पूर्व आरोपण जेनेटिक निदान के लिए मछली

Medicine
 

Summary

यह आलेख एकल कोशिका मछली, blastomere नाभिक के लिए तकनीक के प्रसार, और स्वस्थानी संकरण में और संकेत स्कोरिंग, एक नैदानिक ​​सेटिंग में पूर्व आरोपण आनुवंशिक निदान (PGD) के लिए लागू के लिए उपयुक्त जांच के चयन का वर्णन करता है.

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Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis . J. Vis. Exp. (48), e2570, doi:10.3791/2570 (2011).

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Abstract

पूर्व आरोपण आनुवंशिक निदान (PGD) एक की स्थापना की प्रसव पूर्व निदान के लिए वैकल्पिक है, और सहायता प्रजनन प्रौद्योगिकी (एआरटी) द्वारा उत्पन्न काउहोट से पूर्व आरोपण भ्रूण का चयन शामिल है. यह चयन पारिवारिक monogenic रोग (जैसे सिस्टिक फाइब्रोसिस) की वजह से आवश्यक हो सकता है, या क्योंकि एक साथी एक गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था (जैसे एक पारस्परिक स्थानान्तरण दो तरह) किया जाता है. पीजीडी जोड़े जो पिछले प्रभावित बच्चों पड़ा है, और / या गुणसूत्र rearrangements, आवर्तक गर्भपात, या बांझपन के मामले में के लिए उपलब्ध है. Oocytes से aspirated निम्न डिम्बग्रंथि उत्तेजना वीर्य में इन विट्रो विसर्जन (आईवीएफ) में या एक व्यक्ति के शुक्राणु (आईसीएसआई) के intracytoplasmic इंजेक्शन द्वारा निषेचित कर रहे हैं. पूर्व आरोपण दरार मंच भ्रूण, आमतौर पर 3 दिन बाद निषेचन पर एक एकल कोशिका को हटाने के द्वारा biopsied हैं, और biopsied सेल भ्रूण के आनुवंशिक स्थिति स्थापित करने के लिए परीक्षण किया है. लक्ष्य विशिष्ट डीएनए जांच के साथ biopsied से कोशिकाओं की अचल नाभिक पर स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति पसंद की तकनीक गुणसूत्र गुणसूत्र rearrangements के साथ जुड़े असंतुलन का पता लगाने के लिए, और एक्स से जुड़े रोग है जिसके लिए वहाँ के साथ परिवारों में महिला भ्रूण का चयन कोई उत्परिवर्तन विशेष परीक्षा. मछली भी सहज गुणसूत्र aneuploidy (भी PGS या पीजीडी - रूप के रूप में जाना जाता है) के लिए स्क्रीन भ्रूण इस्तेमाल किया गया है क्रम में के लिए प्रयास करें और सहायता प्रजनन की क्षमता में सुधार, लेकिन, इस परीक्षण की पेशीनगोई मूल्य प्रसार और मछली तकनीक का उपयोग यहाँ वर्णित ज्यादातर लोगों के हाथों में unacceptably कम होने की संभावना है और यह नियमित नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए अनुशंसित नहीं है. हम एकल कोशिका मछली, blastomere नाभिक के लिए तकनीक के प्रसार, और स्वस्थानी संकरण में और संकेत स्कोरिंग, एक नैदानिक ​​सेटिंग में पीजीडी के लिए लागू के लिए उपयुक्त जांच के चयन का वर्णन .

