总结凝聚力测量组织表面Tensiometry

Bioengineering

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Summary

我们描述的测量结合能源,作为组织的表面张力表达的方法,细胞内的三维组织状集合体之间。在组织表面张力的差异已经证明关联,肺,肌肉和脑肿瘤的侵袭,并建立不同类型的细胞之间的空间关系的基本决定因素。

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Butler, C. M., Foty, R. A. Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry. J. Vis. Exp. (50), e2739, doi:10.3791/2739 (2011).

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Abstract

严格测量间的结合能只能使用接地系统中的热力学原理,在平衡的方法。我们已经开发出组织表面tensiometry(TST),专门用于测量表面的细胞之间相互作用的自由能。生物物理概念的基本尖沙咀此前已在详细的1,2描述。该方法是基于观察,细胞相互凝聚力,如果维持在振荡培养,会自发地聚集到集群。随着时间的推移,这些集群将全面形成球体。这四舍五入的行为模仿的液体系统的行为特征。细胞间的结合能测量压缩在定制设计的组织表面张力平行板之间的球形集合体。相同的数学方程,用来衡量一个液滴的表面张力是用来衡量组织的三维球形聚合表面张力。相当于液体的表面张力的细胞间的结合能,或更普遍的是,组织cohesivity。我们实验室以前的研究表明,组织的表面张力(1)预测两组胚胎干细胞如何将与另一1-5(2)可以强烈地影响着组织的能力与生物材料 6相互作用,(3)可以改变,不仅通过直接操纵的钙粘蛋白为基础 7间凝聚力,但也操纵关键的ECM分子如FN 8-11日和4)相关肺癌12 13,纤维肉瘤,脑肿瘤和前列腺肿瘤的侵袭潜力细胞系15。在这篇文章中,我们将描述仪器,细节产生球体所需的步骤,加载到张力腔的球体,启动总压缩,并组织产生的表面张力测量,分析和验证。

Protocol

1。总结筹备组织的表面张力的测量。

对于贴壁细胞,球体可以使用的悬滴法或产生一个连贯的表,然后将其削减到1毫米的碎片细胞形成。

总结形成悬滴法:

  1. 近融合的贴壁细胞培养应增长到90%汇合,届时单层应该用PBS漂洗两次。排水良好后,加入2毫升,0.05%胰蛋白酶1毫米EDTA(100毫米板块),并在37 ° C,直到细胞分离。停止加入2 MLS的完全培养基,轻轻地用5毫升吸管磨碎的混合物,直至细胞悬浮液中的胰蛋白酶。细胞转移到15毫升锥形管。
  2. 加入40μl和10毫克/毫升的DNA酶原液为5分钟,在室温下孵育。涡短暂离心5分钟,在200 XG。
  3. 弃上清,用1毫升完整的组织培养基颗粒。重复,然后在2 MLS的完整的组织培养液中的悬浮细胞。
  4. 计数细胞,使用hemacytometer,或自动细胞计数,调整浓度为2.5 × 10 6细胞/ ml 。
  5. 删除从60毫米组织培养皿并将其放置在底部的菜5毫升的PBS的盖子。这将作为一个水化室。
  6. 倒置的盖子,并用20μL移液器存款10μL滴上的盖子底部。确保,滴放置足够的距离,以不碰。这是可能的地方至少有20%菜滴。
  7. 反转到的PBS填充的底部室和孵化在37 ° C / 5%的CO 2 / 95%湿度盖子,监察滴每天孵育直到细胞表或聚集已经形成。
  8. 一旦表的形式,他们可以转移到圆底玻璃振动筛瓶含有3 MLS和完全培养基在摇晃水浴孵育37 ° C和5%,直到球体形成的CO 2。

总结形成的细胞表方法:

  1. 如上所述,但浓度调整为1 × 10 6细胞/ ml单细胞悬液准备。
  2. 3毫升细胞悬液转移到10 ml圆底烧瓶(贝尔科,葡萄园,新泽西州)。
  3. 孵育一个回旋水浴/摇床(新不伦瑞克省的科学,爱迪生,新泽西州)在37 ° C,5%CO2 4H 2 120转的烧瓶,直到从胰蛋白酶的细胞恢复。
  4. 细胞转移到玻璃圆底离心管和200 X克成细颗粒的离心。另外24小时的孵育,直到一个连贯的表的形式。
  5. 轻轻摇动培养管逐出表,并倒入一个小的,无菌的玻璃组织培养皿中培养管的内容。
  6. 用微型手术刀,切成不同大小的片段的纸张。
  7. 孵育37 ° C下在120转的回旋水浴摇床5%的CO 2 2至3天,或直至他们成为球形片段。

