Cryoconservation d'embryons de souris par base d'éthylène glycol vitrification

Biology
 

Summary

Une base d'éthylène glycol méthode de vitrification des embryons de souris est décrite. Il est avantageux à d'autres méthodes dans sa simplicité et une faible toxicité embryonnaire, et ne peut donc être largement applicable à de nombreuses souches de souris, y compris les souris consanguines et génétiquement modifiées.

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Mochida, K., Hasegawa, A., Taguma, K., Yoshiki, A., Ogura, A. Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification. J. Vis. Exp. (57), e3155, doi:10.3791/3155 (2011).

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Abstract

Cryoconservation des embryons de souris est une base technologique qui soutient les sciences biomédicales, car de nombreuses souches de souris ont été produites par des modifications génétiques et le nombre est en augmentation constante d'année en année. Son développement technique a commencé avec méthodes de congélation lente dans les années 1970 1, puis suivie par des méthodes de vitrification développé à la fin des années 1980 2. Généralement, cette dernière technique est avantageuse dans sa rapidité, la simplicité et la survivabilité élevée d'embryons récupérés. Cependant, le contenu cryoprotecteurs sont très toxiques et peuvent affecter le développement embryonnaire ultérieur. Par conséquent, la technique n'est pas applicable à certaines souches de souris, même lorsque les solutions sont refroidies à 4 ° C afin d'atténuer l'effet toxique lors de la manipulation d'embryons. Au Centre RIKEN bioressources, plus de 5000 souches de souris avec différents fonds génétiques et les phénotypes sont maintenues 3, et donc nous avons optimisé une TE de vitrificationchnique avec laquelle nous pouvons cryoconserver embryons de nombreuses souches différentes de souris, avec les avantages de survie des embryons après vitrification haute et la décongélation (ou liquéfaction, plus précisément) à la température ambiante 4.

Ici, nous présentons une méthode de vitrification des embryons de souris qui a été utilisé avec succès dans notre centre. La solution contient de l'éthylène glycol cryoconservation au lieu de DMSO pour minimiser la toxicité pour les embryons 5. Il contient également de Ficoll et de sucrose pour la prévention de dévitrification et l'ajustement osmotique, respectivement. Les embryons peuvent être manipulés à la température ambiante et transféré dans l'azote liquide dans les 5 min. Parce que la méthode originale a été optimisé pour les pailles en plastique comme les conteneurs, nous avons légèrement modifié le protocole pour cryotubes, qui sont plus facilement accessibles dans les laboratoires et les plus résistants aux dommages physiques. Nous décrivons également la procédure de décongélation des embryons vitrifiés en détail parce que c'est un ste critiquesp pour la récupération efficace des souris vivantes. Ces méthodologies serait utile aux chercheurs et aux techniciens qui ont besoin de préservation de souches de souris pour une utilisation ultérieure d'une manière sûre et rentable.

Protocol

Le schéma global de l'expérience est montré dans la Fig. 1.

