Microfluidic 장치에서 Compartmentalization에 대한 E18 두피 랫 뉴런 준비

Biology
 

Summary

이 비디오에서는 E18 두피 랫 뉴런의 준비를 보여줍니다.

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Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (8), e305, doi:10.3791/305 (2007).

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Abstract

이 비디오에서는, 우리는 대뇌 피질 E18 쥐 뉴런의 준비를 보여줍니다. E18 피질 쥐의 뉴런는 이전에 다음 ID로 해부하고 준비 E18 태아 쥐의 대뇌 피질에서 얻을 수 있습니다. E18의 피질 개별 뉴런에 즉시 dissociated, 절개시입니다. 그것은 해리가 수행되기 전에 최대 일주일까지 4 B27를 포함하는 최대 절전 E 버퍼 ° C에서 E18 피질을 저장할 수 있습니다. 그러나, 세포 생존에 드롭있을 것입니다. 일반적으로 우리 E18 접속 신선한를 구하십시오. 그것은 차가운 얼음 칼슘 마그네슘 무료 무료 해부 버퍼 (CMFM)에있는 실험실로 이송됩니다. 도착하자마자, 트립신은 0.125 %의 최종 농도 피질에 추가됩니다. 대뇌 피질은 다음 팔분에 대해 37 ° C에서 incubated입니다. 10% FBS를 포함한 DMEM는 반응을 막기 위해 피질에 추가됩니다. 대뇌 피질은 다음 2 분 동안 2,500 rpm으로 centrifuged입니다. 뜨는 제거하고 신경 기저 미디어 2 ML (NBM)는 2퍼센트 B27 (권 / 권)와 Glutamax (권 / 권)이 다음과 위아래로 pipetting하여 다시 중단되는 피질에 추가됩니다 0.25 %를 포함합니다. 다음 피질은 연속된 작은 오프닝과 함께 이전에 화재 광택 유리 pipettes, 각 triturated 있습니다. triturating 후, 피질은 다시 2 분 동안 2,500 rpm으로 centrifuged입니다. 뜨는 그런 다음 제거 피질 펠렛은 B27와 Glutamax을 포함 NBM 2 ML로 다시 일시 중지되었습니다. 세포 현탁액은 다음 40 음 나일론 셀 스트레이너를 통해 전달됩니다. 다음 세포가 계산됩니다. 뉴런은 이제 신경 microfluidic 장치에 로딩을위한 준비가되어 있습니다.

Protocol

Compartmentalization에 대한 E18 태아 쥐 두피 뉴런 준비

밖으로 시작하기 전에, 그것은 37 ° C.에 필요한 모든 미디어 및 시약을 따뜻하게하는 것이 중요합니다

70 % 에탄올로 닦고으로 후드에 배치하는 세포 (예, 고무 전구, 튜브 랙, 미디어 병 등), 그 준비에 사용되는 모든 소독하는 것도 중요하다.

  1. 1 ML 얼음처럼 차가운 칼슘 마그네슘 무료 무료 해부 버퍼를 포함하는 15 ML 튜브에 넣어 E18 태아 쥐의 피질의 두 가지 (한 두뇌 이전 해부)를.
  2. 2 ML 및 0.125 %로 최종 트립신 농도에 최종 볼륨을 가져, 해부 버퍼에있는 피질로 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML을 추가합니다.
  3. 팔분에 대해 37 ° C의 물을 욕조에 15 ML 튜브를 놓습니다.
  4. 이 기간 동안, 화재 폴란드어 3 유리 파스퇴르 pipets은 불임을 유지하기 위해 biosafety 캐비닛에 연속 작은 구멍을 형성.
  5. 피질의 8 분 부화 후 DMEM는 트립신 반응을 멈출 수 있도록 도와줘 피질 10 % FBS를 포함한 10 ML를 추가합니다.
  6. 2 분 동안 2,500 rpm으로 피질과 DMEM/10 % FBS를 포함한 15 ML 튜브를 원심 분리기.
  7. biosafety 캐비닛에서 진공 흡입 붙어있는 유리 파스퇴르 pipet을 사용하여 피질에서 뜨는을 제거하십시오. 방해 또는 펠렛을 이동시키다하지 않도록주의하십시오.
  8. 피질 펠렛 부드럽게 pipet 위아래로 NMB 1 ML을 추가합니다. 이것은 공기 거품이 산화하여 세포를 손상시킬 수 있으므로, 아래 pipeting 및하면서 공기 방울을 만드는 피하기 위해 매우 중요합니다.
  9. 끝까지 멸균 고무 벌브를 장착하고 5 번하고 아래로 pipeting하여 피질을 씹다 수있는 넓은 개방과 함께 불을 광택 파스퇴르 pipet을 사용하여 다시 신중하면 공기 방울을 소개하지 않습니다. 감소 오프닝 크기 각각 다른 두 유리 pipets이 과정을 계속합니다.
  10. 분쇄 후 2 분 동안 2,500 rpm으로 다시 세포를 원심 분리기.
  11. 원심 분리 후, 다시 뜨는을 제거하고 NBM 2 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend.
  12. 45 음 셀 스트레이너를 통해 resuspended 세포 솔루션을 필터링합니다.
  13. 계산하고, 장치에 로드된 Trypan 블루와 세포를 얼룩. 우리는 일반적으로 장치마다 세포의 20 UL을로드합니다.

