Kryokonservering av Mouse Embryos ved etylenglykol-Based forglassing

Biology
 

Summary

En etylenglykol-basert forglassing metode for mus embryo er beskrevet. Det er en fordel til andre metoder i sin enkelhet og lave embryonale toksisitet, og derfor kan grovt anvendelig til mange stammer av mus, inkludert innavlet og genmodifiserte mus.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mochida, K., Hasegawa, A., Taguma, K., Yoshiki, A., Ogura, A. Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification. J. Vis. Exp. (57), e3155, doi:10.3791/3155 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kryokonservering av mus embryo er et teknologisk grunnlag som støtter biomedisinske fag, fordi mange stammer av mus har blitt produsert av genetiske modifikasjoner og antallet er stadig økende år for år. Den tekniske utviklingen startet med langsom frysing metoder i 1970 1, deretter fulgt av forglassing metoder utviklet på slutten av 1980-tallet to. Vanligvis er den sistnevnte teknikken fordelaktige i sin hurtighet, enkelhet, og høy overlevelsesevne gjenvunnet embryoer. Men cryoprotectants inneholdt er svært giftig og kan påvirke etterfølgende embryo utvikling. Derfor ble teknikken ikke gjelder for visse stammer av mus, selv når løsningene er avkjølt til 4 ° C for å redusere den toksiske effekten under embryo håndtering. På Riken Bioresource Center, er mer enn 5000 mus stammer med ulike genetiske bakgrunn og fenotyper vedlikeholdt 3, og derfor har vi optimalisert en forglassing technique som kan vi cryopreserve embryo fra mange forskjellige stammer av mus, med fordelene av høy embryo overlevelse etter vitrifying og tining (eller liquefying, mer presist) ved omgivelsestemperatur fire.

Her presenterer vi en forglassing metode for mus embryo som har blitt brukt på senteret vårt. Den nedfrysing Løsningen inneholder etylenglykol istedenfor DMSO å minimere toksisiteten til foster 5. Den inneholder også Ficoll og sukrose for forebygging av devitrification og osmotisk regulering, henholdsvis. Befruktede egg kan håndteres ved romtemperatur og overført til flytende nitrogen innen 5 min. Fordi den opprinnelige metoden ble optimalisert for plast sugerør som beholdere, har vi litt modifisert protokollen for cryotubes, som er lettere tilgjengelig i laboratorier og mer motstandsdyktig mot fysiske skader. Vi har også beskrive prosedyren for tining vitrified embryo i detalj fordi det er en kritisk step for en effektiv utvinning av levende mus. Disse metoder ville være nyttig for forskere og teknikere som trenger bevaring av musen stammer for senere bruk i en sikker og kostnadseffektiv måte.

Protocol

Den generelle ordningen med forsøket er vist i fig. 1.

