오레신 표시된 항체 (층 - AB) : 대부분의 CHO - HCP assays 400 NG / ML의 최종 농도에 층 - AB를 사용합니다. 층 - AB가 최종 분석 볼륨의 ¼로 추가됩니다 따라서 작업 솔루션의 농도는 1.6 μg / ML입니다. BioScale 비드 / FlAb 희석제와 함께 FlAb 주식을 diluting하여이 솔루션을 준비합니다.
    2. 비즈 : 대부분의 CHO - HCP assays은 2x10 5 구슬 / ML의 최종 농도에 구슬을 사용합니다. 비드 시약은 최종 분석 볼륨의 ¼을 구성하므로 작업 솔루션의 농도 5 구슬 / ML 8x10입니다. BioScale 비드 / FlAb 희석제와 비드 주식을 diluting하여이 솔루션을 준비합니다. 와동 확실히 모든 비즈 있도록 잘 구슬 주식 사전 나누어지는를 제거하기 위해 중지되어 있습니다.
    3. 버퍼를 실행 : 실행중인 버퍼의 구성은 그러나 몇 가지 CHO - HCP assays가 10 MM의 HEPES 버퍼, 1 % 트윈, 산도 7.5를 사용하여 개발되었습니다, 분석을 개발하는 데 사용되는 항체에 최적해야 할 수 있습니다. BioScale 사용하기 전에 1 % 농도로 버퍼에 추가됩니다 실행중인 버퍼 (개발 키트와 함께 제공된)에 첨가제를 개발하였습니다.
  2. BioScale 샘플 희석제와 calibrators 및 샘플을 희석.

3. 분위기 시스템 설정

  1. 의 분위기 워크 스테이션 턴
  2. 시스템 공급 및 폐기물을 연결
  3. 프라임 시스템
  4. 분위기 카트리지를 삽입
  5. 루트 튜브에게
  6. "샘플 설정"이라는 시트를 작성하여 분석 템플릿을 준비합니다. BioScale 각 바이브 워크 스테이션 분석 한 분석 템플릿을 가지고 기능을 제공합니다. 이것은 사용자가 실험의 완전한 기록을 유지 다른 assays에 대한 템플릿의 "주의 사항"시트에서 특정 노트를 편집하고 저장할 수 있습니다.
  7. 초기 분석 템플릿은 설정 : "예제 설정"시트의 분석에 기준의 농도 범위의 테이블 (왼쪽 상단 모서리)를 작성하여 시작합니다.
  8. 다음 긴 샘플 부화 필요한 방법 바이브 워크 스테이션을 지시하기 위해 표준의 오른쪽 (단순 칼럼 읽기 설정, 하나 시약 추가하고 두 시약 추가 설정)을 테이블에 추가 정보를 입력, 얼마나 시약의 부피가 전송하는 것입니다 , 샘플 축적되어야 얼마나 오래, 그리고 센서 컨디셔닝 및 프로브 및 카트리지의 오염 제거가 필요한지 여부 등
  9. 접시 레이아웃을 작성하십시오.
  10. 접시에 샘플 / 시약을로드합니다. 느낌이 시약 판에 필요한 볼륨을 제공합니다. 샘플 볼륨은 다양하지만, 120 μL의 총 분석 볼륨의 절반에 좋은 시작 장소입니다 수 있습니다.
  11. 플레이트 커버를 적용합니다. 워크 스테이션 데크에 번호판을로드합니다.
  12. 마법사를 시작 분석을 실행 마법사를 통해 이동하여 분석을 시작합니다.

4. 대표 결과

그림 1
그림 1 : AMMP 샌드위치 면역 분석법 분위기 워크 스테이션에서 AMMP 분석은 항원 농도를 측정합니다. 시그널은 비드 - 항원 - 항체 hapten이 hapten / 안티 - hapten 상호 작용을 통해 센서에 바인딩 할 때 측정됩니다. 중생은 면역 단지를 제거하여 처음 상태로 다시 센서를 제공합니다.

