Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione

Biology
 

Summary

Un glicole etilenico metodo basato vetrificazione per embrioni di topo è descritto. E 'vantaggioso per altri metodi nella sua semplicità e bassa tossicità embrionale, e quindi può essere ampiamente applicabile a molti ceppi di topi, compresi topi inbred e geni modificati.

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Mochida, K., Hasegawa, A., Taguma, K., Yoshiki, A., Ogura, A. Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification. J. Vis. Exp. (57), e3155, doi:10.3791/3155 (2011).

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Abstract

Crioconservazione di embrioni di topo è una base tecnologica che supporta scienze biomediche, perché molti ceppi di topi sono stati prodotti da modificazioni genetiche e il numero è costantemente aumentando di anno in anno. Il suo sviluppo tecnico è iniziato con i metodi di congelamento lento nel 1970 1, seguito da metodi di vetrificazione sviluppati alla fine del 1980 2. In generale, la tecnica di questi ultimi è vantaggioso nella sua rapidità, semplicità e capacità di sopravvivenza elevato di embrioni recuperati. Tuttavia, i crioprotettori contenuti sono altamente tossici e possono influenzare il successivo sviluppo embrionale. Pertanto, la tecnica non era applicabile a alcuni ceppi di topi, anche quando le soluzioni sono raffreddato a 4 ° C per mitigare l'effetto tossico durante la manipolazione degli embrioni. Al Bioresource RIKEN Center, più di 5000 ceppi di topi con differenti background genetici e fenotipi sono mantenuti 3, e quindi abbiamo ottimizzato a te vetrificazionechnique con i quali siamo in grado di crioconservare embrioni da molti diversi ceppi di topi, con i benefici di sopravvivenza dell'embrione alto dopo vetrificazione e scongelamento (o liquefazione, più precisamente) a temperatura ambiente 4.

Qui vi presentiamo un metodo di vetrificazione per embrioni di topo che è stato utilizzato con successo presso il nostro centro. La soluzione crioconservazione contiene glicole etilenico invece di DMSO per ridurre al minimo la tossicità di embrioni 5. Esso contiene inoltre Ficoll e saccarosio per la prevenzione delle devetrificazione e regolazione osmotica, rispettivamente. Gli embrioni possono essere gestite a temperatura ambiente e trasferiti in azoto liquido entro 5 minuti. Poiché il metodo originale è stato ottimizzato per cannucce di plastica come contenitori, abbiamo leggermente modificato il protocollo per cryotubes, che sono più facilmente accessibili in laboratorio e più resistenti ai danni fisici. Abbiamo anche descrivere la procedura di scongelamento di embrioni vetrificata nel dettaglio, perché è un critico step per il recupero efficiente dei topi vivi. Queste metodologie sarebbe utile a ricercatori e tecnici che hanno bisogno di conservazione dei ceppi di topi per un uso successivo in modo sicuro e conveniente.

Protocol

Lo schema generale di questo esperimento è mostrato in fig. 1.