1. Reagens Forberedelse

  1. Gjør basen medium (her i kjent som PB1) i en 100 ml glassflaske i henhold til følgende diagram nedenfor:
    MW mM mg/100ml
    NaCl 58,4 136,98 800,0
    KCl 74,6 2,68 20,0
    KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0
    Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O 358,14 8,04 288,1
    2 MgCl, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0
    180,2 5,56 100,0
    Na pyruvat 110 0,33 3.6
    2 CaCl, 2H 2 O 147 0.9 13,2
    Penicillin G 6.0 (ca)
  2. Gjør Ficoll-sukrose (FS) løsning:
    1. Legg til følgende kjemikalier til 14 ml PB1 løsning i en 50 ml tube.
      Ficoll 70 6,0 g
      Sukrose 3,424 g
      BSA 42,0 mg
    2. Bland Ficoll 70 og sukrose i PB1 løsning og rist godt til det er helt oppløst.
    3. Etter å ha sjekket fullstendig oppløsning ovenfor, legger BSA på overflaten av løsningen og holde det på4oC til BSA er helt oppløst (> 4 timer eller over natten).
  3. Gjør likevekt løsningen (EFS20) og forglassing løsningen (EFS40) i en 50 ml tube:
    • EFS20: 20% (v / v) etylenglykol, 24% (w / v) Ficoll, og 0,4 mol / L sucrose i PB1 med BSA
    • EFS40: 40% (v / v) etylenglykol, 18% (w / v) Ficoll, og 0,3 mol / L * sucrose i PB1 med BSA
      * For embryo fra BALB / c eller ICR belastning, øke konsentrasjonen av sukrose til 0,9 mol / L sukrose fordi de er mer følsomme for cryodamage 6.
    EFS20 løsning EFS40 løsning
    Etylenglykol 1 ml 2 ml
    FS-løsning 4 ml 3 ml
  4. Steriliser løsningen ved filtrering ved hjelp av en 0,45 mikrometer filter. Lag alikvoter i 5 ml polystyren rør og oppbevar ved 4 ° C. De kan brukes i ca 6 måneder.
  5. Utarbeidelse av embryo tining løsning som inneholder 0,75 M sukrose (TS1)
    1. Løs opp 7,7 g sukrose i PB1 (utarbeidet i steg 1.1) og bringe det totale volumet til 30 ml. Bland ved å forsiktig risting før sukrose er helt oppløst.
    2. Legg til 90 mg av BSA på overflaten løsningen og la det stå til det er helt oppløst.
    3. Steriliser løsningen ved filtrering.
    4. Delmengde og oppbevar ved 4 ° C. De kan brukes i ca 1 måned.

    Merk: TS1 kan også være forberedt fra kommersielt tilgjengelige M2.
    1. Løs opp 7,7 g sukrose i M2 og bringe det totale volumet til 30 ml.
    2. Bland ved å forsiktig risting før sukrose er helt oppløst.
    3. Steriliser løsningen ved filtrering.
    4. Delmengde og butikken på 4oC. De kan brukes i ca 1 måned.
  6. TS2 (tining løsninginneholder 0,25 M sukrose):
    1. Fortynn 10 ml TS1 med 20 ml volum av PB1 eller M2, som passer.
    2. Delmengde og oppbevar ved 4 ° C. De kan brukes i ca 1 måned.

2. Forglassing av 2-cell Mouse Embryoer

  1. Forbered 2-cell mus embryoer ved naturlig parring eller konvensjonell in vitro fertilisering teknikker.
  2. Delmengde 50 mL EFS40 inn i en cryotube. Heretter utføre resten av forglassing prosedyren ved romtemperatur.
  3. Delmengde 50 mL av EFS20 på bunnen av en 35 mm eller 60 mm plast petriskål.
  4. Overfør opptil 30 embryoene EFS20 bruke et glass kapillær med bare det minimum av kultur medium. Start en tidtaker for 2 min.
    Merk: Legg embryo på bunnen av fallet. Dette gjør effektiv uttørking av embryo. Sjekk morfologi av embryoer ved en stereomikroskop. Dehydrerte embryo viser en krympet morfologi, som vist i fig. 2A.Hvis de ikke er dehydrert nok vente flere 1 eller 2 min.
  5. På ca 1,5 min, plukke opp embryoene fra EFS20 slippe med bare det minimum av løsningen. Overfør dem til EFS40 i cryotube forberedt i trinn 2.1. Merk: For best resultat, justere tidspunktet for å plukke opp embryo slik at alle fostre kan overføres til EFS40 rundt 2 min.
  6. Vent i 1 min.
  7. Sett cryotube direkte i flytende nitrogen (LN 2).

