Desenvolvimento personalizado Ovário de Hamster Chinês hospedar-Cell ensaios de proteína utilizando a Tecnologia micropartícula Acústico Membrana

Bioengineering
 

Summary

Desenvolvimento de ensaios personalizado na plataforma ViBE para mais sensíveis, reprodutíveis, os resultados automatizados em matrizes complexas é descrito. O cartucho universal permite ensaios para ser facilmente adaptadas para uso com ensaios personalizado. Esta versatilidade permite o rápido desenvolvimento e validação de ensaios de romance ou versões automatizada de ensaios existentes manual, exemplificado neste vídeo.

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Dickerson, M., Leong, K., Sheldon, K., Madison, L. Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology. J. Vis. Exp. (48), e2493, doi:10.3791/2493 (2011).

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Abstract

Ensaios personalizado para proteínas específicas são muitas vezes limitadas ao tempo de detecção manual de consumir e as técnicas de quantificação, tais como ELISA ou Western blot, devido à complexidade do desenvolvimento em plataformas alternativas. Proprietários BioScale de Membrana acústica micropartículas tecnologia (AMMP) permite imunoensaios sanduíche para ser facilmente desenvolvidos para uso na plataforma ViBE, proporcionando uma melhor sensibilidade, reprodutibilidade e operação automatizada. Fornecido como um exemplo, este protocolo descreve o procedimento para o desenvolvimento de um costume chinês Hamster Proteína de Célula Ovário-Host (CHO-HCP) ensaio. Os princípios gerais aqui delineados podem ser seguidas para o desenvolvimento de uma ampla variedade de imunoensaios.

AMMP um ensaio concentração do antígeno medidas medindo mudanças na freqüência de oscilação causada pela ligação de micropartículas à superfície do sensor de calcular. É composto de quatro componentes principais: (1) um cartucho que contém um chip sensor funcionalizados oito (2) anticorpo marcado micropartículas magnéticas, (3) anticorpo hapteno marcado que se liga à superfície do chip funcionalizados (4) amostras contendo o antígeno de interesse. BioScale biosensor é um dispositivo ressonante que contém oito individuais com membranas separadas caminhos fluídico. As membranas alterar a freqüência de oscilação em resposta a massa acumulando na superfície e essa mudança de freqüência é usada para quantificar a quantidade de massa adicionada.

Para facilitar o uso em uma ampla variedade de imunoensaios o sensor é funcionalizada com um anticorpo anti-hapteno. Anticorpos específicos ensaio são modificados por meio da conjugação covalente de um tag hapteno a um anticorpo e biotina para o outro. O rótulo biotina é usada para vincular o anticorpo para estreptavidina acoplado esferas magnéticas que, em combinação com o anticorpo hapteno-tagged, são usados ​​para capturar o analito em um sanduíche. O complexo se liga ao chip através da interação anti-hapten/hapten. No final de cada ensaio os sensores são limpas com um ácido diluído permitindo a análise seqüencial de colunas de uma placa de 96 poços.

Aqui, apresentamos o método para o desenvolvimento de um costume CHO-HCP ensaio AMMP para o desenvolvimento de bioprocessos. Desenvolvimento de ensaios AMMP ou modificar ensaios existentes em ensaios AMMP pode proporcionar um melhor desempenho (sensibilidade, reprodutibilidade) em amostras complexas e tempo do operador. O protocolo mostra os passos para o desenvolvimento ea seção de discussão opiniões resultados representativos. Para uma explicação mais aprofundada da otimização do ensaio e os parâmetros de personalização contato BioScale. Este kit oferece genéricos ensaios de desenvolvimento de bioprocessos, como proteína residual Um título do produto, e CHO-HCP.