그림 2
그림 2 : CHO - HCP AMMP 분석 교정 곡선

그림 위에 2 CHO HCP AMMP 분석 교정 곡선의 예입니다. 분석은 높은 정밀도와 재현성있는 반응기를 포함하여 정화 스트림 전역에서 표본으로 수행할 수 있습니다.

그림 3
그림 3 : 단백질 AMMP 분석 교정 곡선

그림 3은 느낌 잔여 단백질 어세이 키트와 함께 수행 잔여 단백질 AMMP 어세를위한 보정 곡선입니다. 동일한 키트는 30 분 잠복기와 빠른 분석, 또는 일반적으로 동급 엘리사의 사용자가보다 나은 둘 중 정밀도 또는 정확성의 손실없이 긴 잠복기와 더 민감한 결과와 넓은 다이나믹 레인지에 사용할 수 있습니다 ' 손

그림 4
그림 4 : 제품 Titer AMMP 어세이

분위기 워크 스테이션 또한 제품 Titer 분석, 그림 4에 표시된 결과를 사용할 수 있습니다. 다른 AMMP의 Assays 다르게 수행,이 분석은 단순 희석, 또는 구슬보다 샘플 치료가 다른가 필요하지 않으며, quantitation는 viabilities 광범위한 이상 만 10 개 이상의 세포를 포함하는 "아니오 스핀"샘플로 확인되었습니다.

그림 5
그림 5 : GST - Gadd34 biomarker 분석을위한 AMMP 분석 표준 곡선

분위기 BioAnalyzer (패널) 또는 재조합 GST - Gadd34를 사용하여 AlphaScreen 기술로 얻은 신호의 표준 곡선은 그림 5에 표시됩니다. 바이브 플랫폼 결과가 동일한 항체를 사용하여보다 민감한 약 로그되었습니다. AMMP 아직 적은 큰 입자 솔루션 위상 캡처 및 감지 복잡한 형성에서 여전히 혜택의 측정을 활용합니다.

그림 6
그림 6 : 종양 샘플에서 GST - Gadd34에 대한 AMMP 분석 표준 곡선

그림 6에서 CWR22 xenografts에서 Gadd34의 유도는 느낌 BioAnalyzer (패널 A) 또는 AlphaScreen (패널 B)에 의해 분석으로 boronate proteasome 억제제의 존재 또는 부재에서 테스트되었습니다. 바이브 플랫폼 AlphaScreen 신호 반면, 생체내 종양 xenografts에있는이 단백질의 증가 μg로 침묵했다에 민감한, 재현성 결과를 얻을 수있었습니다.

이 예제는 매우 복잡한 샘플의 AMMP 기술의 파워를 보여줍니다. 칩 근처 자석의 민감한 감지 칩과 높은 효율성으로 인해, 자기 microparticles의 낮은 숫자는 효율적이고 reproducibly lysed 세포 (용해 시약 포함) 및 혈액 파편의 복잡 가운데 낮은 풍부한 대상에 대한 청소하실 수 있습니다.

Discussion

상기 예제는 복잡한 샘플에 AMMP의 고감도 정량 결과를 보여줍니다. 시스템에 시약 서식의 용이성 및 제어 기능을 통해 전달이 성능, 다양한 어플 리케이션을 위해 사용됩니다. 이러한 응용 프로그램은 종양의 Gadd34에서와 같이, 대상에 대한 구체적으로, 또는 정화 스트림을 교차 샘플에 숙주 세포 단백질 감지 및 quantitation에서 표적의 스펙트럼에 대한 일반적인 수 있습니다. 매우 유연한 AMMP와 결합된 낮은 오버헤드 바이브 플랫폼은 중요한 assays를 전달하기위한 강력한 도구를 제공합니다.

Disclosures

이 문서의 저자는이 문서에서 사용되는 악기와 시약의 일부를 생산 Bioscale, 병원에서 근무하고 있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads BioScale (10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes New England Biolabs cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent BioScale to dilute beads and FlAb
Sample Diluent BioScale to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive BioScale

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