3. Tining Vitrified 2-cell Mouse Embryoer

  1. Før tining, forberede en tallerken med 10 mL dråper embryo kultur medium for gjenvunnet embryoer (se trinn 3.13). Dekk formen med olje og legg i en CO 2 inkubator før bruk. Merk: Selv om alle medier for rutinemessig fosteret kultur kan brukes i dette forsøket, anbefaler vi media med høyere osmolaritet som M16 medium.
  2. Varm TS1 til 37 ° C.
  3. Sett på en ansiktsmaske og cryogloves. Åpne LN 2 tank og hente en cryotube inneholder embryoer.
  4. Raskt åpne toppen av røret og kast LN 2. Vent i 30 sekunder for å hindre TS1 fryser på neste trinn.
  5. Bruk en 1000ul pipette til å legge 850 mL av TS1 (37 ° C) i røret og bland løsningen ved milde pipettings (om lag ti ganger på 25 sekunder) til løsningen er jevnt oppløst.
  6. Overfør hele volumet av røret til en plast 60 mm petriskål (eller en klokke glass) (Fig. 3A). Merk: Embryoer skal håndteres ved romtemperatur (22-25 ° C) før de er plassert i en CO 2 inkubator ved Step 3.14.
  7. Start en tidtaker for 3 min.
  8. På rundt 2 min i TS1, forsiktig riste fatet til medium med embryo er spredt over overflaten av parabolen (Fig. 3B). Merk: Dette vil hjelpe embryoene gå ned til bunnen, fordi de flyter nær overflaten da overført til TS1.
  9. Legg tre 50 mL dråper TS2 på the parabolen (Fig. 3C).
  10. Etter 3 min i TS1, sjekk morfologi av embryoer ved en stereomikroskop, de bør være litt krympet. Se morfologi av befruktede egg i tidligere (Fig. 2B) og senere (Fig. 2C) i TS1. Merk: Hvis embryoene er fortsatt hoven, holde dem i TS1 for mer 1-3 min.
  11. Plukk opp embryoer og overføre dem til den første dråpe TS2 (Fig. 3D). Start en tidtaker for 3 min
  12. Etter 3 min, overføre embryo til andre slippe og deretter til den tredje dråpe (fig. 3E).
  13. Overfør embryoene til kultur medium forberedt på Step 3.1. Embryoene er i form vist i fig. 2D.
  14. Sett fatet i en CO 2 inkubator. Om 10 min senere, overføre embryo til neste dråpe kultur medium for å vaske ut sukrose som har blitt overført fra TS2.
  15. Fortsett kultur i en CO2 inkubator frem embryo transfer.
    Merk: Overfør Embryos til oviduktene av mottakeren kvinner på dagen for tining. Long kultur in vitro kan redusere levedyktigheten til fostre i noen stammer av mus.

Fire. Representant Resultater:

In vitro - og in vivo-utvikling av embryo etter tining er presentert i tabell 1 og 2. Fordelene med denne protokollen er den høye overlevelsesevnen til foster etter tining og dens brede anvendelighet til forskjellige stammer av mus.

Strain Totalt antall rør Antall embryo vitrified Gjenvunnet (nr. (%)) Morfologisk normale (nr. (%)) Utvikling til blastocysts (nr. (%))
C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87)
BALB / CA 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84)
ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90)

Tabell 1. In vitro-utvikling av vitrified-tint embryo i vanlig mus stammer

Tilstand av embryo Antall mottaker kvinner Antall embryo overføres Implantasjon områder (nr. (%)) Live-avkom (nr. (%))
Fersk 12 180 141 (78.3) 110 (61.1)
Vitrified 16 242 202 (83.5) 125 (51.7)

Tabell 2. In vivo-utvikling av vitrified-tint embryo i C57BL/6J mus.

Figur 1
Figur 1. Den generelle ordningen av eksperimentet, inkludert likevekt, forglassing, og tining av embryoer.

Figur 2
Figur 2. Morfologi av embryoer på hvert trinn av tining.

Figur 3
Figur 3. Tining prosedyren av embryoer. Alle prosedyrer utføres ved romtemperatur. (A), tilsett 850 mL av TS1 (37 ° C) i en cryotube og overføre hele volumet av løsningen i cryotube på en plastisk form. På denne tiden, ser embryoene hovne som vist i fig. 2B. (B), Spredt løsningen over overflaten av parabolen ved milde risting. (C), Plasser tre 50 mL dråper TS2 på plast parabolen. (D), Transfer embryoene til den første dråpe TS2. Etter 3 min, embryoene ser shurunken som vist i fig. 2C. (E), Overfør dem serially til de resterende TS2 dråper og deretter til kultur medium.