Protocol

1. Preparação de micropartículas

  1. Anticorpos etiqueta com Biotina NHS Química
  2. Determinação do Grau de Biotinilação
  3. Beads conjugado estreptavidina com anticorpo biotinilado
    1. Volte a suspender as contas no frasco original em vortex por 1-2 minutos
    2. Alíquota o volume desejado de contas em um tubo de microcentrífuga
    3. Lave as contas 3 vezes com PBST:
      1. Coloque o tubo que contém as contas sobre o ímã por 2 minutos
      2. Retire o sobrenadante por aspiração com o tubo sobre o ímã. Tenha cuidado para não atrapalhar as contas
      3. Retire o tubo do ímã e adicionar 1 mL PBST
      4. Vortex por 20 segundos para voltar a suspender as contas
      5. Centrifugar durante 5 segundos para remover as contas da tampa
      6. Repita mais duas vezes 2.3.1-2.3.5
    4. Após a terceira lavagem lugar do tubo sobre o ímã e aspirar o PBST
    5. Adicionar anticorpo biotinilado para as contas e ressuspender
    6. Se for necessário reduzir o volume do anticorpo biotinilado até 300 mL com PBS. Se o volume de anticorpos é já superior a 300 mL não adicionar qualquer PBS
    7. Incubar a suspensão de esferas / anticorpo por 30 minutos em temperatura ambiente no agitador vortex ou tubo rotador
    8. Lavar 3 vezes com PBST como no passo 3.
    9. Bloco de contas com BSA biotinilado
      1. Após a terceira lavagem adicionar 10 mg / mg biotinilado BSA, ajustar o volume para 300 mL com PBS, se necessário, e incubar com agitação por 30 minutos
    10. Lavar 3 vezes com PBST como no passo 3
    11. Volte a suspender as contas em 100 mL de BSA PBS/0.05%. Azida de sódio pode ser adicionado para armazenamento a longo prazo
  4. Utilizando protocolos padrão NHS fluoresceína, o anticorpo fluoresceinate detector
  5. Determinar o grau de Fluorescination

2. HCP - Desenvolvimento

  1. Prepare soluções de trabalho:
    1. Anticorpo marcado com fluoresceína (Fl-Ab): A maioria dos CHO-HCP ensaios use Fl-Ab na concentração final de 400 ng / mL. O Fl-Ab é adicionado como ¼ do volume final do ensaio, por isso a concentração da solução de trabalho é de 1,6 mcg / mL. Preparar esta solução diluindo estoque Flab com BioScale Bead / Diluente flacidez.
    2. Contas: a maioria dos CHO-HCP ensaios use bolinhas em uma concentração final de 2x10 5 gotas / mL. O reagente talão constitui ¼ do volume final do ensaio, por isso a concentração da solução de trabalho é 8x10 5 gotas / mL. Preparar esta solução diluindo estoque talão com BioScale Bead / Diluente flacidez. Vortex do estoque talão bem para garantir que todas as contas estão em suspensão antes de remover uma alíquota.
    3. Execução Buffer: A composição do tampão de corrida pode ter que ser otimizado para os anticorpos utilizados para desenvolver o ensaio, no entanto várias CHO-HCP ensaios foram desenvolvidos utilizando tampão HEPES 10 mM, Tween 1%, pH 7.5. BioScale desenvolveu um aditivo para o tampão de corrida (fornecido com o kit de desenvolvimento), que é adicionado ao buffer para uma concentração de 1% antes do uso.
  2. Diluir os calibradores e amostras com Diluente de Amostra BioScale.

3. ViBE Sistema de Set Up

  1. Vire o Workstation ViBE em
  2. Ligue a fonte de sistema e resíduos
  3. Primeiro o sistema
  4. Insira um cartucho ViBE
  5. Rota dos tubos
  6. Prepare modelo de ensaio, preencha a folha chamada "Setup Amostra". BioScale fornece a capacidade de ter um modelo de análise para cada ensaio Workstation ViBE. Isto permite ao usuário editar e salvar notas específicas nas "Notas" da folha do modelo para diferentes testes de manter um registro completo do experimento.
  7. Modelo de teste de configuração inicial: Comece por preencher a tabela (canto superior esquerdo) da faixa de concentração dos padrões no ensaio da "Sample Setup" folha.
  8. Em seguida, insira informações adicionais na tabela à direita dos padrões (Setup Coluna Simples Read, Uma Adicionar reagente e dois setups Reagente Add) para instruir o Workstation ViBE como amostras longa necessidade de incubar, o quanto de volume de reagente deve ser transferida , quanto tempo a acumulação amostra precisa ser, e se condicionado sensores e descontaminação de sondas e cartucho são necessários, etc
  9. Preencha o layout da placa.
  10. Carga de amostra / reagentes em placas. O ViBE irá fornecer os volumes necessários para a placa de reagente. Volume de amostra pode variar, mas na metade de um volume de ensaio total de 120 mL é um bom lugar de partida.
  11. Aplicar cobre da placa. Placas de carga no convés em estação de trabalho.
  12. Executar o ensaio de arranque assistente, passar por assistente e iniciar ensaio.