Protocol

1. Lysing और एक biopsied Blastomere से एक न्यूक्लियस फैल

  1. Lysis बफर सेल प्रसार कोशिकाओं (0.01 एम एचसीएल में 0.2 Tween20%, पीएच 2.0) के लिए अग्रिम में 24 घंटे तैयार रहना चाहिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत एक 30 एमएल बाँझ सार्वभौमिक एक बाँझ 20 एमएल सिरिंज और सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर कंटेनर में 100 एमएल और फिल्टर 20 एमएल तैयार करें. 10-15 1.7 एमएल बाँझ microcentrifuge ट्यूबों में 1 एमएल aliquots बांटना बंद करें, और ठंड के पहले ट्यूबों लेबल. यह दो अलग बैचों है का उपयोग करें, नए बैच और पिछले बैच है, जो परीक्षण किया गया है और किया जा सकता है अगर नए बैच असंतोषजनक है की सिफारिश की है.
  2. डीफ्रोस्ट बायोप्सी प्रक्रिया से पहले 30 मिनट के कमरे के तापमान पर lysis बफर. व्यावहारिक प्रयोजनों के लिए काम कर रहे तापमान कमरे के तापमान और हाथ तापमान के बीच किया जाएगा.
  3. कुल एक amine लेपित स्लाइड एक हीरे की कलम और पूर्व लेबल मामले नंबर, अद्वितीय स्लाइड संख्या और बायोप्सी की तारीख के साथ स्लाइड का उपयोग (जैसे Genetix) के underside पर एक छोटा वृत्त (लगभग 5 मिमी व्यास). संख्यात्मक क्रम में प्रत्येक blastomere के लिए एक अलग स्लाइड, और भ्रूण की संख्या के साथ लेबल का उपयोग करें. स्लाइड्स 4H जैसे एक हार्ड पेंसिल के साथ लेबल किया जाना चाहिए, और किसी भी ग्रेफाइट धूल हटाने के लिए एक लाटेकस दस्ताने के साथ "blotted".
  4. Lysis बफर के सर्कल के भीतर एक छोटी मात्रा रखें.
  5. Lysis बफर में biopsied blastomere स्थानांतरण. यदि सर्कल के भीतर आवश्यक lysis बफर जोड़ने जब तक सेल lyse करने के लिए शुरू होता है, सेल पूरी तरह से lyse और cytoplasm बफर dries पहले फैलाने चाहिए.
  6. नाभिक का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह वृत्त के भीतर रहता है और खो नहीं है, अगर एक सेल नाभिक नहीं है या क्या करता है कई नाभिक है, एक और सेल बायोप्सी.
  7. कमरे के तापमान पर हवा शुष्क स्लाइड छोड़ो.

2. एकल Blastomere न्यूक्लियस के स्वस्थानी संकरण में

  1. एक इथेनॉल (70, 90 और 100%) श्रृंखला बाँझ आसुत जल में बनाया तैयार है.
  2. पर मुड़ें और 75 के गर्म ब्लॉक (जैसे Hybaid Omnislide या Vysis Hybrite) सेट ° सी.
  3. डीफ्रोस्ट जांच, भंवर, अपकेंद्रित्र और. अभिकर्मकों और देखा जांच मिश्रण करने से पहले सही सत्यापित किया जाना चाहिए. पिपेट मात्रा 0.65 एमएल बाँझ microcentrifuge ट्यूब और भंवर और उपयोग करने से पहले अपकेंद्रित्र में जांच मिश्रण बनाने के लिए निर्माता द्वारा निर्दिष्ट के रूप में. जांच मिश्रण की कुल मात्रा नाभिक प्रति 2 μL परीक्षण किया जा करने के लिए और निकटतम 10 के लिए एक सुरक्षा मार्जिन की अनुमति μL गोल की अनुमति के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए. Coplin फॉस्फेट-buffered (पीबीएस) खारा (0.14 एम NaCl, 3 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 4 HPO, 2 मिमी के.एच. 2 4 पीओ पीएच 7.0) का उपयोग कर जार में स्लाइड्स पूर्व धोने
  5. बाँझ आसुत पानी में स्लाइड्स दो बार कुल्ला.
  6. कमरे के तापमान और हवा शुष्क 2 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल श्रृंखला (70, 90, और 100%) के साथ स्लाइड्स निर्जलीकरण. सुनिश्चित करें स्लाइड्स और पूरी तरह से डूब रहे हैं अगर किसी भी ग्रेफाइट धूल सतह के लिए मंगाई है, एक साफ ऊतक के साथ सोख लेना.
  7. सर्कल के भीतर एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के साथ visualizing द्वारा नाभिक की स्थिति रिकार्ड.
  8. कमरे के तापमान और हवा शुष्क 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ निर्जलीकरण.
  9. जांच मिश्रण के 2 μL लागू करें, और एक 9 x 9 मिमी coverslip (एक 18 x 18 मिमी नंबर 1 coverslip का एक चौथाई) के साथ कवर.
  10. रबर सीमेंट (, गाय अशुद्धि जाँच जैसे गाय गम) के साथ coverslip के किनारों को सील.
  11. एक गर्म ब्लॉक पर 75 स्लाइड्स Codenature ° 5 मिनट के लिए सी, और तब स्लाइड्स रातोंरात संकरण (16-20 घंटे) 37 पर एक humidified कक्ष में डिग्री सेल्सियस जांच घोला जा सकता है कि centromere जांच (यानी सेक्स से जुड़े मामलों के लिए) की पूरी तरह से मिलकर बनता है संकरण के 60 मिनट बाद एक संतोषजनक परिणाम दे देंगे.
  12. पर्याप्त coplin जार और 71 के लिए गर्मी डिग्री सेल्सियस के साथ एक पानी स्नान तैयार
  13. एक 0.4x मानक खारा (एसएससी) साइट्रेट कड़े धोने (71 पीएच 7.0 ° सी, 0.06 एम NaCl, 6 मिमी सी 5 6 एच ना 3 7 हे 0.2 2 एच ओ) समाधान और पानी के स्नान में गर्मी तैयार .
  14. Coplin जार के प्रति कड़े धोने की आवश्यकता के 50 एमएल बांटना और जाँच करें कि तापमान 71 ° सी तुरंत एक साफ थर्मामीटर का उपयोग कर का उपयोग करने के लिए पहले.
  15. ध्यान से प्रत्येक स्लाइड से रबर सीमेंट हटाने और कमरे के तापमान पर 4x SSC/0.05 Tween20% (पीएच 7.0) का उपयोग कर coverslip बंद कुल्ला.
  16. 0.4x एसएससी कड़े धोने में स्लाइड्स 71 ° 5 मिनट के लिए सी धो. कोई coplin जार 6 प्रतिशत से अधिक स्लाइड्स धो लें.
  17. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धो 4x SSC/0.05% Tween20 में स्लाइड्स.
  18. अगर जांच मिश्रण परोक्ष रूप से लेबल (ओं) को जांच में शामिल है, अतिरिक्त तरल के स्लाइड्स नाली और एक 20 x 20 मिमी Parafilm के वर्ग के तहत fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी के 20 μL लागू.
  19. 37 पर एक humidified कक्ष में सेते ° C 15 मिनट के लिए.
  20. Parafilm निकालें और 4x SSC/0.05% Tween20 में एक बार कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए धो.
  21. पीबीएस में 2 मिनट के लिए दो बार धोटी कमरे के तापमान और स्लाइड्स नाली.
  22. एक 22 x 22 मिमी नहीं DAPI / Vectashield (4 के 160 एनजी 'Vectashield बढ़ते मध्यम, वेक्टर प्रयोगशालाओं के 1 एमएल में ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) के 6 μL लागू करें. 0 coverslip और coverslip अधिक स्लाइड पलटना.
  23. ब्लाट और स्पष्ट नेल वार्निश के साथ coverslip के किनारों को सील.

3. खेतों में प्रयुक्त किए गए जांच के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग विश्लेषण उपयुक्त लैस.

  1. प्रत्यक्ष दृश्य द्वारा कुल संकेतों प्रतिदीप्ति खुर्दबीन और परख में एकल बैंड पास प्रत्येक fluorochrome के लिए फिल्टर का उपयोग कर. प्रत्येक नाभिक दो विश्लेषकों द्वारा रन होना चाहिए. एक सामान्य दिशानिर्देश एक एकल संकेत है जहां दो निकट दूरी पर संकेतों को कम से कम एक (संकेत चौड़ाई) के अलावा डोमेन के स्कोरिंग करने के लिए नेतृत्व चाहिए, तथापि, अनुभव पर आधारित निर्णय आकार तीव्रता बदलती के संकेत, और जुदाई की व्याख्या करने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए.
  2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (जैसे Isis, MetaSystems, Altlussheim, जर्मनी, CytoVision, Genetix) दृश्य निदान की पुष्टि के लिए नाभिक की एक छवि पर कब्जा, और एक प्रयोगशाला गुणवत्ता आश्वासन योजना के भाग के रूप में छवि संग्रह के लिए.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

मेटाफ़ेज़ और सुसंस्कृत परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों से interphase नाभिक पुष्टि करें कि चयनित जांच स्थानान्तरण गुणसूत्रों के लिए विशिष्ट है, breakpoints (subtelomere जांच केवल केंद्रित translocated क्षेत्रों और centromere जांच () के लिए संकरण चाहिए के लिए जानकारीपूर्ण हैं करने के लिए जांच की जानी चाहिए खंड (ओं)) और interphase नाभिक में संकेतों उज्ज्वल और असतत होना चाहिए. प्रत्येक साझेदार से हर जांच के लिए संकेतों की संख्या 100 interphase नाभिक में स्कोरिंग परख की दक्षता का आकलन करने की सिफारिश की है. इस मामले में 2 संकेतों के 95% हर जांच के लिए नाभिक के -99% में रन बनाए थे. चित्रा 1 मेटाफ़ेज़ और गुणसूत्रों 5 और 9 की कमी हथियार के बीच एक पारस्परिक स्थानान्तरण के लिए एक तैयारी से interphase नाभिक से पता चलता है.

भ्रूण blastomeres से interphase नाभिक में सिग्नल उज्ज्वल और असतत और प्रयुक्त रंग के लिए अलग बैंड पास फिल्टर का उपयोग रन चाहिए. चित्रा 2 एक सामान्य संकेत पैटर्न (सभी परीक्षण loci के लिए दो प्रतियां) गुणसूत्र 5 और 9 के लिए एक सामान्य या संतुलित गुणसूत्र पूरक के साथ संगत है, और एक असामान्य स्थानान्तरण की एक असंतुलित उत्पाद के साथ संगत संकेत पैटर्न के साथ एक नाभिक के साथ एक blastomere नाभिक से पता चलता है कि खंड के लिए 5 गुणसूत्र और ट्राईसोमी 9 गुणसूत्र के translocated खंड के लिए (3 प्रतियां) के translocated monosomy (एक प्रतिलिपि) है.

चित्रा 1
चित्रा 1 एक मेटाफ़ेज़ प्रसार और एक interphase सुसंस्कृत 5 गुणसूत्रों के छोटे हथियार और 5p14.3 और 9p24.1 पर breakpoints के साथ 9 के बीच एक पारस्परिक स्थानान्तरण के एक वाहक से परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों से तैयार नाभिक: 46, XY, टी ( 5 9) (p14.3;. p24.1) ish (5 टी, 9) (5ptel48 - 9ptel30; 9ptel30, 5ptel48 + 9cen +). मछली जांच दोनों translocated क्षेत्रों के लिए चयन किया गया था (5p14.3 → 5pter, लाल Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, हरी Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) और केंद्रित 9 गुणसूत्र के खंड (9p24.1 → 9qter, नीले Abbott सीईपी 9 अल्फा उपग्रह SpectrumAqua).

चित्रा 2
Interphase blastomere नाभिक में चित्रा 2 दिन 3 भ्रूण से सिग्नल प्रत्येक fluorochrome और एक समग्र छवि के रूप में विलय के लिए एक अलग फिल्टर का उपयोग कर कब्जा कर लिया. (ए) प्रत्येक की दो प्रतियां प्रत्येक ठिकाना है, जो स्थानान्तरण गुणसूत्रों के लिए एक सामान्य या संतुलित पूरक के साथ संगत है का संकेत जांच के लिए दो संकेतों. (बी) एक लाल सिग्नल, तीन हरी संकेतों और दो नीले संकेतों 5 गुणसूत्र के translocated खंड के एक प्रतिलिपि, 9 गुणसूत्र के translocated खंड के तीन प्रतियां और 9 गुणसूत्र केंद्रित खंड की दो प्रतियां जो आसन्न के साथ संगत है का संकेत 5p14.3 → 5pter और ट्राईसोमी के लिए एक monosomy साथ एक असंतुलित 9p24.1 → 9pter के लिए उत्पाद में जिसके परिणामस्वरूप स्थानान्तरण के -1 अलगाव.

Discussion

एक एकल भ्रूण सेल (blastomere) स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति के आवेदन दोनों चलन में और संकेत पैटर्न की व्याख्या में विशेष चुनौतियां प्रस्तुत करता है . biopsied सेल करने के लिए स्लाइड पर एक पूर्व - परिभाषित क्षेत्र के भीतर फैल क्रम में अपनी स्थानीयकरण निम्नलिखित मछली की सुविधा की जरूरत है, चरम देखभाल के लिए सुनिश्चित करना है कि सेल lysed है कि cytoplasm छितरी किया गया है में रखा जाना चाहिए, और है कि नाभिक दिखाई और बरकरार है, और के रूप में निदान के इस एकल कक्ष, कड़े स्कोरिंग और व्याख्या दिशानिर्देशों लागू किया जाना चाहिए से परिणामों पर निर्भर करता है. हालांकि, अनुभवी हाथों में, मछली नैदानिक ​​व्यवहार में एक आनुवंशिक पूर्व आरोपण निदान (PGD) के लिए मजबूत तकनीक है. मछली द्वारा पीजीडी के सिद्धांत है कि लक्ष्य विशिष्ट डीएनए अलग fluorochromes या haptens लेबल के साथ जांच के लिए विशिष्ट loci के प्रतिलिपि संख्या का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और जिससे गुणसूत्र गुणसूत्र rearrangements के meiotic अलगाव (1) के साथ जुड़े असंतुलन Robertsonian सहित, का पता लगाने के लिए translocations, पारस्परिक translocations, inversions, और जटिल rearrangements (2). मछली भी एक्स जुड़े रोग के साथ परिवारों में महिला भ्रूण का चयन करें, जिसके लिए वहाँ कोई परीक्षण उत्परिवर्तन विशिष्ट (3, 4) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ज्यादा विवादास्पद, मछली भी छिटपुट गुणसूत्र aneuploidy के लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया गया है क्रम में करने के लिए कोशिश करते हैं और सहायता प्रजनन (5, 6) की दक्षता में सुधार, लेकिन, इस परीक्षण का उपयोग कर FSIH का भविष्य कहनेवाला मूल्य में unacceptably कम हो जाने की संभावना है सबसे अधिक लोगों के हाथ और नियमित नैदानिक ​​प्रयोग (7) के लिए अनुशंसित नहीं है. इस अनुच्छेद के तकनीकी पहलुओं और मछली नैदानिक ​​निदान एकल कक्ष के लिए लागू की सीमाओं पर ध्यान केंद्रित है.

प्रसार और एकल blastomeres फिक्सिंग के तरीके / मेथनॉल एसिटिक एसिड (5, 8), बीच / एचसीएल (9), और बीच / एचसीएल और मेथनॉल / एसिटिक एसिड (10) का एक संयोजन शामिल हैं. विविधतायें कोशिकाओं के hypotonic उपचार के निर्धारण के बाद और / या पेप्सिन और paraformaldehyde उपचार के प्रसार करने के लिए पहले से शामिल हैं. विधि उचित प्रयोगशाला (14) के लिए मान्य किया जाना चाहिए. विधि / बीच एचसीएल में विस्तार से इस अनुच्छेद में वर्णित है. विधि / बीच एचसीएल तकनीकी रूप से सरल और विभिन्न प्रयोगशालाओं में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. इस विधि स्वीकार्य निदान सटीकता (7) के साथ सेक्स और दृढ़ संकल्प गुणसूत्र rearrangements की मछली निदान के लिए एकल नाभिक तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