참고 : 세포의 최종 농도는 일반적으로 2,500,000 세포 / ML 및 8,000,000 세포 / ML 사이

세포를 로딩

세포가 계산되고 나면, 그것은 장치에있는 세포를 로드할 시간 :

  1. 불임을 유지하기 위해 biosafety 캐비닛에 NBM를 포함하는 이전에 준비 장치를 가져와.
  2. 진공 흡입하여 우물에서 여분의 미디어를 제거합니다. 그러나 미디어를 모두 제거하지 않도록주의 - 메인 채널의 일부 언론이 있어야합니다.
  3. (그림 필요한 경우 참조) 장치의 상단 왼쪽 저수지로 세포의 20 UL을 적용합니다. 세포의 장치에 흐름과 PLL 처리 표면에 첨부합니다.
  4. 로딩 후, 세포 부착 수 있도록 10 분 동안 인큐베이터에 다시 세포를 포함하는 장치를 놓으십시오.
  5. 십분 후에 다시 인큐베이터 미디어과 장소 장비와 저수지를 입력합니다.

Discussion

세포 밀도가 응용 프로그램에 따라 다양한하실 수 있습니다. 그러나 밀도가 너무 낮아에서 기본 뉴런을 심는 것은 일반적으로 세포 사망에 이르게한다. 인큐베이터와 습도의 수준에 따라, 미디어 장치마다 2~3일 변화해야 할 수 있습니다. 미디어를 변경하면, 그것은 주요 채널에서 미디어를 제거하지 않는다는, 저수지에서 미디어를 제거한 후에 중요합니다. 더 나아가, 그것은 최고 우물에 신선한 미디어를 장소와 신선한 미디어의 모든 저수지를 작성하기 전에 장치를 통해 주요 채널로 흘러 수 있도록하는 것이 좋습니다.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NBM medium Invitrogen 21103-049 Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos Animal Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS buffer ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA Reagent Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets Fisher Scientific glass
DMEM medium Invitrogen
FBS Reagent Invitrogen serum, used at 10% in DMEM
centrifuge set at 2500 rpm
Trypan Blue Invitrogen for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um Tool BD Biosciences Falcon cat# 352340 Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.

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References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).

Comments

6 Comments

  1. This is quite impressive.  How do you avoid the neurons in the small channels sticking to the PDMS and peeling off when you remove the slabs before fixation?  Is there some sort of special treatment for the PDMS or technique used before removal so the axons are not disturbed?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 20, 2008 - 2:05 PM
  2. Hello Allyson first, there are two ways to bond the device to glass, plasma bonding and by non-plasma bonding.  There are two other videos demonstrating this on JOVE that may interest you. If a device is plasma bonded to the glass it cannot be removed.  A non-plasma bonded device can be removed from the glass but if not done carefully axons in the microgrooves will get lifted off.  Some researchers have said that placing the device on ice for 5 minutes after fixing prior to removing the device helps keep the neurons on the glass. Most researchers including our lab just stain the neurons in the device and image them in the device.  For many applications this is sufficient enough.  If you wish to remove the device before staining then non-plasma bonding will have to be done and the device chilled briefly after fixing before removing.  Usually if one is going to remove the device for staining it is best to prepare a few samples in the likely hood that in some cases the neurons will be disturbed upon removing the device.

    Reply
    Posted by: Joseph H.
    June 20, 2008 - 3:07 PM
  3. Just wanted to let everyone know a company has formed to make and sell the neuron device. Please contact xonamicrofluidics@gmail.com for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 4, 2008 - 1:03 PM
  4. Hi, I was wondering- do the channels between the two compartments form a diffusion barrier? I would like to stimulate one of the culture chambers and not the other (using KCl)... Cheers

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 19, 2008 - 5:03 AM
  5. Hello John Brown Sorry for the late response.  Work has been done with gradients in microfluidic devices but the horizonatal channels were much, much wider.  I am not sure if in the Neuron Device a gradient is created.  There might be one on a small channel that would probably be hard to measure.  I would suggest searching PubMed by Dr. Noo Li Jeon.  He has published several papers with devices used to make gradients.  Feel free to contact me at xonamicrofluidics@gmail.com if you have other questions. JŒ

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2009 - 12:55 PM
  6. Hello, I want to know the process of dissection of Fetal Rat Cortexone brain.Because I should the experiment,but nobody would teach me.Thank you.

    Reply
    Posted by: Jun L.
    July 6, 2012 - 8:44 AM

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