4. Resultados representante

Figura 1
Figura 1: AMMP Imunoensaio Sandwich Numa estação de trabalho ViBE, um ensaio AMMP mede a concentração de antígeno. Sinal é medido quando o anticorpo-antígeno hapteno bead-liga-se ao sensor através do hapteno / anti-hapteno interação. Regeneração traz o sensor de volta ao estado inicial, removendo os complexos imunes.

Figura 2
Figura 2: CHO-HCP AMMP curva de calibração do ensaio

Figura 2 acima é um exemplo de uma AMMP HCP CHO curva de calibração do ensaio. Análise pode ser realizada em amostras de todo o fluxo de purificação, incluindo o reator com alta precisão e reprodutibilidade.

Figura 3
Figura 3: Proteína A curva de calibração AMMP Assay

Figura 3 é uma curva de calibração para uma proteína residual Um Ensaio AMMP, realizada com uma proteína VIBE Residual Um Kit de Ensaio. O mesmo kit pode ser usado para um rápido ensaio com um período de incubação de 30 minutos, ou para resultados mais sensível e maior gama dinâmica, com um período mais longo de incubação, sem perda de precisão ou precisão, sendo que ambos são normalmente melhor do que equivalentes ELISA em usuários mãos

Figura 4
Figura 4: Produto testes sorológicos AMMP Assay

O Workstation ViBE também pode ser usado para um ensaio de Produto testes sorológicos, os resultados mostrados na figura 4. Realizada de forma diferente Ensaios AMMP, este ensaio não necessita de tratamento da amostra que a diluição simples, ou grânulos, e quantificação foi verificado em "nenhum spin" amostras contendo mais de 10 milhões de células em uma ampla faixa de viabilidades.

Figura 5
Figura 5: AMMP curva padrão do ensaio para o ensaio GST-Gadd34 biomarcador

Mostrado na Figura 5 é uma curva padrão de sinal obtido pela Bioanalyzer ViBE (Painel A) ou Tecnologia AlphaScreen usando recombinante GST-Gadd34. Resultados na plataforma ViBE foram de aproximadamente um log mais sensível utilizando os mesmos anticorpos. AMMP utiliza a medição de menos partículas maiores benefícios ainda assim, desde a captura solução fase e formação do complexo de detecção.

Figura 6
Figura 6: Ensaio AMMP curva padrão para GST-Gadd34 em amostra de tumor

Na Figura 6, a indução de Gadd34 de CWR22 xenoenxertos foi testada na presença ou ausência de um inibidor de proteassoma boronato como analisado tanto pela Bioanalyzer ViBE (Painel A) ou AlphaScreen (Painel B). A plataforma ViBE foi capaz de produzir sensíveis, resultados reprodutíveis na in vivo xenoenxertos tumor enquanto o sinal AlphaScreen se apagou com o aumento mg de proteína.

Este exemplo mostra o poder da tecnologia AMMP em amostras altamente complexo. Devido ao chip de detecção sensível e de alta eficiência do ímã perto do chips, baixo número de micropartículas magnéticas podem de forma eficiente e reproduzível para limpar alvo baixa abundância em meio à complexidade de lisados ​​celulares (incluindo os reagentes de lise) e os restos de sangue.

Discussion

Os exemplos anteriores demonstram altamente sensível AMMP de resultados quantitativos em amostras complexas. Esse desempenho, quando entregues com a facilidade e controle de formatação reagentes para o sistema é propício para uma variedade de aplicações. Os pedidos podem ser específicos para um alvo, como em Gadd34 no tumor, ou genérico para um espectro de alvos, como na série de detecção e quantificação de proteínas de células em amostras que cruzam o fluxo de purificação. A plataforma ViBE baixo overhead combinado com AMMP altamente flexível fornece uma ferramenta poderosa para a entrega de ensaios críticos.

Disclosures

Os autores deste artigo são empregados por Bioscale, Inc, que produz alguns dos instrumentos e reagentes utilizados neste artigo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads BioScale (10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes New England Biolabs cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent BioScale to dilute beads and FlAb
Sample Diluent BioScale to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive BioScale

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