2。骨料的表面张力的测量

  1. 组织表面张力 。该仪器是在图所示。 1和2。压缩单元(图3)两院组成。外室(OC),连接到37℃的循环水泵,是监管的内宅(IC)的温度。该商会是建造精聚甲醛和含有石英聚合的可视化窗口。使用较低的大会(LA)螺钉进入内宅的基础和为1)的位置在内宅的总和; 2)密封内腔的底部; 3)提高总启动压缩;(4 )控制的平行,因此总的压缩之间的距离。大会(CC)的核心是可调的。核心提示(底座)组成的顺利聚四氟乙烯和较低的压缩板(LCP)的行为。上部压缩板(UCP)是聚四氟乙烯缸15毫米长,从平衡臂挂起(B)由火焰摆正镍铬丝(NCW)*在实验过程中,细胞聚合(一)是定位于下盘,并提出,直到它接触的上盘。上盘连接到平衡臂(二)。总的压缩会导致平衡臂的位移。的平衡是一个卡恩/ Ventron模型2000录音electrobalance,空平衡的原则运作。平衡臂的支点有一个永久磁场内的电枢。平衡运行时,它不断地调节通过电磁大会,这反过​​来又保持在水平位置平衡臂的电流通过。当一个对象被暂停的平衡臂,电压,适用于在horizo​​保持平衡手臂NTAL位置,是成正比对象的权衡的。此电压措施适用于总的外部压力。聚集的形状是通过25 x尼康SMZ10A配备图像采集卡的计算机的立体视觉观察监测。为了尽量减少细胞聚集粘附压缩板,无论是下限和上限的压缩板涂有聚(2 - hydroxyethylmethacrylate){聚(HEMA)},聚合物材料,细胞不坚持 16 。
    *丝火焰理顺夹紧,挂着一个反驳的立场15英寸长的电线和一个小粘结剂剪辑到最后。本生灯然后运行线的长度,直到该导线呈红色。截弯取直的电线,然后可以切成适当的长度。小钩是弯曲的线约一英寸¼从使用两个刀片的最终形成。另一端,然后插入到每桶较低的压缩板。
  2. 总结压缩。
    1. 内宅是充满预热CO 2独立的组织培养基(GIBCO / BRL,NY) 。
    2. 聚集在大小不等,从约200-300μ定位较低的压缩板(图4A)。聚合加载吸在组织培养基了巴斯德吸管尖端装有硅胶球中途中的聚合,吸管转移到内宅,定位上述LCP的吸管尖。骨料,然后轻轻地驱逐到LCP轻轻挤压灯泡。另外,总重力下降到LCP。
    3. 上部压缩板(UCP)是定位高于总可以来台定居,建立预压明显UCP的重量基线。
    4. 在LCP,然后提出,直到总压缩是对跟单信用证统一惯例(图4B)。调整的降低设备的内在核心的高度将控制不同程度的压缩。压缩是通过配备的CCD摄像头在解剖显微镜观察监测。
    5. 总结图像被捕获,数字化,并使用ImageJ分析。视UCP体重变化是连续记录上的一个带状图记录,被卡恩平衡的电压输出练级小康表示形状均衡的成果。每个聚合受到不同程度的压缩。
  3. 计算总的表面张力
    在造型的平衡,可以得到的压缩细胞之间的平行板,它不坚持的聚集cohesivity,从青年Laplace方程(图5),其中σ是cohesivity,F是力压缩总,πr3 2施加力F总表面面积,R 2和R 3,分别压缩总的赤道半径和定义它的表面轮廓正常的弧形半径压缩板和扩大它们之间的(图6)。在力量和形状平衡的压缩力和几何测量和应用这些测量杨- Laplace方程,产生明显的组织表面张力的数值。聚集,达到平衡后,σ1计算,解压缩,并允许接近第二个平衡 σ2的计算如上所述。
  4. 确认总的流动性
    液体总量计算出的表面张力,当两个不同的按压将保持不变。的比例在这样的聚集σ2 /σ1等于1,将不到的力量在每一个连续的压缩(F 2 / F 1)的应用比例。相比之下,弹性聚合计算表面张力将服从虎克定律,并增加施加的力。的比例,对于弹性聚合σ2 /σ1不会等于1,而将方法F 2 / F 1的比例。表面张力的液体总量也将独立的总大小2,17。只有表面张力施加的力和规模的独立的测量是用来计算平均σ为每个细胞株。

3。代表性的成果:

下面是一个典型的TST结果大鼠前列腺成纤维细胞(爱国阵线)和大鼠前列腺平滑肌细胞(RPSMC)的聚合表。在图中可以看出。 7卢旺达爱国阵线细胞聚集体的表面张力为22.8 ± 1.1达因/厘米。此外,平均压缩后1和2压缩后的表面张力测量值进行统计学IDENTICAL时由配对t检验比较。我们还比较σ2 /σ1和F 2 / F 1,以确保这些总量不服从胡克定律,因为他们,如果他们表现为弹性固体的比率。表1表明,σ2 /σ1确实接近1.0的比例。此外,F 2 / F 1的比例大大超过σ2 /σ1(配对t检验,P <0.05),进一步证实了这些总量不服从虎克定律,实际上表现为液体。相比之下RPSMCs服从胡克定律。作为是显而易见的,在表1,σ2 /σ1的比例明显大于1,并且统计学比F 2 / F 1的不同。为了进一步证明液体状的行为,我们探索的表面张力(σ)和总体积之间的关系。在图中可以看出。 8,体积是sigma的独立爱国阵线细胞(红色回归线,R 2 = 0.002),而出现一些sigma的RPSMCs(蓝色的回归线,R 2 = 0.146)卷上的依赖。这些数据进一步证实,卢旺达爱国阵线聚集的行为在液体状的方式,而RPSMCs出现更多的表现为弹性固体。只有那些表现为液体的聚合获得mesurements,将用于计算表面张力。

图1
图1。组织表面张力的概述。

图2
图2。张力室(右图)的一个更详细的视图。

图3
图3。示意图张力室。

图4
图4未压缩的(A)和压缩(二)聚集的图片。

图5
图5。拉普拉斯方程。

图6
图6。液滴之间的两个平行板,它坚持理想形状的平衡,压缩图。 R 1和R 2是两个小学曲率半径,在液滴的赤道平面通过其对称轴分别。 R 3的是液滴的接触要么压缩板的圆形区域的半径。 H是上部和下部的压缩板之间的距离。 X是一个直角三角形斜边ř一侧2延伸到液滴的表面,要么压缩板之间的接触点。

σ1(达因/厘米± SEM) σ2(达因/厘米± SEM) Pσ1 VSσ2 σ1,2(达因/厘米± SEM) σ2 /σ1 F 2 / F 1 Pσ2 /σ1和F 2楼1
卢旺达爱国阵线 22.6 ± 1.7 22.9 ± 1.4 > 0.05 * 22.8 ± 1.1 1.04 ± 0.04 1.47 ± 0.06 <0.05
RPSMC 15.0 ± 2.8 23.0 ± 3.2 0.039 不适用 1.9 ± 0.3 1.6 ± 0.1 0.16 *

图7。尖沙咀测量和确认的总流动性大鼠前列腺成纤维细胞和平滑肌细胞的聚集。

图8
图8。Sigma和卢旺达爱国阵线的聚集量(红线)和RPSMCs(蓝线)之间的关系。

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Discussion

尖沙咀总的凝聚力测量相对比较简单。有,但是,为了生成可用的尖沙咀数据,必须要掌握的关键步骤; 1)总量必须是“健康”。这可以确保聚合形成与细胞的最佳汇合前支队开始控制。骨料粒径和文化也必须加以控制,以尽量减少坏死核心内总的发展; 2)另一个影响尖沙咀测量的参数,可以是总的附着力程度上部或下部的压缩板。因此,聚甲基丙烯酸羟乙酯的最佳浓度,用于涂层板必须凭经验确定每个聚合类型; 3),虽然这是最好预压缩总量应尽可能球形,它不是绝对必要的。一些碎石,尤其是一起举行弱的,往往没有形成完善的领域。对此的解释是,为了彻底全面的细胞必须耗费能源,移动和重新安排。如果所需的能量圆成一个球体超过成为球形的能量最小化,聚集,往往会拖延一些分球形。根据我们的经验,在成为压缩总量,在一定程度上抵制的压缩力,双方的聚合形成半圈,正是因为他们会做,如果从一个完美的球体开始; 4)它也是重要的,压缩板一个平行。这是最好的完成,确保镍铬丝是直的,该仪器是水平和垂直。如果这些措施得到遵守,组织表面tensiometry相对简单,可以生成非常有用的信息的组织和机械性能,其内在的分子决定。

其他方法,测量总的凝聚力存在,一些消除需要专门的设备,如卡恩electrobalance。其中的一个方法成远小于球体直径吸管吸椭球体,与一个恒定的吸力压力。组织粘弹特性,推导出应变的变化,通过测量细胞的物质,因为里面的吸管18流动的长度变化。虽然有用,但这种方法可能有限制的表面,它可以适用于紧张局势的范围。很弱总量可能会被销毁,因为它们是吸入吸液管,而聚集在一起举行非常强烈可能不会被吸入所有。测量平行板压缩低的表面张力为0.33 ± 0.02达因/厘米的斑马鱼胚层外胚层与E - cadherin的吗 3处理高达20.1 ± 0.5达因/厘米鸡胚肢芽中胚 2的聚合,展示了其通过广泛的凝聚力范围为几个胚胎系统的一般效用。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
water bath/shaker New Brunswick Scientific
10 ml round-bottom flasks Bellco Glass

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References

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