Выявление инфекционных Касперского с поля, собранные Комары от Vero Пробирной культуры клеток

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы опишем метод для обработки и экран полевых собраны комаров для разнообразия вирусов Веро анализа культуры клеток. Используя эту технику, мы обнаружили 9 различных вирусов из 4 семей в таксономических комаров, собранных в Коннектикуте.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Комары передавать число различных вирусов, включая важных человеческих патогенов, таких как вирус Западного Нила, лихорадка денге вируса, и chickungunya вируса. Многие из этих вирусов активизировались в эндемичных диапазонов и расширена на новые территории, что требует эффективных программ надзора и контроля, чтобы реагировать на эти угрозы. Одна из стратегий для мониторинга вирусной активности включает в себя сбор большого количества комаров из эндемичных сайтов и их тестирования на вирусную инфекцию. В этой статье мы опишем, как в обращении, процесс, и экран полевых собраны комаров для инфекционного вируса от Vero анализа культуры клеток. Комары сортируются по расположению ловушку и видов, а сгруппированы в пулы содержащего ≤ 50 человек. Объединенные образцы гомогенизировали в буферном растворе с помощью миксера-мельница и водную фазу прививку на сливной Vero клеточных культурах (Clone E6). Клеточные культуры контролируются на цитопатический эффект от нескольких дней 3-7 после прививки и любые вирусы, выращенные в культуре клеток определяются соответствующие диагностические анализы. Используя такой подход, мы выделили 9 различных вирусов от комаров, собранных в Коннектикут, США, и среди них, 5 как известно, вызывают болезни человека. Три из них вирусы (вирус Западного Нила, вирус Потоси и Ла-Кроссе вируса) представляют собой новый рекорд для Северной Америки или регионе Новая Англия с 1999 года. Способность обнаруживать большое разнообразие вирусов имеет решающее значение для мониторинга, которые создали и вновь появляющихся вирусов в организме комара населения.

Protocol

1. Сортировка комаров и идентификации

  1. Следующие процедуры выполняются на открытом лабораторном столе в специальной уровня биобезопасности-2 (BSL-2) лаборатории персонала, обученного работать с живыми комарами. "Холодовой цепи" сохраняется на протяжении всей процедуры.
  2. Обезболить жить взрослых комаров, поставив сумку комаров коллекции в морозильной камере -20 ° в течение 5 минут. Передача коллекции сумку изолированный контейнер, содержащий сухой лед. Закрыть крышкой и выставить комары углекислого газа в течение 1-3 минут, чтобы обеспечить полный нокдаун.
  3. Нажмите наркозом комаров на предварительно охлажденные кастрюлю помещен на ложе из сухого льда. Отдельные отдельных самок комаров с использованием тонких щипцов и место в пластиковые стаканчики части. Накрыть крышкой и помещают чашки на льду.
  4. Определить комары вида с использованием описательной ключи таксономических на основе внешней морфологии комаров при помощи стерео микроскопа рассекает (10-60X зум), установленных на электронные таблицы озноб.
  5. Комбинат определены видов комаров в пулы ≤ 50 человек в 2 мл оснастки шапка флаконах, содержащих медь BB. Флаконы помечены уникальный идентификатор.
  6. После выявления всех комаров, флаконы помещают в маркированные мешки и держал в холодильнике пенополистирола содержащих сухой лед.
  7. Магазин комаров бассейнов в -80 ° C морозильнике до вирусом тестирования.

2. Биобезопасности соображений, чтобы изолировать вирус от комаров

  1. Следующие процедуры выполняются в уровне биобезопасности-3 (BSL-3) лаборатории, сотрудники, которые готовят для работы на этом уровне сдерживания 1. Лаборатория средств, оборудования, процедур и практики могут быть институциональными, государственных и федеральных надзора и контроля. Ищите соответствующую подготовку и утверждение, прежде чем пытаться следующие протоколы.
  2. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) для каждой процедуры, такие как одноразовые халаты, перчатки, щитки, и респираторы.
  3. Лечить рабочие поверхности с 70% спиртом до и после завершения процедуры.
  4. Культуры клеток и потенциально инфекционного материала обрабатываются в класс II биобезопасности кабинета (BSC).
  5. Mosquito бассейны гомогенизировали в смеситель-мельницу, которая находится внутри BSC.
  6. Mosquito гомогенатах центрифугируют в аэрозоль-плотные микроцентрифужных. Если эта процедура не может быть выполнена в течение BSC, оператор должен использовать респиратор при работе и извлечения образцов из центрифуги.
  7. Пипец и пипетки советы погрузочно-разгрузочных работ в BSC (биобезопасность кабинет) замачивают в 10% гипохлоритом перед автоклавированием. Все лабораторные отходы дезактивации в автоклаве перед удалением.