Discussion

Siden den første rapporten om musen embryo forglassing av Rall og Fahy i 1985 2, har flere tekniske forbedringer er gjort for å øke overlevelsesevnen til foster etter tining. En av de mest vellykkede endringer ble oppnådd ved bruk av etylenglykol som cryoprotectant grunn av sin lave toksisitet og høy membran-permeabilitet. Slike fordeler gjør oss i stand til å håndtere frysing embryoer ved romtemperatur 4; andre forglassing metodene krever embryo overlate ved kjøligere temperaturer og er ikke alltid gjelder noen stammer av mus inkludert BALB / c 6. Den første etylenglykol-baserte forglassing ble utviklet av Kasai et al. i 1990 5,7. Fordi den opprinnelige metoden ble optimalisert for plast sugerør som beholdere, har vi litt modifisert protokollen for cryotubes, som er lettere tilgjengelig i laboratorier og mer motstandsdyktig mot fysiske skader. Derfor kan forglassing metoden beskrevet her være applicable til mange laboratorier bruker mus som forskning modeller. Den samme metoden kan også brukes for mus embryo ved morula og blastocyst stadier 8 og rotte embryoer 9. Vi har imidlertid nylig funnet ut at kvaliteten på cryotubes kan påvirke overlevelsen av befruktede egg etter frysing-tining. Derfor er det viktig å undersøke innsiden av cryotubes for sin glatthet før vitrifying embryoer (f.eks; se på Table av spesifikke reagenser og utstyr).

Forglassing metoder har mange fordeler fremfor konvensjonelle langsom frysing metoder, men de iboende har en ulempe i forhold til transport formål. Som vitrified embryo bør holdes på under -120 ° C for å opprettholde sin levedyktighet, er tørre skipere vanligvis brukt for deres sikker transport. Tørr skipere er tunge og klumpete, og deres rundtur er dyrt, spesielt for internasjonal transport. Vi er nå ferd med å utvikle en ny forglassing metode vedsom vitrified embryo kan lagres på tørris temperatur (ca -80 ° C) i minst 7 dager 10. Denne metoden bør være forglassing av neste generasjon.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgements

Denne studien ble gjennomført i samarbeid med National Bioresource Project, Kunnskapsdepartementet, Kultur, Sport, Science and Technology, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin Merck & Co., Inc. 12657
Ethylene glycol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 058-00986
Ficoll 70 GE Healthcare 17-0310-10
Glucose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 041-00595
NaCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 191-01665
KCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 163-03545
KH2PO4 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 169-04245
Na2HPO4·12H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 500-04195
MgCl2 ·6H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 135-00165
CaCl2 ·2H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 031-00435
Penicillin G Sigma-Aldrich P-4687
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P-8574
Sucrose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 196-00015
M16 medium Sigma-Aldrich M7292
M2 medium Sigma-Aldrich M7167
Cryotube Sumitomo Bakelite Co., Ltd. MS-4501 “Cryogenic Vial”

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
  2. Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
  3. Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
  4. Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
  5. Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
  6. Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
  7. Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
  8. Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
  9. Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
  10. Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).

Comments

14 Comments

  1. Please, one question about the medium EFS²0 and EFS40:
    Are they prepared simply using the proportions described in the table EG/FS 1:4 and EGFS ²:5 (table), or is it the another formula described in the text (EFS²0: ²0% (v/v) etthylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA. Thanks in advance .Cleide from Brazil.