जांच घोला जा सकता है सीधे लेबल और परोक्ष रूप से लेबल विभिन्न निर्माताओं से जांच, और जांच गठबंधन कर सकते हैं. ज्ञात बहुरूपी गुणसूत्र क्षेत्रों के लिए जांच (11, 12), या उन अन्य गुणसूत्रों (13) के साथ काफी पार संकरण ज्ञात, बचा जाना चाहिए, हालांकि अगर पीजीडी के लिए दोनों प्रजनन भागीदारों पर पहले परीक्षण द्वारा विशिष्ट और उपयुक्त होना दिखाया इस्तेमाल किया जा सकता है . भेदभाव जांच के लिए उपलब्ध / fluorochromes haptens और रणनीतियों को निम्नलिखित शामिल हैं: टेक्सास रेड (टी.आर.), fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, biotinylated टी.आर. avidin के साथ पता लगाया जांच, FITC avidin, या Cy-streptavidin 5 (एक FarRed फिल्टर का उपयोग करते हुए कल्पना), लाल और हरे रंग की जांच की एक मिश्रण करने के लिए एक पीला संकेत संकरण के एक दूसरे दौर है और एक तिहाई SpectrumOrange TexasRed और SpectrumGold फिल्टर) का उपयोग कर के अनुक्रमिक कैप्चरिंग के द्वारा बनाई गई रंग का उत्पादन.

जांच तीन जांच, एक्स और वाई क्रोमोसोम और एक autosome centromere क्षेत्रों के लिए विशिष्ट युक्त सेट, लिंग निर्धारण (14) के लिए सिफारिश की है, autosomal पीछे जांच ploidy और इस तरह स्थापित करने के लिए ट्राईसोमी एक्स के बीच अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है (2n, 47 ) XXX और triploidy (3N, 69, XXX), और tetrasomy (48, XXXX) एक्स और tetraploidy (4N, 92, XXXX) के बीच. इस जांच को सेट करने के लिए एक बहुत ही कम बहुरूपता दर का प्रदर्शन किया गया है, और इसलिए पूर्व उपचार प्रजनन भागीदारों के काम, एक ठेठ जांच इस सेटिंग में लागू किया जाता है Abbott AneuVysion मिश्रण युक्त अल्फा उपग्रह एक्स, वाई, और 18 सेट आवश्यकता नहीं (14).

किसी भी विशिष्ट पुनर्व्यवस्था के लिए जांच मिश्रण होना चाहिए: आदर्श रूप में कम से कम गुणसूत्र असंतुलन के साथ पुनर्व्यवस्था के सभी उम्मीद उत्पादों का पता लगाने के लिए पर्याप्त जांच होते हैं. यदि यह संभव नहीं है, जांच घोला जा सकता है जहां असंसूचित असंतुलित उत्पादों के लिए एक पहचानने गर्भावस्था में अलाभकारी हो गया आकलन किया है और बहुत कम प्रसार स्वीकार्य हो (14) संभावना है. प्रजनन दोनों भागीदारों से सुसंस्कृत लिम्फोसाइट metaphases पर परीक्षण किया गया. कम से कम दस मेटाफ़ेज़ फैलता जांच विशिष्टता, बहुरूपताओं और पार संकरण के लिए जांच की जानी चाहिए, और गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था वाहक के लिए, यह सुनिश्चित करना है कि जांच के रूप में पुनर्व्यवस्था के विभिन्न क्षेत्रों के लिए उम्मीद संकरण. इसके अलावा, इन तैयारियों से कम से कम 100 interphase नाभिक के संकेत विशिष्टता, चमक, और पृथक्ता (14) का आकलन रन होना चाहिए.

Commercial PGS जांच सेट उपलब्ध हैं (जैसे Abbott MultiVysion पीबी या PGT), सबसे अधिक बार गर्भाधान के उत्पादों में aneuploid हो पाया गुणसूत्रों लक्ष्यीकरण, और लक्षित गुणसूत्र प्रति एक जांच शामिल है. आमतौर पर नाभिक अतिरिक्त क्रोमोसोम 13, 15, 16, 18, 21, 22, और XY (14) के लिए एक परख प्रदान गुणसूत्रों के लिए जांच के साथ एक दूसरे संकरण हो सकता है. इस प्रसार और मछली तकनीक यहाँ वर्णित का उपयोग कर परीक्षण का भविष्य कहनेवाला मूल्य के लिए सबसे अधिक लोगों के हाथों में unacceptably कम होने की संभावना है और यह नियमित नैदानिक ​​उपयोग (7, 15) के लिए अनुशंसित नहीं है.

जैसे तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (CGH) एकल कक्षों पर लागू तकनीकों हर गुणसूत्र की नकल संख्या के लिए परीक्षण करने में सक्षम (Wilton एट अल 2001.) हैं, और एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNP) का उपयोग arrays और मात्रात्मक विश्लेषण (वेल्स एट अल 2008) या "karyomapping" जीनोटाइपिंग (Handyside एट अल 2009) वैकल्पिक तकनीकों का वादा कर रहे हैं गुणसूत्र aneuploidy का पता लगाने. हालांकि, संकल्प और खंड असंतुलन के लिए सीमा सटीकता अनिश्चित बनी रहती है और यह है कि मछली के लिए छोटे क्षेत्रों को शामिल गुणसूत्र rearrangements के लिए पसंद की तकनीक लिए जारी रहेगा संभावना है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrochloric Acid, 2.5L VWR international 101254H
Sodium Chloride, 5Kg VWR international 443827W
Potassium Chloride, 250g VWR international 26764.232
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g VWR international 102494C
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g VWR international 10203 4B
Sodium Hydroxide Pellets, 500g VWR international 28245.265
Tween20, 500mL VWR international 663684B
Ethanol, 2.5L VWR international 8.18760.2500 Duty Paid
Tri-Sodium Citrate, 5Kg VWR international 27833.363
Cow Gum, 250mL Cow Proofings Ltd. No longer available Old stocks can still be found in art shops
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul Cytocell Ltd. DES500L 150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe
Nail Varnish, 12mL Boots 10088316001
Amine-coated Slides, 25 Genetix K2615
DAPI, 0.1mL Sigma-Aldrich D-9542
Vectashield, 10mL Vector Laboratories H1000
Texas-Red-avidin, 0.001mL Vector Laboratories A-2016
FITC-avidin, 0.001mL Vector Laboratories A-2011
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL GE Healthcare PA45001
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500 Thistle Scientific AX-MCT-175-C
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000 Thistle Scientific AX-MCT-060-C-CS
30ml Universal Containers, box of 400 Sterilin 128B Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053
Hot Block
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick VWR international 451-0107 451-3112 451-3111
Plugged Glass Pipettes Fisher Scientific PMK-300-052R
Dissecting Microscope Wild Heerbrugg
Tissues, 100boxes NHS SUPPLY CHAIN MJT058
Metal Culture Trays
Plastic Melamine Trays VWR international 682-009
Oven
Mouth Pipette Mouthpiece Scientific Laboratory Supplies LTD HAE3700
Tubing
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter Fisher Scientific FDM-340-010U
Diamond Pen VWR international 818-0021
Hot Block for Slides Thermo Fisher Scientific, Inc. HBOSBB
Hybridization Chamber
Tissue Roll NHS SUPPLY CHAIN MJT004
Schieferdecker Jar VWR international 631-9313
Coplin Jar VWR international 631-9331
Forceps, Fine VWR international 232-2123
Forceps, Blunt VWR international 232-2113
1000mL Beaker VWR international 213-1642
Phase Contrast Microscope Nikon Instruments E200
Fibre-free Blotting Cards, box of 100 Fisher Scientific SDE1
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100 Scientific Laboratory Supplies LTD MIC3022
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200 Scientific Laboratory Supplies LTD MIC3110
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200 Scientific Laboratory Supplies LTD MIC3104
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100 Scientific Laboratory Supplies LTD MIC3206
1mL Syringe, box of 100 NHS Supply Chain FWC045
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000 Thistle Scientific AX-T-1000-C-L-R
Incubator LEEC
Waterbath Grant Equipment W22
Alcohol Thermometer Various sources available
pH Meter Jenway 3305
pH Electrode VWR international 662-1759 BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305
Heated Stirrer Bibby HC502
1mL Pasteur Pipettes, box of 500 Scientific Laboratory Supplies LTD PIP4202
Parafilm, 50mm x 75m VWR international 291-1214

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References

  1. Scriven, P. N., Handyside, A. H., Ogilvie, C. M. Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis. Prenat. Diagn. 18, 1437-1449 (1998).
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1 Comment

  1. tanks very much

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 11, 2011 - 10:49 AM

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