1. Préparation des réactifs

  1. Rendre le milieu de base (ici en tant que connue PB1) dans une bouteille de verre de 100 ml selon le tableau ci-dessous:
    MW mM mg/100ml
    NaCl 58,4 136,98 800,0
    KCl 74,6 2,68 20,0
    KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0
    Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O 358,14 8,04 288,1
    MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0
    180,2 5,56 100,0
    Pyruvate de Na 110 0,33 3.6
    CaCl 2, 2H 2 O 147 0.9 13,2
    La pénicilline G 6,0 (environ)
  2. Faites le Ficoll-sucrose (FS) solution:
    1. Ajouter les substances chimiques suivantes à 14 ml de PB1 solution dans un tube de 50 ml.
      Ficoll 70 6,0 g
      Saccharose 3,424 g
      BSA 42,0 mg
    2. Mélanger Ficoll 70 et du saccharose dans PB1 solution et bien agiter jusqu'à dissolution complète.
    3. Après vérification de la dissolution complète ci-dessus, ajouter la BSA sur la surface de la solution et le conserver à4oC jusqu'à ce BSA est complètement dissous (> 4 heures ou jusqu'au lendemain).
  3. Faire la solution d'équilibrage (EFS20) et la solution de vitrification (EFS40) dans un tube de 50 ml:
    • EFS20: 20% (v / v) d'éthylène glycol, 24% (p / v) de Ficoll, et de 0,4 mol / L de saccharose dans PB1 avec BSA
    • EFS40: 40% (v / v) d'éthylène glycol, 18% (p / v) de Ficoll, et de 0,3 mol / L de saccharose * en PB1 avec BSA
      * Pour les embryons de la souche BALB / c ou ICR, augmenter la concentration de saccharose à 0,9 mol / L de saccharose, car ils sont plus sensibles aux cryodamage 6.
    EFS20 solution EFS40 solution
    L'éthylène glycol 1 ml 2 ml
    Solution de FS 4 ml 3 ml
  4. Stériliser la solution par filtration en utilisant une filte 0,45 umR. Faire aliquotes dans des tubes de 5 ml en polystyrène et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ 6 mois.
  5. Préparation de la solution d'embryon dégel contenant 0,75 M de saccharose (TS1)
    1. Dissoudre 7,7 g de saccharose dans PB1 (préparé à l'étape 1.1) et porter le volume total à 30 ml. Mélanger en secouant doucement jusqu'à complète dissolution du saccharose.
    2. Ajoutez 90 mg de BSA sur la surface de la solution et laisser reposer jusqu'à dissolution complète.
    3. Stériliser la solution par filtration.
    4. Aliquoter et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois.

    Note: TS1 peuvent également être préparés à partir de M2 ​​disponibles commercialement.
    1. Dissoudre 7,7 g de saccharose dans M2 et porter le volume total à 30 ml.
    2. Mélanger en secouant doucement jusqu'à complète dissolution du saccharose.
    3. Stériliser la solution par filtration.
    4. Aliquoter et stocker à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois.
  6. TS2 (solution dégelcontenant 0,25 M de saccharose):
    1. Diluer 10 ml avec 20 volumes TS1 ml de PB1 ou M2, le cas échéant.
    2. Aliquoter et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois.

2. La vitrification d'embryons de souris à 2 cellules

  1. Préparer deux cellules d'embryons de souris par accouplement naturel ou conventionnel dans les techniques de fécondation in vitro.
  2. Aliquote de 50 ul EFS40 dans un cryotube. Ci-après, exécuter le reste de la procédure de vitrification à la température ambiante.
  3. Aliquote de 50 pl d'EFS20 sur le fond de 35 mm ou 60 mm en plastique plat de Pétri.
  4. Transfert jusqu'à 30 embryons à l'aide d'un EFS20 capillaire en verre avec seulement le montant minimum du milieu de culture. Démarrer une minuterie pendant 2 min.
    Remarque: les embryons Placer sur le fond de la goutte. Cela rend efficacité de la déshydratation des embryons. Vérifiez la morphologie des embryons par un stéréomicroscope. Embryons déshydratés montrent une morphologie ratatinée, comme indiqué dans la Fig. 2A.Si elles ne sont pas déshydratés assez d'attendre pour plus d'1 ou 2 min.
  5. À environ 1,5 min, ramasser les embryons dans le menu déroulant EFS20 avec seulement le montant minimum de la solution. Transférez-les dans le cryotube EFS40 préparé en 2,1 étapes. Note: Pour les meilleurs résultats, ajuster le calendrier de ramasser des embryons de telle sorte que tous les embryons peuvent être transférés dans EFS40 à environ 2 min.
  6. Attendre 1 min.
  7. Mettez le cryotube directement dans l'azote liquide (LN2).

3. La décongélation des embryons de souris vitrifié 2-cellules

  1. Avant de décongélation, préparer un plat avec 10 gouttes ul de milieu de culture embryonnaire des embryons récupérés (voir l'étape 3.13). Couvrir le plat avec de l'huile et placer dans un incubateur à CO 2 jusqu'à son utilisation. Note: Bien que tous les médias pour la culture d'embryons de routine peuvent être utilisées dans cette expérience, nous recommandons médias avec plus osmolarité tel que le milieu M16.
  2. TS1 chaud à 37 ° C.
  3. Mettez un masque visage et cryogloves. Ouvrez la LN 2 tank et récupérer un cryotube contenant des embryons.
  4. Ouvrir rapidement le haut du tube et jeter LN 2. Attendre 30 secondes pour éviter le gel des TS1 à l'étape suivante.
  5. Utiliser une pipette 1000ul d'ajouter 850 l de TS1 (37 ° C) dans le tube et mélanger la solution par pipetages douce (environ dix fois en 25 secondes) jusqu'à ce que la solution est uniformément dissoute.
  6. Transférer la totalité du volume du tube pour un plat en plastique de 60 mm de Pétri (ou un verre de montre) (figure 3A). Remarque: Les embryons doivent être manipulés à la température ambiante (22-25 ° C) jusqu'à ce qu'ils soient placés dans un incubateur à CO 2 à l'étape 3.14.
  7. Démarrer une minuterie pendant 3 min.
  8. A environ 2 min dans TS1, secouez doucement la parabole jusqu'à le milieu contenant les embryons est étalé sur la surface de la parabole (figure 3B). Note: Ceci aidera les embryons vont vers le bas parce qu'ils sont flottants près de la surface lors de son transfert à TS1.
  9. Mettez trois gouttes de 50 pl d'TS2 sur ee plat (figure 3C).
  10. Après 3 min dans TS1, vérifier la morphologie des embryons par un stéréomicroscope, ils devraient être légèrement rétrécie. Voir la morphologie des embryons en plus tôt (figure 2B) et plus tard (figure 2C) en TS1. Remarque: Si les embryons sont encore gonflées, les garder dans TS1 pour plus de 1 à 3 min.
  11. Ramassez les embryons et les transférer à la première goutte de TS2 (Fig. 3D). Démarrer une minuterie pendant 3 min
  12. Après 3 minutes, le transfert des embryons à la baisse de secondes, puis à la troisième baisse (Fig. 3E).
  13. Transfert des embryons dans le milieu de culture préparé à l'étape 3.1. Les embryons sont dans la forme représentée dans la Fig. 2D.
  14. Placez-vaisselle dans un incubateur à CO 2. Environ 10 minutes plus tard, le transfert des embryons à la baisse prochaine du milieu de culture pour laver le saccharose qui a été reporté de TS2.
  15. Poursuivre la culture dans un incubateur à CO2 jusqu'au transfert d'embryon.
    Remarque: Le transfert EmbryOS pour les oviductes des femelles receveuses au jour de décongélation. Longue culture in vitro peut diminuer la viabilité des embryons chez certaines souches de souris.

4. Les résultats représentatifs:

In vitro - et in vivo-développement des embryons après décongélation est présenté dans les tableaux 1 et 2. Les avantages de ce protocole sont les chances de survie élevé d'embryons après décongélation et son large applicabilité à différentes souches de souris.

Souche Nombre total de tubes No. d'embryons vitrifiés Réformé (n ° (%)) Morphologiquement normaux (n ° (%)) Développement d'blastocystes (n ° (%))
C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87)
BALB / ca 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84)
ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90)

Tableau 1. In vitro-développement de vitrifiés et décongelés embryons dans des souches de souris commune

Condition d'embryons Nombre de femelles receveuses No. d'embryons transférés Sites d'implantation (n ° (%)) Des jeunes vivants (n ° (%))
Fraîches 12 180 141 (78.3) 110 (61.1)
Vitrifié 16 242 202 (83.5) 125 (51.7)

Tableau 2. In vivo, le développement des vitrifiés et décongelés embryons chez des souris C57BL/6J.

Figure 1
Figure 1. Le schéma d'ensemble de l'expérience, y compris l'équilibration, la vitrification, et la décongélation des embryons.

Figure 2
Figure 2. La morphologie des embryons à chaque étape de décongélation.

Figure 3
Figure 3. Dégel procédure d'embryons. Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante. (A), ajouter 850 l de TS1 (37 ° C) dans un cryotube et le transfert de la totalité du volume de la solution dans le cryotube sur un plat en plastique. A cette époque, les embryons chercher gonflées comme indiqué dans la Fig. 2B. (B), étaler la solution sur la surface du plat en le secouant doucement. (C), 50 gouttes Placer trois pl d'TS2 sur le plat en plastique. (D), le transfert des embryons pour la première goutte de TS2. Après 3 minutes, les embryons chercher shurunken comme indiqué dans la Fig. 2C. (E), les transférer sériement dans le reste TS2 gouttes et puis au milieu de culture.

Discussion

Depuis le premier rapport de la vitrification des embryons de souris par Rall et Fahy, en 1985, 2, plusieurs améliorations techniques ont été faits pour accroître la capacité de survie des embryons après décongélation. Une des modifications les plus réussies a été atteint par l'utilisation de l'éthylène glycol comme un cryoprotecteur en raison de sa faible toxicité et de haute perméabilité membranaire. Ces avantages nous permettent de gérer la congélation d'embryons à 4 température ambiante; méthodes de vitrification d'embryons d'autres nécessitent la remise à des températures plus fraîches et ne sont pas toujours applicables à certaines souches de souris dont BALB / c 6. Vitrification à base de glycol d'éthylène Le premier a été développé par Kasai et al. en 1990 5,7. Parce que la méthode originale a été optimisé pour les pailles en plastique comme les conteneurs, nous avons légèrement modifié le protocole pour cryotubes, qui sont plus facilement accessibles dans les laboratoires et les plus résistants aux dommages physiques. Par conséquent, la méthode de vitrification décrites ici peuvent être applicable à plusieurs laboratoires utilisant des souris comme modèles de recherche. La même méthode peut également être utilisé pour les embryons de souris à la morula et blastocyste étapes 8 et 9 embryons de rat. Toutefois, nous avons récemment constaté que la qualité des cryotubes peuvent affecter le taux de survie des embryons après congélation-décongélation. Ainsi, il est essentiel d'examiner la surface intérieure de la cryotubes pour sa finesse, avant vitrification des embryons (par exemple, voir au tableau des réactifs spécifiques et les équipements).

Méthodes de vitrification ont de nombreux avantages sur les méthodes classiques de congélation lente, mais ils ont intrinsèquement un désavantage par rapport à fin de transport. Comme embryons vitrifiés devrait être maintenu au-dessous de -120 ° C pour maintenir leur viabilité, les expéditeurs secs sont généralement utilisés pour leur transport sécuritaire. Expéditeurs à sec sont lourds et encombrants, et de leur voyage aller-retour coûte cher, surtout pour le transport international. Nous sommes maintenant en train de développer une nouvelle méthode de vitrification pardont les embryons vitrifiés peut être conservé à la température de la glace sèche (environ -80 ° C) pendant au moins 7 jours 10. Cette méthode devrait être la vitrification de la prochaine génération.

Disclosures

Nous n'avons rien à révéler.

Acknowledgements

Cette étude a été menée en collaboration avec le Projet national de bioressources, le Ministère de l'Education, Culture, Sports, Science et Technologie, Japon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin Merck & Co., Inc. 12657
Ethylene glycol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 058-00986
Ficoll 70 GE Healthcare 17-0310-10
Glucose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 041-00595
NaCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 191-01665
KCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 163-03545
KH2PO4 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 169-04245
Na2HPO4·12H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 500-04195
MgCl2 ·6H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 135-00165
CaCl2 ·2H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 031-00435
Penicillin G Sigma-Aldrich P-4687
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P-8574
Sucrose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 196-00015
M16 medium Sigma-Aldrich M7292
M2 medium Sigma-Aldrich M7167
Cryotube Sumitomo Bakelite Co., Ltd. MS-4501 “Cryogenic Vial”

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References

  1. Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
  2. Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
  3. Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
  4. Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
  5. Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
  6. Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
  7. Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
  8. Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
  9. Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
  10. Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).

Comments

14 Comments

  1. Please, one question about the medium EFS²0 and EFS40:
    Are they prepared simply using the proportions described in the table EG/FS 1:4 and EGFS ²:5 (table), or is it the another formula described in the text (EFS²0: ²0% (v/v) etthylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA. Thanks in advance .Cleide from Brazil.

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 17, 2012 - 2:23 PM
  2. Thank you for your interesting.
    The first, we prepare FS solution consist of 30% (w/v) Ficoll and 0.5 mol/L sucrose in PB1 with BSA. And mix with ethylene glycol 1:4 or ²:3 for preparation of EFS²0 and EFS40, respectively. Finally, EFS²0 consists with ²0% (v/v) ethylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA.
    Keiji from Japan

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 18, 2012 - 12:44 AM
  3. Thanks Keiji for your response.
    I have another question: what embryo culture medium did you use until cryopreservation?
    You have very good results.
    congratulations
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 18, 2012 - 3:28 PM
  4. I have always used CZB medium (Chatot CL, et al. 1989, J. Reprod. Fertil. 86:679-688) containing 5.6 mM glucose, 0.1 mg/ml PVA, and 3.0 mg/ml bovine serum albumin after IVF for around ²0 hrs and after cryopreservation until embryo transfer.
    The data in table 1 were obtained with CZB medium.
    I also recommend you to use KSOM medium instead of CZB medium.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 20, 2012 - 9:53 PM
  5. Ok Keiji.
    Thank you very much.
    best regards
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 21, 2012 - 9:56 AM
  6. Keiji,
    I'm very interested in your protocol. I've just a question about the preparation of the PB1 solution. Do you just dissolve all the components in the order of your list in 100mL distilled H²0 or do you readjust the pH?
    Thanks in advance.
    Maryline from Belgium

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 6, 2012 - 4:49 AM
  7. Thank you for your interesting.

    About PB1 preparation , you can also find the protocol in the book, "Manipulating the Mouse Embryo" as modified D-PBS.
    We can prepare this solution to dissolve all components in the order of our list.

    However, usually we prepare PBS (-) solution first, which consists of NaCl, KCl, Na²HPO4 and KH²PO4.
    Then, after preparation of x100 concentrated MgCl² and CaCl² solutions, respectively, each 0.1 ml solution are slowly added in 98 ml of PBS(-) solution with gently mixing.
    Because this PBS(+) solution can be stored in refrigerator for several months.
    Before using, we dissolve other reagents, glucose, Na pyruvate and penicillin G.
    This PB1 solution can be used for at least a few weeks by storing in refrigerator.
    In the other hand, we can buy the powder or tablet of PBS(-) from some companies.

    And we do not adjust the pH.

    I hope this coment will be a help for you.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    July 8, 2012 - 11:05 PM
  8. Thank you very much! Your coment is really helpful.
    Maryline

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 9, 2012 - 2:36 AM
  9. Hello,
    I wanted to try this method using 8-cell embryo. I noticed that the freezing media the PB1 is with BSA. How much BSA do you add?

    Thanks,
    Agnes
    Thanks,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2016 - 5:30 PM
  10. Thank you for your interesting.

    PB1 contains 3 mg/ml of BSA. Finally, vitrification solution (EFS40) contains 1.26 mg/ml of BSA.

    And this method is effective for the embryos at each stage from 1-cell to early blastocyst include 8-cell stage.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    April 6, 2016 - 8:30 PM
  11. Hello,
    I tried the procedure but I found out that it is very hard to see the embryos after transferring them in EFS20. They floated and changed shape. I lost half the number of the embryos that I collected. Is there any practical tip that you can tell me to avoid this problem?
    Also, could I harvest the embryos in M2 and freeze them using you freezing media?

    Thanks again.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2016 - 1:22 PM
  12. Thank you for your interesting.

    If you can release embryos with small volume of medium near the bottom of EFS20 solution, you can find all embryos in small area. And we also recommend that it becomes easy to discover embryos at the surface of EFS20 solution by control of the light with the adjustment lever.

    The developmental ability of embryos will decrease at outside of incubator. However, the embryos must be left outside of incubator more than 10 min., the medium contains HEPES (ex. M2, HEPES-KSOM) or PB1 solution should be used.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:13 AM
  13. Hi,

    I think there is a mistake in the step 1.2.1: Add the following chemicals to 14 ml of PB1 solution in a 50 ml tube.
    Shouldn't it be 20ml?

    Thanks,
    Tony

    Reply
    Posted by: Tony N.
    April 28, 2016 - 4:16 AM
  14. Hi, Tony

    You are right.
    Total volume will be 20 ml.
    The conical tube of 50 ml is useful for preparation of this solution.

    Thank you.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:20 AM

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