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 17, 2012 - 2:23 PM
  2. Thank you for your interesting.
    The first, we prepare FS solution consist of 30% (w/v) Ficoll and 0.5 mol/L sucrose in PB1 with BSA. And mix with ethylene glycol 1:4 or ²:3 for preparation of EFS²0 and EFS40, respectively. Finally, EFS²0 consists with ²0% (v/v) ethylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA.
    Keiji from Japan

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 18, 2012 - 12:44 AM
  3. Thanks Keiji for your response.
    I have another question: what embryo culture medium did you use until cryopreservation?
    You have very good results.
    congratulations
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 18, 2012 - 3:28 PM
  4. I have always used CZB medium (Chatot CL, et al. 1989, J. Reprod. Fertil. 86:679-688) containing 5.6 mM glucose, 0.1 mg/ml PVA, and 3.0 mg/ml bovine serum albumin after IVF for around ²0 hrs and after cryopreservation until embryo transfer.
    The data in table 1 were obtained with CZB medium.
    I also recommend you to use KSOM medium instead of CZB medium.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 20, 2012 - 9:53 PM
  5. Ok Keiji.
    Thank you very much.
    best regards
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 21, 2012 - 9:56 AM
  6. Keiji,
    I'm very interested in your protocol. I've just a question about the preparation of the PB1 solution. Do you just dissolve all the components in the order of your list in 100mL distilled H²0 or do you readjust the pH?
    Thanks in advance.
    Maryline from Belgium

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 6, 2012 - 4:49 AM
  7. Thank you for your interesting.

    About PB1 preparation , you can also find the protocol in the book, "Manipulating the Mouse Embryo" as modified D-PBS.
    We can prepare this solution to dissolve all components in the order of our list.

    However, usually we prepare PBS (-) solution first, which consists of NaCl, KCl, Na²HPO4 and KH²PO4.
    Then, after preparation of x100 concentrated MgCl² and CaCl² solutions, respectively, each 0.1 ml solution are slowly added in 98 ml of PBS(-) solution with gently mixing.
    Because this PBS(+) solution can be stored in refrigerator for several months.
    Before using, we dissolve other reagents, glucose, Na pyruvate and penicillin G.
    This PB1 solution can be used for at least a few weeks by storing in refrigerator.
    In the other hand, we can buy the powder or tablet of PBS(-) from some companies.

    And we do not adjust the pH.

    I hope this coment will be a help for you.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    July 8, 2012 - 11:05 PM
  8. Thank you very much! Your coment is really helpful.
    Maryline

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 9, 2012 - 2:36 AM
  9. Hello,
    I wanted to try this method using 8-cell embryo. I noticed that the freezing media the PB1 is with BSA. How much BSA do you add?

    Thanks,
    Agnes
    Thanks,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2016 - 5:30 PM
  10. Thank you for your interesting.

    PB1 contains 3 mg/ml of BSA. Finally, vitrification solution (EFS40) contains 1.26 mg/ml of BSA.

    And this method is effective for the embryos at each stage from 1-cell to early blastocyst include 8-cell stage.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    April 6, 2016 - 8:30 PM
  11. Hello,
    I tried the procedure but I found out that it is very hard to see the embryos after transferring them in EFS20. They floated and changed shape. I lost half the number of the embryos that I collected. Is there any practical tip that you can tell me to avoid this problem?
    Also, could I harvest the embryos in M2 and freeze them using you freezing media?

    Thanks again.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2016 - 1:22 PM
  12. Thank you for your interesting.

    If you can release embryos with small volume of medium near the bottom of EFS20 solution, you can find all embryos in small area. And we also recommend that it becomes easy to discover embryos at the surface of EFS20 solution by control of the light with the adjustment lever.

    The developmental ability of embryos will decrease at outside of incubator. However, the embryos must be left outside of incubator more than 10 min., the medium contains HEPES (ex. M2, HEPES-KSOM) or PB1 solution should be used.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:13 AM
  13. Hi,

    I think there is a mistake in the step 1.2.1: Add the following chemicals to 14 ml of PB1 solution in a 50 ml tube.
    Shouldn't it be 20ml?

    Thanks,
    Tony

    Reply
    Posted by: Tony N.
    April 28, 2016 - 4:16 AM
  14. Hi, Tony

    You are right.
    Total volume will be 20 ml.
    The conical tube of 50 ml is useful for preparation of this solution.

    Thank you.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:20 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics