डीएनए की फिंगरप्रिंटिंग माइकोबैक्टीरियम leprae चर संख्या मिलकर दोहराएँ (VNTR) का प्रयोग खींच

Immunology and Infection
 

Summary

कुष्ठ, की वजह से

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Jensen, R. W., Rivest, J., Li, W., Vissa, V. DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA). J. Vis. Exp. (53), e3104, doi:10.3791/3104 (2011).

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Abstract

Protocol

इस वीडियो अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए डेटा स्वरूप और शोधकर्ताओं है कि सिर्फ काम के इस प्रकार (चित्रा 1) शुरू किया जा सकता है के लिए व्याख्या के साथ काम प्रवाह के एक सिंहावलोकन प्रदान करना है. यह तकनीक, सरलीकृत प्रोटोकॉल और व्यावहारिक सुझावों के पहले प्रकाशित काम करता है में वर्णित का प्रदर्शन शामिल 5,10.

कार्य के सामान्य प्रवाह और प्रयोगशाला सुविधाएं:

वहाँ इस तरह के अनुसंधान के लिए कम से कम 3 अलग - अलग कार्य क्षेत्रों होना चाहिए. प्रयोगशाला 1 है) प्राइमर तैयारी के लिए एक पीसीआर हुड (स्वच्छ हवा बॉक्स या अलग कार्य क्षेत्र) (कमजोर पड़ने, विभाज्य तैयारी और मिश्रण), 2) से निपटने के लिए एक अलग कैबिनेट जैव सुरक्षित और डीएनए के अलावा के साथ एक पूर्व पीसीआर क्षेत्र पीसीआर मिश्रण के लिए, और 3) एक काम के बाद पीसीआर क्षेत्र तैयारी और जैल लोड हो रहा है के लिए और FLA के लिए नमूने तैयार करने के लिए. प्राइमर्स और डीएनए नमूने अलग फ्रीजर और रेफ्रिजरेटर में रखा जाना चाहिए. प्राइमर संदूषण प्रयोगशाला के काम में इस प्रकार के प्रमुख और सबसे लगातार समस्याओं में से एक है. प्राइमरों पीसीआर और घोला जा सकता है के लिए इस्तेमाल किया pipettes डीएनए के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. पूर्व पीसीआर, पीसीआर और बाद पीसीआर काम क्षेत्रों के लिए pipettes के अलग सेट किया जाना चाहिए. आम तौर पर, एक शोधकर्ता एक 12-24 घंटे मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग अवधि में 12-18 नमूने की प्रक्रिया कर सकते हैं.

काम के प्रत्येक चरण की शुरुआत से पहले:

  • एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनें. दस्ताने पहना जा सकता है किसी भी समय जैविक नमूने, प्राइमरों, डीएनए और ethidium ब्रोमाइड संभाला जा रहे हैं चाहिए. दस्ताने अक्सर बदलें.
  • एक पीसीआर कैबिनेट हुड, जैव सुरक्षा कैबिनेट या साफ कार्य क्षेत्र में कार्य करें.
  • एक ताजा बेंच कागज या पैड का उपयोग करें.
  • तरल पदार्थ और विंदुक युक्तियाँ के लिए उपयुक्त बर्बाद receptacles सेट.
  • पीसीआर डाकू और 70% इथेनॉल के साथ pipettes के अंदर के साथ नीचे पोछो.
  • विषय pipettes और पराबैंगनी प्रकाश में पीसीआर से पहले 15 मिनट के लिए कार्य क्षेत्र निर्धारित किया है. (पराबैंगनी प्रकाश crosslinks सतह डीएनए contaminants के.)
  • हमेशा डीएनए, प्राइमरों और पीसीआर अभिकर्मकों युक्त सामग्री के लिए एयरोसोल रोकथाम विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करें.
  • अपकेंद्रित्र हैंडलिंग द्वारा एयरोसोल बचने के लिए और पार संदूषण को रोकने के लिए खोलने से पहले किसी भी ट्यूबों / स्ट्रिप्स / प्लेटें तरल युक्त.

1. एम. leprae डीएनए तैयारी

क्लीनिकल एम. युक्त नमूने leprae कुष्ठ रोगियों को जो त्वचा क्लीनिक की यात्रा से प्राप्त कर रहे हैं . नियमित नैदानिक ​​नमूनों त्वचा पंच बायोप्सी, भट्ठा त्वचा स्मीयरों या नाक swabs हो सकता है. आम तौर पर, पंच बायोप्सी या slits त्वचा स्मीयरों आण्विक जानपदिक रोग विज्ञान के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं क्योंकि वे साफ कर रहे हैं और एम. के लिए पर्याप्त मात्रा में होते हैं leprae. इन सामग्रियों के अनुसंधान के लिए उपयोग संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार अनुमोदित किया जाना चाहिए.

  1. 70% इथेनॉल 1 मिलीलीटर पेंच टोपी के साथ एक शीशी में रक्षित बायोप्सी या त्वचा धब्बा नमूने भट्ठा.
  2. एक चर गति अपकेंद्रित्र पीठ टॉप में 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर प्रत्येक नमूना अपकेंद्रित्र.
  3. सतह पर तैरनेवाला निकालें और यह एक microcentrifuge ट्यूब में जगह. यदि आवश्यक हो, तो यह फिर से अपकेंद्रित्र इन नमूनों के लिए उपयोगी हो सकता है और अतिरिक्त ऊतक या डीएनए के बाद पुनर्प्राप्त कर सकते हैं.
  4. जोड़ें फॉस्फेट की 500 μl ऊतकों के नमूनों को खारा (पीबीएस) buffered और 1 घंटे के लिए सोख करने के लिए अवशिष्ट इथेनॉल परिरक्षक का आदान - प्रदान और नमूना rehydrate.
  5. 20 मिनट के लिए 12,000 XG पर एक पीठ टॉप अपकेंद्रित्र में नमूने अपकेंद्रित्र. बर्बादी निस्संक्रामक समाधान के साथ आंशिक रूप से भरा कंटेनर में पीबीएस समाधान त्यागें.
  6. बैक्टीरियल डीएनए Qiagen DNEasy रक्त और ऊतक निर्धारित दिशा निर्देशों का पालन किट का उपयोग कर निकालें.
  7. डीएनए निकाले 4 शीशियों में aliquoted होना चाहिए. स्टोर -80 2 aliquots डिग्री सेल्सियस भविष्य के उपयोग के लिए यदि / जब परीक्षण के परिणामों के reproducibility की आवश्यकता है या जब नई प्रौद्योगिकियों उपलब्ध हो जाते हैं. स्टोर एक विभाज्य -20 डिग्री सेल्सियस पर और एक 4 बजे ° सी अधिक तत्काल उपयोग के लिए.
  8. यह ऊतकों के नमूनों के साथ साथ एक 'निष्कर्षण रिक्त' तैयार करने के लिए समझदारी है. रिक्त सभी एक ही ऊपर उल्लिखित लेकिन ऊतक के बिना प्रदर्शन उपचार के अधीन है. पीसीआर के साथ रोगी के नमूने निकासी रिक्त गारंटी है कि ऑपरेटर निष्कर्षण तकनीक सही है और कि अभिकर्मकों डीएनए संदूषण से मुक्त हैं.

2. प्राइमर तैयारी

  1. Loci के लिए प्राइमर्स जिसके लिए वहाँ सबसे व्यापक तनाव प्रकार डेटा तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं. चार या पाँच प्राइमरों मल्टीप्लेक्स पीसीआर के लिए संयुक्त रहे हैं. प्रत्येक बिन्दुपथ के लिए एक प्राइमर एक 5 'फ्लोरोसेंट रासायनिक टैग कि केशिका electrophoresis टुकड़ा लंबाई विश्लेषण (FLA) के दौरान पता लगाया जाएगा वहन करती है.
  2. प्रत्येक मल्टीप्लेक्स पीसीआर संयोजन के लिए, टैग और प्रत्येक बिन्दुपथ के लिए इसी रिवर्स प्राइमर प्राइमर अलग Eppendorf ट्यूबों में संयुक्त कर रहे हैं: एक ट्यूब में आगे प्राइमरों, दूसरे में रिवर्स. शेयर प्राइमरों 100μM समाधान (2a चित्रा) के रूप में तैयार कर रहे हैं, जिनमें से एक हिस्से10 सुक्ष्ममापी की एकाग्रता ते का उपयोग करने के लिए 10x पतला (Tris EDTA 1x, 8.0 पीएच). 100 सुक्ष्ममापी प्राइमर समाधान के शेष aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर बाद में उपयोग के लिए संग्रहित कर रहे हैं.
  3. प्रत्येक 10 सुक्ष्ममापी प्राइमर के समान मात्रा में प्रत्येक प्राइमर के 2μM अंतिम सांद्रता में जिसके परिणामस्वरूप के लिए मिश्रित कर रहे हैं. जब प्राइमर संयोजन पीसीआर मिश्रण (टैबिल 3) करने के लिए जोड़ रहे हैं, प्रत्येक प्राइमर के अंतिम एकाग्रता 0.2 सुक्ष्ममापी बूँदें.

जब संयुक्त प्राइमरों पीसीआर मिश्रण (3 टेबल) को जोड़ा जाता है, अंतिम सांद्रता 0.2μM प्रत्येक करने के लिए ड्रॉप .

3. Amplifying बैक्टीरियल डीएनए मल्टीप्लेक्स पीसीआर का उपयोग

  1. पीसीआर सेटअप
    • है कि इस्तेमाल किया जा जाएगा नमूनों की संख्या रिकार्ड और आवश्यक प्लास्टिक और अन्य सामग्री को एकत्रित करने से पहले आवश्यक अभिकर्मकों और उनके संस्करणों के साथ किसी कार्यपत्रक को तैयार है.
    • बाँझ ट्यूबों / स्ट्रिप्स / प्लेटें नमूना संख्या के साथ पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जा लेबल. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण को शामिल करने के लिए याद रखें.
  2. एक सफाई समाधान (जैसे decon ELIMINase) और यह अनुसार तालिका 2 कार्यक्रम के साथ नीचे पोछो thermocycler सफाई के बाद और प्राइमरों और अन्य अभिकर्मकों संभालने से पहले दस्ताने बदलें .
  3. तालिका 3 और ट्यूबों / स्ट्रिप्स पीसीआर प्राइमर संयोजन और नमूना संख्या के लिए इस्तेमाल किया जा के साथ थाली / लेबल के अनुसार पीसीआर Mastermix तैयार .
  4. विभाज्य 18μl Mastermix के प्रत्येक लेबल पीसीआर नमूना अच्छी तरह से या ट्यूब के लिए. दस्ताने बदलें.
  5. नीचे 70% करने में मदद के लिए स्वच्छ और कीटाणुरहित कार्य क्षेत्र और उपकरणों, तो 15 मिनट के लिए किसी भी डीएनए contaminants के पार से लिंक के लिए यूवी प्रकाश के अधीन काम क्षेत्र और pipettes इथेनॉल के साथ एक अलग कैबिनेट जैव - सुरक्षा और pipettes साफ कर लें. दस्ताने बदलें.
  6. स्वच्छ जैव सुरक्षित कैबिनेट में, प्रत्येक ट्यूब / अच्छी तरह से थाली 20μl (चित्रा 2b) की कुल मात्रा का अधिग्रहण. पीसीआर सभी तरल सामग्री के लिए एयरोसोल रोकथाम विंदुक युक्तियाँ का प्रयोग करें Mastermix डीएनए टेम्पलेट की 2μl जोड़ने.
  7. पीसीआर ट्यूबों / स्ट्रिप्स / प्लेटें संक्षिप्त अपकेंद्रित्र के लिए सामग्री मिश्रण.
  8. Thermocycler में नमूना ट्यूबों / स्ट्रिप्स / थाली प्लेस और पीसीआर प्रोग्राम प्रारंभ करते हैं.
  9. जब कार्यक्रम पूरा हो गया है, 4 thermocycler और स्टोर से उत्पादों ° C वैद्युतकणसंचलन जब तक हटायें.

4. पीसीआर उत्पादों की जेल वैद्युतकणसंचलन

* इस प्रोटोकॉल कई वर्षों के लिए मानक किया गया है और एक वैकल्पिक कदम है कि अगर पहले पीसीआर उत्पादों की पुष्टि FLA के लिए उन्हें भेजने के लिए वांछित है नियोजित किया जा सकता है.

  1. एक अलग काम के बाद पीसीआर क्षेत्र में, एक 2% agarose जेल तैयार करते हैं. 1x TBE के 2.0g agarose powder/100ml (Tris / / borate EDTA) एक कुप्पी में बफर समाधान का उपयोग करें. गर्मी एक माइक्रोवेव ओवन में के बारे में 1.5-2 मिनट के लिए मिश्रण. भंवर सामग्री, फिर हीटिंग अगर agarose भंग करने के लिए आवश्यक है. थोड़ा शांत और एक नमूने के लिए पर्याप्त कुओं के साथ एक कंघी का उपयोग के रूप में जेल डालना.
  2. 4 से पीसीआर उत्पादों निकालें डिग्री सेल्सियस और के बारे में 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र.
  3. पीसीआर उत्पाद के दो - 5μl 1μl 0.5 5x या 6x जेल लोड हो रहा है बफर (लोड हो रहा है बफर विभिन्न कंपनियों से उपलब्ध है, या प्रयोगशाला में मिश्रित किया जा सकता है व्यंजनों ऑनलाइन उपलब्ध हैं. है) के साथ मिक्स
  4. 6μl बफर / नमूना लोड हो रहा है मिश्रण के साथ जेल के कुओं का लोड. एक अच्छी तरह से (अधिमानतः एक 20 बीपी सीढ़ी) के लिए एक आणविक सीढ़ी जोड़ें.
  5. लगभग 90 मिनट के लिए 100V पर जेल चलाएँ.
  6. जेल, ethidium ब्रोमाइड समाधान में 15-30 मिनट के लिए भिगोएँ तो समय के एक बराबर राशि के लिए ultrapure आसुत जल में.
  7. जेल छवि जबकि यूवी प्रकाश लागू किया जाता है. 4-5 डीएनए खंडों में से प्रत्येक के संयोजन में (चित्रा 3) के लिए एक बैंड होना चाहिए .
  8. संस्था के खतरनाक सामग्री नीति के अनुसार जेल के निपटान. Ethidium ब्रोमाइड समाधान उचित निपटान से पहले कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है.

5. टुकड़ा लंबाई विश्लेषण के लिए तैयारी के नमूने (FLA)

  1. एक साफ Eppendorf ट्यूब में, एक से एक ताजा विभाज्य और प्रत्येक नमूना के लिए परीक्षण किया जा 0.3μl GeneScan -500 लिज़ साइज़िंग मानक (एप्लाइड BioSystems से दोनों) के मास्टर हाय-डि formamide समाधान के 12μl युक्त मिश्रण तैयार करते हैं. (Formamide हाय डि - रासायनिक डीएनए strands पहले denatures वैद्युतकणसंचलन केशिका, हीटिंग के लिए नष्ट करने की जरूरत है.) का उपयोग एक 96 अच्छी तरह से ऑप्टिकल गुणवत्ता प्रतिक्रिया थाली, विभाज्य 12.3μl formamide - Liz के मिश्रण से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से नमूने और सेट के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है अलग थाली.
  2. अपने रिकॉर्ड के लिए संकेत है जो हर अच्छी तरह से डीएनए नमूने में (चित्रा 4a) एक थाली नक्शा बनाओ .
  3. ट्यूबों / स्ट्रिप्स या एक 96 अच्छी तरह से थाली का प्रयोग, 59μl पीसीआर पीसीआर उत्पाद के 1:60 कमजोर पड़ने गुणवत्ता बनाने के पानी के लिए पीसीआर उत्पाद के 1μl (भाग 3) से जोड़ने . Dilutions डेटा या जेल बैंड के FLA के चमक से सिग्नल की शक्ति के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. यहां तक ​​कि डीएनए सकते हैं कम सांद्रतापर्याप्त हो (1:120 या 1:180).
  4. Formamide - Liz के मिश्रण युक्त थाली में अच्छी तरह से करने के लिए सही पतला पीसीआर उत्पाद के 1μl जोड़ें.
  5. गति और दक्षता बहुत अगर पीसीआर को भी एक 96 - अच्छी तरह से थाली में किया गया था बढ़ाया जा सकता है. एक बस अनुक्रम में 3 ऐसे प्लेटों लाइन कर सकते हैं: पीसीआर उत्पादों, पीसीआर उत्पादों के कमजोर पड़ने के लिए बाँझ पानी के साथ दो प्लेट, और formamide और टुकड़ा लंबाई विश्लेषण के लिए नौकरशाही का आकार घटाने सीढ़ी के साथ 3 प्लेट के साथ एक प्लेट. एक multichannel विंदुक FLA की तैयारी के एक त्वरित प्रक्रिया के लिए अनुमति देता है.

नमूना विश्लेषण के माध्यम से जेनेटिक विश्लेषक

  1. जेनेटिक विश्लेषक जांचना निर्माता अनुदेश के अनुसार लागू flurophores का पता लगाने के लिए. डाई सेट है कि Liz के शामिल का उपयोग सुनिश्चित करें.
  2. पानी कंटेनर पुनर्भरण कुल्ला और (1x) EDTA (एप्लाइड BioSystems) के साथ नए रनिंग बफर जोड़ने के लिए कक्षों बफर.
  3. थाली करने के लिए एक छेद पूर्व सिलिकॉन पट जोड़ें और जगह थाली लिए डिज़ाइन पकड़े ट्रे में. जेनेटिक विश्लेषक पर 'ट्रे' बटन प्रेस autosampler आगे लाने के लिए. Autosampler पर प्लेस ट्रे और जेनेटिक विश्लेषक के लिए दरवाजा बंद.
  4. बनाएँ या विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट आयात करते हैं. देश में लाने योग्य फ़ाइलों. Plt विस्तार किया है और टैब - सीमांकित प्रारूप में हैं. फ़ाइलें एक्सेल (माइक्रोसॉफ्ट) या इसी तरह के कार्यक्रमों में संशोधित किया जा सकता है.
  5. नमूने केशिका लंबाई (50 सेमी, बहुलक पॉप -7) में 15 एस के लिए 1.6 केवी का एक इंजेक्शन वोल्टेज लागू करने के द्वारा अंतःक्षिप्त रहे हैं केशिका electrophoresis 60 डिग्री सेल्सियस पर 15 केवी के 1800 सेकंड के लिए वोल्टेज पर चलाता है. पूरी प्रक्रिया के बारे में 45 मिनट लगते हैं.
  6. एक बार एक रन पूरा हो गया है, विश्लेषण प्रत्येक नमूना के लिए डेटा फ़ाइलों में FSA एक्सटेंशन के साथ परिवर्तित कर रहे हैं और एक प्लेट फ़ाइल फ़ोल्डर (चित्रा 4b) में रखा है. प्रत्येक डेटा फ़ाइल आकार में लगभग 100 KB है और एक फ्लैश ड्राइव पर भंडारित किया जा सकता है या ज़िपित और ईमेल. डेटा फ़ाइलें उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर देखा जा सकता है है अबी GeneMapper या पीक स्कैनर जैसे.

6. टुकड़ा लंबाई परिणामों का विश्लेषण

  1. फ्लोरोसेंट केशिका electrophoresis से डेटा के विश्लेषण के लिए विशेष सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है. यदि ऐसे सॉफ्टवेयर उपलब्ध नहीं है, एप्लाइड Biosystems वेबसाइट पर जाने के लिए और पीक स्कैनर डाउनलोड . सॉफ्टवेयर मुफ्त है और काफी अच्छी तरह से काम करता है. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
  2. ओपन पीक स्कैनर और 'जोड़ें फ़ाइलें' के द्वारा पीछा नई परियोजना शुरू ' . कार्यक्रम में चयनित. FSA सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित डेटा फ़ाइलें, लोड.
  3. (पर प्रकाश डाला) का चयन करें और सभी लोड फ़ाइलें "विश्लेषण". GS500 (-250) और विश्लेषण विधि:: सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना "आकार मानक करने के लिए सेट कर दिया जाता है साइज़िंग पीपी - डिफ़ॉल्ट प्रेस 'विश्लेषण'.
  4. प्रत्येक नमूने में डीएनए टुकड़े द्वारा उत्पादित रंग चोटी के आधार जोड़े में आकार जांच करते हैं.
  5. बेस जोड़े में प्रत्येक चोटी आकार मूल्य रिकार्ड और यह सकारात्मक नियंत्रण के शिखर की तुलना.
  6. सकारात्मक नियंत्रण नमूनों में चोटियों अनुकूल बेस जोड़े और अग्रानुक्रम दोहराता 4-7 टेबल्स में सूचीबद्ध की इसी संख्या की संख्या के साथ तुलना करना चाहिए.
  7. निर्धारित कितने कम अग्रानुक्रम दोहराने क्षेत्रों सकारात्मक नियंत्रण के साथ तुलना के द्वारा प्रत्येक नमूने एलील में मौजूद हैं. हम NHDP63 जो प्रत्येक जांच की जा रही ठिकाना पर किया गया है VNTR प्रतियों की संख्या के लिए अनुक्रम का उपयोग करें 4.
  8. तुलनात्मक और / या गणितीय विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट में दर्ज डेटा दर्ज करें. VNTR 'उंगलियों के निशान' या haplotypes, परिभाषित loci में alleles के तार कि एक एम. के लक्षण हैं leprae तनाव.

7. प्रतिनिधि परिणाम

पीसीआर उत्पादों की जेल वैद्युतकणसंचलन उम्मीद है कि प्राइमर संयोजन में प्रत्येक बिन्दुपथ (चित्रा 3) के लिए एक बैंड का उत्पादन होगा. चित्रा 3 में, जेल करने के लिए दो वर्गों हैं: शीर्ष अनुभाग एक पीसीआर के नमूने और निचले हिस्से युग्म 2 नमूने युग्म है. प्रत्येक अनुभाग में एक 20 आधार जोड़ी आणविक सीढ़ी, पीसीआर 8 मरीज के नमूनों से प्राप्त उत्पादों द्वारा पीछा है. युग्म 1 भी एक नकारात्मक नियंत्रण और अंततः एक सकारात्मक नियंत्रण (NHDP63 तनाव) है. (2 संयोजन के लिए नियंत्रण एक अलग जेल पर थे.) ध्यान दें कि ज्यादातर नमूने संयोजन में स्पष्ट रूप से प्रत्येक ठिकाना के लिए 5 बैंड, 1 प्रदर्शित. कुछ मामलों में, बैंड भी एक साथ बंद करने के लिए केवल चार बैंड की उपस्थिति में जिसके परिणामस्वरूप अलग loci के रूप में प्रकट हो सकता है.

उम्मीद amplicon आकार तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं हमारी प्रयोगशाला एम. के NHDP63 तनाव का उपयोग करता है. leprae एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में. माइक्रोसेटेलाइट loci (1-5 आधार दोहराता के साथ) और minisatellite loci (अधिक से अधिक 5 बेस जोड़े कई बार दोहराया क्षेत्रों के साथ): दोहराने क्षेत्रों के दो प्रकार अध्ययन किया गया है.

केशिका electrophoresis से डेटा फ़ाइलों की व्याख्या 2 के मानकों पर निर्भर करता है: एक आंतरिक डीएनए टुकड़ा साइज़िंग मानक (अबी) GeneScan 500LIZ और एक बाहरी प्रवर्धित जीवाणु के डीएनए की सकारात्मक नियंत्रण नमूना कहा जाता है.

पीक स्कैनर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके देखा, FLA chromatograms आंकड़े 5a 5b, और 6 में देखा जा सकता है.

पीक स्कैनर amplicon आकार पर डेटा (बेस जोड़े में x-अक्ष) और सिग्नल की शक्ति (y-अक्ष) प्रदान करता है. (चित्रा 5 ब) पीक क्षेत्र, आदि पर अतिरिक्त डेटा भी उपलब्ध हैं, यद्यपि आकार और चोटी की ऊँचाई मान सबसे महत्वपूर्ण हैं . ऊंचाई में 100 इकाइयों की तुलना में कम चोटियों आम तौर पर भी कमजोर संकेत करने के लिए विश्वसनीय हो माना जाता है.

चित्रा 6 सकारात्मक (NHDP63) नियंत्रण और दो ​​मरीज ​​के नमूनों की तुलना, बिन्दुपथ (GTA) 9 में अग्रानुक्रम दोहराता की संख्या में एक परिवर्तन दिखा . सकारात्मक नियंत्रण में, अनुक्रम (GTA) 10 बार दोहराया है. NHDP63 VNTR और amplicon आकार जीन अनुक्रमण के माध्यम से सत्यापित किया गया. रोगी 4 के पीसीआर amplicon 3 बीपी सकारात्मक नियंत्रण दर्शाता है वहाँ केवल 9 दोहराने इकाइयां हैं, जबकि 6 रोगी amplicon है कि 3 बीपी NHDP63 के 11 दोहराता (GTA) खुलासा से बड़ा है की तुलना में छोटे है. रोगी कम या कोई डीएनए पीसीआर प्रतिकृति, इसलिए कोई FLA संकेत के साथ 2 कम बैक्टीरियल सूचकांक (बीआई) था.

FLA डेटा की व्याख्या में यह कभी कभी 'बड़बड़ा' का एक परिणाम के के रूप में होता है. पीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान, डीएनए पोलीमरेज़ टुकड़े कि 1 या अधिक दोहराता अब या स्रोत एलील की तुलना में कम कर रहे हैं उत्पादन हो सकता है. ये आम तौर पर कम मुख्य चोटी के आसपास की ऊंचाई चोटियों के रूप में पहचाने जाते हैं. कि है, दोहराने बड़ा या प्रिंसिपल चोटी की तुलना में छोटे खंड के आधार जोड़े की सही संख्या सीढ़ी पर 'वे किया जाएगा. परिणाम एक ही रंग की चोटियों के एक परिवार के 7 चित्रा है. बिन्दुपथ (टीए) 10 के साथ यह पता चलता है.

FLA के साथ एक और कभी कभी कठिनाई का सामना करना पड़ा है 'A +' या 'एक - पीछा' है, जिसमें डीएनए पोलीमरेज़ एक एकल नकल की डीएनए खंड के 3 'अंत तक आम तौर पर (एक) adenine] आधार कहते हैं. शामिल यह FLA में एक मुख्य या हकलाना चोटी कि एक आधार जोड़ी आसन्न के रूप में 8 चित्रा में दिखाया चोटी से बड़ा है की सही करने के लिए एक चोटी के रूप में दिखाता है. यह एक मुख्य या हकलाना चोटी के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए. एक प्रमुख चोटी और एक पूंछ के एक प्रजाति माना जाता है. पूंछ एक VNTR दोहराता की संख्या को बदल नहीं है. (कुछ डीएनए पोलीमरेज़ किट के लिए विशेष रूप से एक पीछा को बढ़ावा देने के क्रम में इस confounding प्रभाव को कम करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं एक पीछा पूरा बढ़ावा देना. बजाय एक एकल चोटियों की एक जोड़ी चोटी का उत्पादन करता है.)

डीएनए निष्कर्षण और पीसीआर उत्पादों दोनों एम. होते हैं leprae और मानव डीएनए, लेकिन 18 (टीए) के अपवाद के साथ, प्राइमरों पर्याप्त विशिष्ट है कि वे केवल जीवाणु के डीएनए बढ़ाना कर रहे हैं, और वहाँ कम या कोई मानव डीएनए प्रवर्धन है . (टीए) 18 242 आधार जोड़े है कि मानव डीएनए से है और armadillo passaged डीएनए नमूने (9 चित्रा) में देखा नहीं है पर अक्सर एक चोटी पैदा करता है .

प्राइमरों के शैल्फ जीवन आम तौर पर अच्छा है बशर्ते कि वे ° -20 सी, केवल तत्काल उपयोग के लिए हटा पर रखा जाता है, और फिर 4 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस जब तक भस्म. प्राइमर्स 4 डिग्री के लिए सी 1-2 सप्ताह में स्थिर होना चाहिए. हालांकि पीसीआर के लिए प्राइमर संयोजन बनाने के कुछ समय लगता है, यह सिफारिश की है कि तत्काल उपयोग के लिए ही पर्याप्त प्राइमर संयोजन तैयार रहना. प्राइमर के संयोजन के लिए कुछ हद तक नीचा जब लंबे समय के लिए भंडारित करने लगते हैं.

ते बड़े शेयरों से aliquoted होना चाहिए, और aliquots या तो जमे हुए या कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है. 200 400μl बड़ा aliquots सूखे या केंद्रित प्राइमर शेयरों गिराए (2a चित्रा) के लिए अच्छा कर रहे हैं. 10-50 μl के छोटे aliquots प्राइमर 3 और 4 संयोजनों की मात्रा का सप्लीमेंट के लिए उपयोगी होते हैं. ते सस्ती है और aliquots उपयोग के बाद त्याग किया जाना चाहिए.

मल्टीप्लेक्स एंजाइम किट काफी महंगा है और होना चाहिए जमी उपयोग करें जब तक (-20 डिग्री सेल्सियस) रखा. पीसीआर तैयारी के बाद किसी भी अप्रयुक्त मल्टीप्लेक्स समाधान 4 करने के लिए तुरंत वापस चाहिए डिग्री सेल्सियस पर्याप्त के बारे में 65-70 PCRs के लिए, छोटे Qiagen मल्टीप्लेक्स पीसीआर किट मल्टीप्लेक्स मिश्रण समाधान के प्रत्येक युक्त 0.85ml (850μl) 3 ट्यूबों के साथ आता है.

आम तौर पर, यह सबसे अच्छा है दोहराया, डीएनए नमूने प्राइमरों, और मल्टीप्लेक्स किट समाधान सहित प्रयोगशाला काम के इस प्रकार में प्रयुक्त सामग्रियों के लिए प्रमुख तापमान परिवर्तन से बचने के. -20 डिग्री सेल्सियस पर सभी सामग्री संग्रहित किया जाना चाहिए जब तक की जरूरत है, और फिर 4 पर रखा डिग्री सेल्सियस जब तक भस्म. डीएनए की लंबी अवधि के भंडारण -80 पर होना चाहिए डिग्री सेल्सियस

खर्च ऊतक प्राइमरों, और / या डीएनए युक्त सामग्री और autoclaved का निपटारा किया जाना चाहिए अब किसी काम का नहीं है जब. सभी नमूनों इलाजसाथ ethidium ब्रोमाइड या formamide खतरनाक कचरे के रूप में इलाज किया जा चाहिए और संस्था के खतरनाक सामग्री नीति के अनुसार में निपटाया.

तालिका 1
तालिका 1: NHDP63 तनाव के लिए Amplicon आकार

तालिका 2
तालिका 2: VNTR पीसीआर के लिए पैरामीटर साइकल चलाना

तालिका 3
तालिका 3: पीसीआर की तैयारी

तालिका 4
तालिका 4: 1 युग्म के लिए ऐल्लि कॉल

5 टेबल
तालिका 5: 2 युग्म के लिए ऐल्लि कॉल

6 टेबल
तालिका 6: 3 युग्म के लिए ऐल्लि कॉल

7 टेबल
7 तालिका: 4 युग्म के लिए ऐल्लि कॉल

चित्रा 1
चित्रा 1: VNTR FLA प्रक्रिया प्रवाह आरेख

चित्रा 2
चित्रा 2. (क) युग्म 1 ऊपरी प्राइमर्स की तैयारी (Eppendorf ट्यूब चित्र सौजन्य www.clker.com ). (ख) पीसीआर सेटअप (8 PCRs लिए) (www.clker.com के Eppendorf ट्यूब चित्र सौजन्य)

चित्रा 3
चित्रा 3. युग्म 1and 2 VNTR पीसीआर उत्पाद डीएनए के agarose जेल

चित्रा 4a
चित्रा 4b
चित्रा 4. (क) FLA प्लेट नक्शा (ख) FLA डेटा फ़ाइलें *. FSA

चित्रा 5a
चित्रा 5 ब
चित्रा 5. (क) सकारात्मक नियंत्रण FLA Chromatogram (NHDP63) युग्म 1 VNTR loci के लिए (ख) 9 पीक amplicon आकार और बहुतायत के लिए स्कैनर डेटा (GTA) .

चित्रा 6
चित्रा 6 पीसी (NHDP63) के लिए पीसीआर के नमूनों का ठिकाना (GTA) 9 के लिए तुलना करें.

7 चित्रा
7 चित्रा मुख्य और 10 (टीए) के लिए हकलाना Peaks .

8 चित्रा
चित्र: 8 + ए (एक पूंछ) मुख्य या हकलाना Peaks से सटे Peaks.

9 चित्रा
चित्र: 9 (टीए) 18 मुख्य पीक, हकलाना Peaks और मानव डीएनए पीक

चित्रा 10a
चित्रा 10b
चित्र: 10 (ए) एम. के तनाव भेदभाव leprae VNTR डेटा पर आधारित (बी) एम. के तनाव भेदभाव leprae MLVA डीएनए फिंगरप्रिंट के आधार पर

Discussion

कुष्ठ रोगियों से त्वचा के नमूनों का संग्रह कुशल चिकित्सकों या त्वचा क्लीनिक में काम कर रहे तकनीशियनों की आवश्यकता है. प्रयोगशाला इन नमूनों से निपटने श्रमिकों प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और सुरक्षात्मक आँख पहनने पहनते हैं और एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम जब armadillo या ऊतक मानव के संक्रमित नमूनों से निपटने के लिए महान ख्याल रखना चाहिए. सतहों और उपकरणों की कीटाणुशोधन भी महत्वपूर्ण है. एक स्वच्छ, बाँझ जैव सुरक्षित कैबिनेट में कार्य डीएनए नमूनों के संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.

डीएनए निष्कर्षण Qiagen जैसी कंपनियों से निकासी किट के विकास के लिए अपेक्षाकृत आसान धन्यवाद बन गया है. निर्देशों का सावधानी से पालन किया जाना चाहिए. सभी नमूनों ठंडा रखा जाना चाहिए जब उपयोग में नहीं है. दोहराया, नमूने के लिए अत्यधिक तापमान परिवर्तन से बचें.

इस काम में इस्तेमाल किया डीएनए प्राइमरों विभिन्न कंपनियों जो इस पत्र के अंत में साहित्य के संदर्भ की सूची में उद्धृत किया गया है से आदेश दिया जा सकता है. देखभाल के लिए एक डीएनए मुक्त वातावरण में प्राइमरों के साथ काम करने में संक्रमण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. प्राइमर्स शुष्क पाउडर के रूप में आते हैं और ते के साथ मिश्रित किया जाना चाहिए और एक 100μM एकाग्रता के लिए पतला है, तो छोटी मात्रा (2a चित्रा ) में विभाजित है. प्राइमरों के कार्य समाधान आगे 10μM सांद्रता को पतला कर रहे हैं. फिर, डीएनए नमूने क्षेत्रों / डाकू जहां प्राइमरों इस्तेमाल किया और तैयार में प्रयोग नहीं करते.

पीसीआर उत्पादों को भी नहीं जब उपयोग में ठंडा रखा जाना चाहिए.

एक 3% agarose जेल तैयारी बेहतर डीएनए बैंड जुदाई दे, लेकिन अब लगता है को चलाने के लिए. विशुद्ध रूप से गुणात्मक प्रयोजनों के लिए, 2% आमतौर पर पर्याप्त है. Ethidium ब्रोमाइड agarose जैल में डीएनए को धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान है कि त्वचा के माध्यम से अवशोषित है एक अत्यधिक सक्रिय genotoxin है. इस समाधान है और यह महान देखभाल का उपयोग कर और हमेशा दस्ताने पहनना सुनिश्चित किया जा रहा के साथ दाग जैल संभाल. किसी भी डीएनए नमूने या ethidium ब्रोमाइड सामग्री से निपटने के बाद हाथ अच्छी तरह धो लें. Ethidium ब्रोमाइड धुंधला समाधान के निपटान धोने और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार जैल. जैल नियमित की आवश्यकता नहीं कर रहे हैं, यह कदम एक बार FLA तरीकों को स्थापित किया गया है समाप्त किया जा सकता है. यह समय और अभिकर्मक लेने है.

formamide FLA के लिए नमूने की तैयारी में इस्तेमाल किया समाधान भी बेहद जहरीला है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए. इसके उपयोग के बाद हाथ धो लें. संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन यह निपटाने की.

FLA के परिणाम पीक स्कैनर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पढ़ना चुनौतीपूर्ण हो सकता है है . एलील कॉल (अग्रानुक्रम दोहराता की संख्या) का एक बुनियादी सेट CSU (07/04 टेबल्स) में विकसित किया गया है. (यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि 4-7 टेबल्स सभी समावेशी नहीं हो सकता है. एम. के अन्य उपभेदों के रूप में leprae अध्ययन कर रहे हैं, प्रतिलिपि संख्या के साथ सूचीबद्ध पर्वतमाला के बाहर alleles पाया जा सकता है.) एक विशेष चुनौती 'हकलाना' चोटियों शामिल है. इन चोटियों के STRs है कि केवल (टीए) जैसे 10 2-3 आधार जोड़ी को दोहराता है, शामिल, विशेष रूप से परिवारों रहे हैं. कभी कभी सही चोटी का चयन पढ़ने के लिए मुश्किल है (चित्रा 7 ). यह आंकड़ा 190 बीपी पर सकारात्मक नियंत्रण में चरम मुख्य शिखर है. ऊंचाई में कम चोटियों, कि 2 हैं 4, या यहाँ तक कि 6 बेस जोड़े के रूप में बड़े या मुख्य चोटी की तुलना में छोटे 'हकलाना चोटियों.' कहा जाता है एक पीछा भी भ्रम की स्थिति पैदा कर सकते हैं. एक पीछा पहले पाठ में और चित्रा 8 में वर्णित है. अंत में, यदि पीसीआर उत्पादों को उच्च नमूनों में प्रचुर मात्रा में हैं, चोटियों एक डबल कील के साथ प्रकट हो सकता है. इस मामले में चोटी के फार्म का केंद्र पढें. (चित्रा 6, 6 रोगी देखें.)

डेटा प्रबंधन काम के इस प्रकार के लिए एक दुर्जेय कार्य किया जा सकता है. यह महत्वपूर्ण है जैसे सभी प्रयोगों के लिए सभी प्रासंगिक जानकारी के रिकॉर्ड के लिए: एक कार्य या प्रक्रिया की तारीख, ऑपरेटर, पट्टी / प्लेट नक्शे, FLA आदेश, पीसीआर स्थितियों और व्यंजनों, जैल और तस्वीरों के दिनांक, भंडारण तापमान, डीएनए टेम्पलेट dilutions, FLA इलेक्ट्रॉनिक फ़ाइल का भंडारण स्थानों, आदि अच्छा संगठन और डेटा प्रबंधन समय के घंटों को बचाने के लिए भविष्य में जानकारी के विशिष्ट टुकड़े के लिए देख खर्च कर सकते हैं.

यहाँ वर्णित प्रयोगशाला कई वर्षों के लिए काम किया गया है पर कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय में और दुनिया भर के अन्य स्थानों पर जा रहा है. एकत्र आंकड़ों के सब क्या मतलब है और यह भविष्य के उपयोग के के कैसे हो सकता है की एक बड़ी तस्वीर उभरने लगा है. आंकड़े 10A और 10B प्रदर्शन कैसे इन डीएनए उंगलियों के निशान अलग एम. भेद किया जा सकता (10A) देशों के बीच या भी परिवारों (10B) के बीच leprae उपभेदों . परिवार और सामुदायिक मामलों लिंक्ड एम. ले दिखाया गया है leprae समान या समान VNTR तनाव प्रकार की. आशा है कि यह संभव हो ताकि संचरण नेटवर्क का एक प्रारंभिक पहचान प्रणाली उन लोगों को राज्यमंत्री के लिए विकसित किया जा सकता है कुष्ठ रोग के संचरण के मोड (ओं) में आगे अंतर्दृष्टि लाभ हो सकता हैजोखिम है, और है कि उपचारात्मक ड्रग थेरेपी पर टी स्थायी तंत्रिका विज्ञान और dermatological नुकसान किया है से पहले शुरू कर सकते हैं.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

अनुदान NIH / NIAID RO1 - ऐ - 63,457 अनुदान और ARRA अनुदान S1 RO1 - ऐ - 63,457 पूरक द्वारा प्रदान की गई थी. हम प्रयोगशाला समूह और सहयोगियों के सभी वर्तमान और अतीत के सदस्यों के योगदान को स्वीकार करते हैं.

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