1. Preparazione dei reagenti

  1. Rendere il terreno base (qui in nota come PB1) in una bottiglia da 100 ml in vetro secondo la seguente tabella di seguito:
    MW mM mg/100ml
    NaCl 58,4 136,98 800,0
    KCl 74,6 2,68 20,0
    KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0
    Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O 358,14 8,04 288,1
    MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0
    180,2 5,56 100,0
    Na piruvato 110 0,33 3,6
    CaCl 2, 2H 2 O 147 0,9 13,2
    Penicillina G 6,0 (circa)
  2. Rendere il Ficoll-saccarosio (FS) soluzione:
    1. Aggiungere le seguenti sostanze chimiche a 14 ml di PB1 soluzione, in tubo da 50 ml.
      Ficoll 70 6,0 g
      Saccarosio 3,424 g
      BSA 42,0 mg
    2. Mescolare Ficoll 70 e saccarosio in PB1 soluzione e agitare bene fino a completo scioglimento.
    3. Dopo aver controllato completa dissoluzione sopra, aggiungere BSA sulla superficie della soluzione e la tiene a4 ° C fino a BSA è completamente sciolto (> 4 ore o durante la notte).
  3. Rendono la soluzione di equilibrio (EFS20) e la soluzione vetrificazione (EFS40) in una provetta da 50 ml:
    • EFS20: 20% (v / v), glicole etilenico, il 24% (w / v) Ficoll, e 0,4 mol / L di saccarosio in PB1 con BSA
    • EFS40: 40% (v / v), glicole etilenico, il 18% (w / v) Ficoll, e 0,3 mol / L di saccarosio * in PB1 con BSA
      * Per gli embrioni dal ceppo BALB / c o ICR, aumentare la concentrazione di saccarosio di 0,9 mol / L di saccarosio perché sono più sensibili ai cryodamage 6.
    EFS20 soluzione EFS40 soluzione
    Glicole etilenico 1 ml 2 ml
    FS soluzione 4 ml 3 ml
  4. Sterilizzare la soluzione per filtrazione con un filte 0,45 micronr. Fai aliquote in provette da 5 ml in polistirolo e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 6 mesi.
  5. Preparazione della soluzione scongelamento degli embrioni contenenti saccarosio 0,75 M (TS1)
    1. Sciogliere 7,7 g di saccarosio in PB1 (preparato nel passo 1.1) e portare il volume complessivo di 30 ml. Mescolare agitando delicatamente fino a quando saccarosio è completamente sciolto.
    2. Aggiungere 90 mg di BSA sulla superficie della soluzione e lasciare riposare fino a completo scioglimento.
    3. Sterilizzare la soluzione per filtrazione.
    4. Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese.

    Nota: TS1 può anche essere disponibili in commercio preparati a partire da M2.
    1. Sciogliere 7,7 g di saccarosio in M2 e portare il volume complessivo di 30 ml.
    2. Mescolare agitando delicatamente fino a quando saccarosio è completamente sciolto.
    3. Sterilizzare la soluzione per filtrazione.
    4. Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese.
  6. TS2 (soluzione scongelamentocontenenti saccarosio 0,25 M):
    1. Diluire 10 ml TS1 con 20 ml di PB1 o M2, a seconda dei casi.
    2. Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese.

2. Vetrificazione di 2-cell embrioni di topo

  1. Preparare 2-cellule da embrioni di topo accoppiamento naturale o convenzionale nelle tecniche di fecondazione in vitro.
  2. Aliquota 50 microlitri EFS40 in un CryoTube. D'ora in poi, eseguire il resto della procedura di vetrificazione a temperatura ambiente.
  3. Aliquota 50 ml di EFS20 sul fondo di una 35 mm o 60 mm piatto di plastica Petri.
  4. Trasferimento fino a 30 embrioni per EFS20 utilizzando un capillare di vetro con solo la quantità minima di terreno di coltura. Avviare un timer per 2 min.
    Nota: gli embrioni Posizionare sul fondo della goccia. Questo rende la disidratazione efficiente degli embrioni. Controllare la morfologia degli embrioni da uno stereomicroscopio. Embrioni disidratati mostrano una morfologia rimpicciolito, come mostrato in fig. 2A.Se non sono abbastanza disidratato, attendere per più di 1 o 2 min.
  5. A circa 1,5 minuti, raccogliere gli embrioni dal menu EFS20 con solo la quantità minima della soluzione. Trasferirli EFS40 nel CryoTube preparato in 2.1 passo. Nota: Per ottenere risultati ottimali, regolare il tempo di raccogliere gli embrioni in modo che tutti gli embrioni possono essere trasferiti in EFS40 a circa 2 min.
  6. Attendere 1 min.
  7. Mettere il CryoTube direttamente in azoto liquido (LN 2).

3. Scongelamento vetrificati 2-cell embrioni di topo

  1. Prima di scongelamento, preparare un piatto con 10 gocce ml di terreno di coltura degli embrioni per gli embrioni di recupero (vedi punto 3.13). Coprire il piatto con l'olio e mettere in un incubatore CO 2 fino al momento dell'uso. Nota: Anche se tutti i mezzi per la coltura degli embrioni di routine possono essere utilizzati in questo esperimento, si consiglia di media con maggiore osmolarità come medium M16.
  2. TS1 caldo a 37 ° C.
  3. Indossare una maschera viso e cryogloves. Aprire la LN 2 tank e recuperare un CryoTube contenente gli embrioni.
  4. Aprire rapidamente la parte superiore del tubo ed eliminare LN 2. Attendere 30 secondi per evitare TS1 dal gelo nel passaggio successivo.
  5. Utilizzare una pipetta 1000ul aggiungere 850 ml di TS1 (37 ° C) nella provetta e miscelare la soluzione da pipettings dolce (circa dieci volte in 25 secondi) fino a quando la soluzione è sciolto in modo uniforme.
  6. Trasferire l'intero volume del tubo di plastica ad una parabola di 60 millimetri Petri (o un vetro da orologio) (Fig. 3A). Nota: Gli embrioni devono essere gestiti a temperatura ambiente (22-25 ° C) fino a quando non sono posti in un incubatore a CO 2 Passo 3.14.
  7. Avviare un timer per 3 min.
  8. A circa 2 minuti in TS1, agitare delicatamente il piatto fino a quando il supporto contenente embrioni si sviluppa sulla superficie del piatto (Fig. 3B). Nota: Questo aiuterà gli embrioni andare fino in fondo perché sono galleggianti in prossimità della superficie quando vengono trasferiti su TS1.
  9. Mettete tre da 50 ml di gocce su TS2 °e piatto (Fig. 3C).
  10. Dopo 3 minuti in TS1, controllare la morfologia degli embrioni da uno stereomicroscopio, ma dovrebbe essere leggermente rimpicciolito. Vedere la morfologia degli embrioni in precedenza (Fig. 2B) e più tardi (Fig. 2C) in TS1. Nota: Se gli embrioni sono ancora gonfi, tenerli in TS1 per di più 1 per 3 min.
  11. Raccogliere gli embrioni e trasferirli la prima goccia di TS2 (Fig. 3D). Avviare un timer per 3 minuti
  12. Dopo 3 minuti, trasferire gli embrioni per la seconda goccia e poi alla terza derivazione (Fig. 3E).
  13. Trasferire gli embrioni al mezzo di coltura preparato a punto 3.1. Gli embrioni sono a forma mostrato in fig. 2D.
  14. Piatto posto in un incubatore CO 2. Circa 10 minuti dopo, il trasferimento di embrioni per la caduta successiva del terreno di coltura per lavare saccarosio che è stato riportato da TS2.
  15. Continua la cultura in un incubatore a CO2 fino al trasferimento degli embrioni.
    Nota: Il trasferimento Embryos alla ovidotti delle femmine destinatario il giorno del disgelo. Cultura lungo in vitro può diminuire la vitalità degli embrioni in alcuni ceppi di topi.

4. Rappresentante dei risultati:

In vitro - e in vivo, lo sviluppo di embrioni dopo lo scongelamento è presentato nelle tabelle 1 e 2. I vantaggi di questo protocollo sono l'elevata capacità di sopravvivenza degli embrioni dopo lo scongelamento e la sua vasta applicabilità a diversi ceppi di topi.

Tensione Numero totale di tubi Numero di embrioni vetrificata Recupero (N. (%)) Morfologicamente normali (N. (%)) Sviluppo di blastocisti (N. (%))
C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87)
BALB / cA 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84)
ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90)

Tabella 1. In vitro, sviluppo di vetrificati-embrioni scongelati in ceppi di topo comune

Condizione di embrioni Numero di femmine destinatario Numero di embrioni trasferiti Siti di impianto (n. (%)) Vivere prole (N. (%))
Fresco 12 180 141 (78.3) 110 (61.1)
Vetrificati 16 242 202 (83.5) 125 (51.7)

Tabella 2. In vivo-sviluppo di vetrificati-embrioni scongelati nei topi C57BL/6J.

Figura 1
Figura 1. Lo schema complessivo dell'esperimento, comprese equilibrio, vetrificazione, e lo scongelamento degli embrioni.

Figura 2
Figura 2. La morfologia degli embrioni in ogni fase del disgelo.

Figura 3
Figura 3. Procedura di scongelamento di embrioni. Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente. (A), Aggiungere 850 ml di TS1 (37 ° C) in un CryoTube e trasferire l'intero volume della soluzione in CryoTube su un piatto di plastica. A questo punto, gli embrioni aspetto gonfio come mostrato in fig. 2B. (B), Stendere la soluzione sulla superficie del piatto da parte agitando delicatamente. (C), Place tre da 50 ml di gocce TS2 sul piatto di plastica. (D), trasferimento degli embrioni per la prima goccia di TS2. Dopo 3 minuti, gli embrioni aspetto shurunken come mostrato in fig. 2C. (E), Trasferimento li serialeLy in TS2 restanti gocce e poi al mezzo di coltura.

Discussion

Dal momento che il primo rapporto di vetrificazione del mouse embrione da Rall e Fahy nel 1985 2, diversi miglioramenti tecnici sono stati fatti per aumentare la capacità di sopravvivenza degli embrioni dopo lo scongelamento. Una delle modifiche di maggior successo è stato ottenuto mediante l'uso di glicole etilenico come crioprotettore a causa della sua bassa tossicità ed elevata permeabilità di membrana. Tali vantaggi ci permettono di gestire il congelamento degli embrioni a temperatura ambiente 4; metodi di vitrificazione altri richiedono embrione consegna a temperature più fredde e non sono sempre applicabili ad alcuni ceppi di topi compresi BALB / c 6. A base di glicole etilenico la prima vetrificazione è stato sviluppato da Kasai et al. nel 1990 5,7. Poiché il metodo originale è stato ottimizzato per cannucce di plastica come contenitori, abbiamo leggermente modificato il protocollo per cryotubes, che sono più facilmente accessibili in laboratorio e più resistenti ai danni fisici. Pertanto, il metodo di vetrificazione qui descritte possono essere applicable a molti laboratori usando topi come modelli di ricerca. Lo stesso metodo può essere utilizzato anche per embrioni di topo a morula e di blastocisti fasi 8 e 9 embrioni di ratto. Tuttavia, abbiamo recentemente scoperto che la qualità del cryotubes possono influenzare i tassi di sopravvivenza degli embrioni dopo il congelamento-scongelamento. Quindi, è essenziale esaminare la superficie interna del cryotubes per la sua morbidezza gli embrioni prima di vetrificazione (ad esempio, vedere tabella di reagenti e attrezzature specifiche).

Metodi di vetrificazione hanno molti vantaggi rispetto ai tradizionali metodi di congelamento lento, ma di per sé hanno uno svantaggio rispetto a scopo di trasporto. Come embrioni vetrificata deve essere mantenuto al di sotto dei -120 ° C per mantenere la loro vitalità, spedizionieri a secco sono generalmente utilizzati per il loro trasporto sicuro. Spedizionieri secco sono pesanti e ingombranti, e la loro andata e ritorno è costoso, soprattutto per il trasporto internazionale. Ora siamo attualmente sviluppando un nuovo metodo di vetrificazioneche gli embrioni vetrificate possono essere conservati a temperatura di ghiaccio secco (circa -80 ° C) per almeno 7 giorni 10. Questo metodo dovrebbe essere la vetrificazione della prossima generazione.

Disclosures

Non abbiamo nulla da rivelare.

Acknowledgements

Questo studio è stato condotto in collaborazione con il Progetto Bioresource Nazionale, il Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia, Giappone.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin Merck & Co., Inc. 12657
Ethylene glycol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 058-00986
Ficoll 70 GE Healthcare 17-0310-10
Glucose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 041-00595
NaCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 191-01665
KCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 163-03545
KH2PO4 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 169-04245
Na2HPO4·12H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 500-04195
MgCl2 ·6H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 135-00165
CaCl2 ·2H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 031-00435
Penicillin G Sigma-Aldrich P-4687
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P-8574
Sucrose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 196-00015
M16 medium Sigma-Aldrich M7292
M2 medium Sigma-Aldrich M7167
Cryotube Sumitomo Bakelite Co., Ltd. MS-4501 “Cryogenic Vial”

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References

  1. Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
  2. Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
  3. Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
  4. Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
  5. Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
  6. Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
  7. Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
  8. Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
  9. Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
  10. Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).

Comments

14 Comments

  1. Please, one question about the medium EFS²0 and EFS40:
    Are they prepared simply using the proportions described in the table EG/FS 1:4 and EGFS ²:5 (table), or is it the another formula described in the text (EFS²0: ²0% (v/v) etthylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA. Thanks in advance .Cleide from Brazil.

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 17, 2012 - 2:23 PM
  2. Thank you for your interesting.
    The first, we prepare FS solution consist of 30% (w/v) Ficoll and 0.5 mol/L sucrose in PB1 with BSA. And mix with ethylene glycol 1:4 or ²:3 for preparation of EFS²0 and EFS40, respectively. Finally, EFS²0 consists with ²0% (v/v) ethylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA.
    Keiji from Japan

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 18, 2012 - 12:44 AM
  3. Thanks Keiji for your response.
    I have another question: what embryo culture medium did you use until cryopreservation?
    You have very good results.
    congratulations
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 18, 2012 - 3:28 PM
  4. I have always used CZB medium (Chatot CL, et al. 1989, J. Reprod. Fertil. 86:679-688) containing 5.6 mM glucose, 0.1 mg/ml PVA, and 3.0 mg/ml bovine serum albumin after IVF for around ²0 hrs and after cryopreservation until embryo transfer.
    The data in table 1 were obtained with CZB medium.
    I also recommend you to use KSOM medium instead of CZB medium.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 20, 2012 - 9:53 PM
  5. Ok Keiji.
    Thank you very much.
    best regards
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 21, 2012 - 9:56 AM
  6. Keiji,
    I'm very interested in your protocol. I've just a question about the preparation of the PB1 solution. Do you just dissolve all the components in the order of your list in 100mL distilled H²0 or do you readjust the pH?
    Thanks in advance.
    Maryline from Belgium

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 6, 2012 - 4:49 AM
  7. Thank you for your interesting.

    About PB1 preparation , you can also find the protocol in the book, "Manipulating the Mouse Embryo" as modified D-PBS.
    We can prepare this solution to dissolve all components in the order of our list.

    However, usually we prepare PBS (-) solution first, which consists of NaCl, KCl, Na²HPO4 and KH²PO4.
    Then, after preparation of x100 concentrated MgCl² and CaCl² solutions, respectively, each 0.1 ml solution are slowly added in 98 ml of PBS(-) solution with gently mixing.
    Because this PBS(+) solution can be stored in refrigerator for several months.
    Before using, we dissolve other reagents, glucose, Na pyruvate and penicillin G.
    This PB1 solution can be used for at least a few weeks by storing in refrigerator.
    In the other hand, we can buy the powder or tablet of PBS(-) from some companies.

    And we do not adjust the pH.

    I hope this coment will be a help for you.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    July 8, 2012 - 11:05 PM
  8. Thank you very much! Your coment is really helpful.
    Maryline

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 9, 2012 - 2:36 AM
  9. Hello,
    I wanted to try this method using 8-cell embryo. I noticed that the freezing media the PB1 is with BSA. How much BSA do you add?

    Thanks,
    Agnes
    Thanks,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2016 - 5:30 PM
  10. Thank you for your interesting.

    PB1 contains 3 mg/ml of BSA. Finally, vitrification solution (EFS40) contains 1.26 mg/ml of BSA.

    And this method is effective for the embryos at each stage from 1-cell to early blastocyst include 8-cell stage.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    April 6, 2016 - 8:30 PM
  11. Hello,
    I tried the procedure but I found out that it is very hard to see the embryos after transferring them in EFS20. They floated and changed shape. I lost half the number of the embryos that I collected. Is there any practical tip that you can tell me to avoid this problem?
    Also, could I harvest the embryos in M2 and freeze them using you freezing media?

    Thanks again.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2016 - 1:22 PM
  12. Thank you for your interesting.

    If you can release embryos with small volume of medium near the bottom of EFS20 solution, you can find all embryos in small area. And we also recommend that it becomes easy to discover embryos at the surface of EFS20 solution by control of the light with the adjustment lever.

    The developmental ability of embryos will decrease at outside of incubator. However, the embryos must be left outside of incubator more than 10 min., the medium contains HEPES (ex. M2, HEPES-KSOM) or PB1 solution should be used.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:13 AM
  13. Hi,

    I think there is a mistake in the step 1.2.1: Add the following chemicals to 14 ml of PB1 solution in a 50 ml tube.
    Shouldn't it be 20ml?

    Thanks,
    Tony

    Reply
    Posted by: Tony N.
    April 28, 2016 - 4:16 AM
  14. Hi, Tony

    You are right.
    Total volume will be 20 ml.
    The conical tube of 50 ml is useful for preparation of this solution.

    Thank you.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:20 AM

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