3. Подготовка клетки Веро

  1. Декантировать питательных сред из одной большой колбе культуры тканей (175 см 2) вырожденных клеток Веро (Clone E6) в отходы стакан, содержащий отбеливатель.
  2. Вымойте клеток Веро, добавив 5 мл аликвоту PBS и вихрем над слоем клеток и по бокам колбы и обязательно тщательно покрывают все монослоя.
  3. Декантировать PBS в отходы стакан.
  4. Добавить 2,5 мл трипсина-EDTA и вихрем над слоем клеток, убедившись, что полностью покрывают все монослоя.
  5. Инкубируйте колбы в инкубаторе в течение 5 минут при 37 ° C, 5% СО 2.
  6. Осторожно встряхните колбу и водоворот, чтобы удалить клетки от нижней поверхности. Клетки должны соскальзывать легко; инкубировать дополнительные 1-5 минут, если клетки не легко соскользнуть.
  7. Добавьте 5 мл Минимальная основных средствах массовой информации (MEM), 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), используя серологические пипетки и пипетки вверх-вниз 10-20 раз, чтобы разбить скопления клеток.
  8. Добавить еще 15 мл MEM, 5% FBS для общего объема 22,5 мл и хорошо перемешать.
  9. Место 40 малых культур тканей колбы (25 см 2) в вертикальном положении в двух стойках (20 колб / стойка).
  10. Место стеллажей содержащие колбы внутри шкафа биобезопасности и удалить колбу кепки, шапки размещения непосредственно перед колб.
  11. Внесите 4 мл MEM, 5% ЭТС в каждую колбу использованием серологических пипетки.
  12. Внесите 0,5 мл приостановлено клеток в каждой колбе (~ 1:06 коэффициент разделения) Замените колбу шапки.
  13. Добавьте 50 мл MEM, 5% ЭТС вернуться к первоначальному большой колбе культуре ткани, содержащей оставшиеся суспензии клеток (~ 2,5 мл) и вернуться к колбе инкубатора. Одной большой колбе культуры ткани могут быть использованы повторно до 5 проходов и затем новая колба должна быть настройки для его замены.
  14. Место небольшие культуры ткани колбы в штабелях на лоток. Swirl лоток, чтобы убедиться, что средства массовой информации равномерно покрывает дно flaks.
  15. Место небольшой колбы в инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО 2 и расти ночь до 80-90% вырожденная.

4. Подготовка комаров бассейнов

  1. Держите комаров бассейны холода во время процедуры тестирования. Используйте предварительно охлажденноеморозильник стойки и смеситель-мельница кассеты, ледяной реагентов, и центрифуга с охлаждением при обработке комаров бассейнов.
  2. Место пробирки с комарами в предварительно охлажденной морозильник стойки и добавить 1 - 1,5 мл PBS-G в каждую пробирку комаров.
  3. Получить смеситель-мельница кассеты из морозильной камеры. Место 24 труб в каждой кассете, а затем в безопасности в смеситель-мельницы.
  4. Однородный образцы в течение 4 минут при 25 циклов / секунду. Вибрационная мельница трясет труб с высокой скоростью и металла BB внутри каждой трубы нарушает комар ткани.
  5. Пробирки центрифужные в течение 6 минут при 7000 оборотах в минуту.
  6. Место трубы обратно в морозильник стойки до инокулировали в клетках Веро.

5. Заражение клеток Веро с москитной гомогенатах бассейн

  1. Не реже, чем один культуре ткани колбу из каждой серии под инвертированным микроскопом для обеспечения адекватного слияния и клеточной здоровья; рассчитывать примерно на 80-90% покрытия.
  2. Выстроить 20 малых культур тканей колбы в стойку и маркировать колбы с соответствующими номерами присоединения друг от комаров бассейн.
  3. Ослабить шапки и переливать большинство средств массовой информации из тканевой культуры колбы в отходы стакан. Оставьте достаточно средств массовой информации в колбе, чтобы полностью монослоя ячейки пальто.
  4. Алиготе 100 мкл надосадочной друг от комаров обрабатываются бассейна в соответствующую колбу культуры ткани.
  5. Установите и затяните крышку культуры колбу.
  6. Положите культуры колбы квартира на шейкере в течение 5 минут (комнатной температуры) на 35-40 оборотов в минуту.
  7. Возвращение 20 колб культуры тканей в вертикальное положение в стойке и место в BSC.
  8. Uncapping 3 колбы культуры ткани в одно время, обойтись 4 мл питательной среды в каждой колбе использованием серологических пипеток; заменить колпачки.
  9. Будьте уверены, что кончик пипетки не свяжется с шеи культуры колбу или губы. Изменение наконечники по мере необходимости, если происходит контакт с колбу.
  10. Инкубируют культуры тканей колбах при 37 ° C, 5% СО 2.

6. Скрининг Веро клетки для роста вируса

  1. Экран прививку колбы культуры тканей на наличие признаков вирусной инфекции, цитопатический эффект (ЦПЭ), от 3-7 дней после заражения.
  2. Осмотрите клеточных культур для CPE и / или загрязнения, наклоняя колб и изучения СМИ, что бассейны в нижней части колбы. СМИ появится облачно, как клетки ухудшаться во время CPE или за счет роста дрожжей, грибов, или бактериального заражения.
  3. Пересмотреть культурах клеток, которые обладают облачно СМИ под инвертированным микроскопом. Вирусы заставит клетки деформируются и вырваться из культуры колб. Клеточные культуры с видимыми загрязняющих веществ, например, дрожжи, других бактерий, грибков или тяжелого мусора комаров, которые повторное тестирование, передавая исходный пул комара через 0.22μM фильтр шприца.
  4. Асептических обойтись 1-2 мл СМИ от вируса-позитивных клеточных культур в подписанные cryotubes использованием серологических пипетки.
  5. Вирус культур хранятся при температуре -80 ° C до идентифицируются с помощью соответствующих диагностических тестов.

7. Подготовка реагентов

  1. MEM, 5% FBS. Растворите 37,6 г порошкообразного MEM в конечный объем 4 л дд H 2 0. Разлить раствор в 500 мл аликвоты в бутылках СМИ и автоклав. Когда раствор остынет, добавить асептически 26 мл тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 5,2 мл L-глутамина, 5,2 мл anti-biotic/mycotic и 10,4 мл 7,5% бикарбоната натрия в каждой бутылке. Хранить при температуре 4 ° С.
  2. PBS-G. Растворить 16 г хлористого натрия, 0,4 г хлорида калия, 2,3 г Na 2 HPO 4, 0,4 г KH 2 PO 4 и 4 мл 0,5% фенола красного в 1000 мл дд H 2 0. Отрегулируйте рН до 7.1-7.4 с 2 N NaOH (при необходимости). В отдельном стакане, тепло 600 мл H 2 0 до кипения. Удалить из горячей плиты, добавить 10 г желатина, и растворяются. Добавить растворенный желатин решение решение PBS и корректировать конечный объем до 2 л с дд H 2 O. Добавьте 100 мл раствора в бутылках и автоклав. Когда раствор остынет, добавить асептически 42,8 мл тепла инактивированной сыворотки кролика и 1,4 мл anti-biotic/mycotic. Хранить при температуре 4 ° С.
  3. PBS ячейки стирки. Добавьте 50 мл 10 раз PBS Дульбеко до 400 мл дд H 2 O. Отрегулируйте рН до 7,1 с 2 н. Отрегулируйте конечный объем до 500 мл с дд H 2 O. Фильтры решение с 0.2uM блок фильтра вакуума. Разлить в 5 мл аликвоты в 8 мл завинчивающейся крышкой трубки. Хранить при температуре 4 ° С.

8. Представитель Результаты

Девять различных вирусов из 4 семей таксономических были извлечены из комары, собранные в ходе непрерывного наблюдения по всему штату в Коннектикуте с 1997-2010 (таблица 1). Пять из этих вирусов, вызывающих заболевания человека, наиболее важных патогенов вирус Западного Нила и восточного лошадиного энцефалита. Новые открытия включают в себя: первое изоляции WNV от комаров, собранных вСеверной Америке в 1999 году 2, первый изоляции Потоси вируса на северо-востоке США в 2000 году 3, и первое изоляции Ла-Кроссе вируса в Новой Англии в 2005 году 4.

Вирус Семья Количество изолятов Количество мест Количество лет обнаружены Человека болезнь Работах.
Вирус Западного Нила Flaviviridae 1002 94 12 От умеренной до тяжелой, лихорадки, энцефалита 2,5
Вирус восточного конского энцефалита Togaviridae 292 41 10 Тяжелая, энцефалит 6,7
Highlands J вирус Togaviridae 178 39 11 Неизвестный 6
Джеймстаун Каньон вирус Буньявирусов 305 74 14 От легкой до умеренной, лихорадка, менингит 8
Потоси вирус Буньявирусов 259 76 4 Неизвестный 3
Кэш долине вирус Буньявирусов 114 51 8 От легкой до тяжелой, лихорадка, неврологические болезни в двух документально подтвержденных случаев
Trivittatus вирус Буньявирусов 83 21 11 Неизвестный
Ла-Кроссе вирус Буньявирусов 1 1 1 От умеренной до тяжелой, энцефалит 4
Фландрия вирус Rhabdoviridae 4 4 2 Неизвестный

Таблица 1. Вредоносные файлы, обнаруженные в поле, собранные от комаров Веро анализа культуры клеток. Комары были собраны во время наблюдения в штате Коннектикут с 1997-2010.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vero клеточной культуре анализа служит эффективным методом для скрининга поле, собранные комаров для разнообразия вирусов. Это контрастирует с молекулярными методами, которые специально направлены один или несколько вирусов, представляющих интерес. Более того, мы обнаружили, что Веро анализа культуры клеток в равной степени, если не более чувствителен, чем ПЦР-7 и дает нам изолятов вируса, которые хранятся в нашей справочной коллекции для будущих исследований. Тем не менее, системы клеточной культуре, может не подходить во многих случаях. Такой подход влечет за собой дополнительные расходы и подготовки, необходимой для роста вирусов в BSL-3 лаборатории, однако эти затраты могут быть компенсированы относительно недорогих материалов для клеточных культур. Стоит также отметить, что большинство, но не все комарами вирусы производят CPE в культуре клеток Vero 9,10. Вирус денге является одним заметным исключением того, что должны быть обследованы другой диагностический тест. В идеале, комбинация обоих молекулярной и клеточной культуре методы используются для тестирования на вирусную инфекцию. Мы в настоящее время с использованием обычных и количественный ПЦР-анализов 4,11,12, иногда в сочетании с секвенирования для выявления вирусов, выделенных в культуре клеток, и подтвердить инфекцию в организме комара бассейн.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы выражаем искреннюю благодарность важный вклад д-ра. Джон Андерсон, Эндрю Главная и Ширли Tirrell к настоящему исследованию. Эта работа была частично поддержана грантами от Центров по контролю и профилактике заболеваний (U50/CCU116806-01-1) и Министерство сельского хозяйства США (58-6615-1-218, CONH00768 и CONH00773).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16140
Anti-biotic/mycotic GIBCO, by Life Technologies 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. GIBCO, by Life Technologies 25080
L-Glutamine 200mM 100x GIBCO, by Life Technologies 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) GIBCO, by Life Technologies 11700
10X Dulbecco’s PBS GIBCO, by Life Technologies 14080
Trypsin-EDTA GIBCO, by Life Technologies 15400
Rabbit serum GIBCO, by Life Technologies 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon BD 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon BD 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
  2. Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
  3. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
  4. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
  5. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
  6. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
  7. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
  8. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
  9. Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. American Public Health Association. 189-212 (1995).
  10. Karabatsos, N. International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).
  11. Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
  12. Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics