Kryopræservering af Mouse embryoner ethylenglycol-Based forglasning

Biology
 

Summary

En ethylen glycol-baserede forglasning metode til mus embryoner er beskrevet. Det er en fordel for andre metoder i sin enkelhed og lave embryonale toksicitet, og kan derfor være bredt anvendelige til mange stammer af mus, herunder indavlede og gen-modificerede mus.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mochida, K., Hasegawa, A., Taguma, K., Yoshiki, A., Ogura, A. Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification. J. Vis. Exp. (57), e3155, doi:10.3791/3155 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kryopræservering af mus embryoner er et teknologisk grundlag, der understøtter biomedicinske videnskaber, fordi mange stammer af mus er produceret af genetiske modifikationer og antallet er konstant stigende år for år. For den tekniske udvikling startede med langsom frysemetoders i 1970'erne 1, og derefter efterfulgt af forglasning metoder udviklet i slutningen af 1980'erne 2. Generelt er Sidstnævnte teknik er en fordel i sin hurtighed, enkelhed, og høj overlevelsesevne af nyttiggjort embryoner. Men den indeholdt cryoprotectants er meget giftige og kan påvirke den efterfølgende embryo udvikling. Derfor er teknikken ikke fandt anvendelse på visse stammer af mus, selv når løsninger er nedkølet til 4 ° C for at mindske den toksiske effekt i løbet af embryo håndtering. På Riken BioResource Center, er mere end 5000 mus stammer med forskellig genetisk baggrund og fænotyper vedligeholdt 3, og derfor har vi optimeret en forglasning technique som vi kan Cryopreservering embryoner fra mange forskellige stammer af mus, med fordelene ved høje embryo overlevelse efter vitrifying og optøning (eller flydende, mere præcist) ved den omgivende temperatur 4.

Her præsenterer vi et forglasning metode til mus embryoner, der har været anvendt med succes i vores center. Den kryopræservering opløsning indeholder ethylenglycol i stedet for DMSO at minimere toksicitet over for embryoner 5. Den indeholder også Ficoll og saccharose til forebyggelse af devitrification og osmotisk justering, hhv. Embryoner kan håndteres ved stuetemperatur og overføres til flydende nitrogen inden for 5 min. Fordi den oprindelige metode er blevet optimeret til plast sugerør som beholdere, har vi ændret lidt protokollen for cryotubes, som er mere let tilgængelige i laboratorier og mere modstandsdygtige over for fysiske skader. Vi har også beskrive proceduren efter optøning forglasset embryoner i detaljer, fordi det er en kritisk step for effektiv inddrivelse af levende mus. Disse metoder ville være en hjælp til forskere og teknikere, der har brug for bevarelse af musen stammer til senere brug på en sikker og omkostningseffektiv måde.

Protocol

Den samlede ordning af forsøget er vist i Fig. 1.

1. Klargøring af reagens

  1. Gør basen medium (her kaldet PB1) i en 100 ml glasflaske i henhold til følgende skema nedenfor:
    MW mM mg/100ml
    NaCl 58,4 136,98 800,0
    KCl 74,6 2,68 20,0
    KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0
    Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O 358,14 8,04 288,1
    MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0
    180,2 5,56 100,0
    Na pyruvat 110 0,33 3,6
    CaCl 2, 2H 2 O 147 0,9 13,2
    Penicillin G 6,0 (ca)
  2. Gør Ficoll-saccharose (FS) løsning:
    1. Tilføj følgende kemikalier til 14 ml PB1 opløsning i en 50 ml rør.
      Ficoll 70 6,0 g
      Saccharose 3,424 g
      BSA 42,0 mg
    2. Bland Ficoll 70 og saccharose i PB1 løsning, og ryst godt, indtil helt opløst.
    3. Efter at have kontrolleret fuldstændig opløsning ovenfor, tilføje BSA på overfladen af ​​løsningen og holde det på4oC indtil BSA er helt opløst (> 4 timer eller natten over).
  3. Gør ekvilibreringsopløsning (EFS20) og vitrifikation opløsning (EFS40) i et 50 ml rør:
    • EFS20: 20% (v / v) ethylenglycol, 24% (w / v) Ficoll, og 0,4 mol / L saccharose i PB1 med BSA
    • EFS40: 40% (v / v) ethylenglycol, 18% (w / v) Ficoll, og 0,3 mol / L * saccharoseindhold i PB1 med BSA
      * For embryoner fra BALB / c eller ICR stamme, øge koncentrationen af saccharose til 0,9 mol / L saccharose fordi de er mere følsomme over for cryodamage 6.
    EFS20 løsning EFS40 løsning
    Ethylenglycol 1 ml 2 ml
    FS-løsning 4 ml 3 ml
  4. Sterilisere løsning ved filtrering med et 0,45 μm filtreret vandr. Gør aliquoter i 5 ml polystyren rør og opbevares ved 4 ° C. De kan bruges i cirka 6 måneder.
  5. Tilberedning af embryo optøning opløsning, der indeholder 0,75 m saccharose (TS1)
    1. Opløs 7,7 g saccharose i PB1 (udarbejdet i trin 1,1) og bringer den samlede mængde på 30 ml. Bland ved forsigtig omrystning, indtil sakkarose er helt opløst.
    2. Tilsæt 90 mg BSA på overfladen løsningen og lad det stå indtil det er helt opløst.
    3. Sterilisere løsning ved filtrering.
    4. Alikvot og opbevares ved 4 ° C. De kan bruges i ca 1 måned.

    Bemærk: TS1 kan også være parat fra kommercielt tilgængelige M2.
    1. Opløs 7,7 g saccharose i M2 og bringe det samlede volumen til 30 ml.
    2. Bland ved forsigtig omrystning, indtil sakkarose er helt opløst.
    3. Sterilisere løsning ved filtrering.
    4. Alikvot og opbevares ved 4oC. De kan bruges i ca 1 måned.
  6. TS2 (optøning løsningmed 0,25 M saccharose):
    1. Fortynd 10 ml TS1 med 20 ml volumen PB1 eller M2, som er relevant.
    2. Alikvot og opbevares ved 4 ° C. De kan bruges i ca 1 måned.

2. Forglasning af 2-celle mus Embryoner

  1. Forbered 2-celle mus embryoner ved naturlig parring eller konventionelle in vitro-befrugtning teknikker.
  2. Alikvot 50 μl EFS40 i en cryotube. Herefter skal du udføre resten af ​​forglasning procedure ved stuetemperatur.
  3. Alikvot 50 μl af EFS20 på bunden af ​​en 35 mm eller 60 mm plastik petriskål.
  4. Overfør op til 30 embryoner til EFS20 med et glas kapillar med kun det minimum af dyrkningsmediet. Start en timer i 2 min.
    Bemærk: Placer embryoner på bunden af ​​dråben. Dette gør effektiv dehydrering af embryoner. Kontroller morfologi af embryoner ved et stereomikroskop. Tørrede embryoner viser en indskrumpet morfologi, som vist i Fig. 2A.Hvis de ikke er dehydreret nok vente mere 1 eller 2 min.
  5. På omkring 1,5 min, afhente embryoner fra EFS20 drop med kun den mindst mulige mængde af løsningen. Overføre dem til EFS40 i cryotube forberedt i trin 2.1. Bemærk: For de bedste resultater, timingen af ​​picking up embryoner, således at alle embryoner kan overføres til EFS40 på omkring 2 min justere.
  6. Vent i 1 min.
  7. Sæt cryotube direkte i flydende nitrogen (LN 2).

3. Optøning Forglasset 2-celle mus Embryoner

  1. Før optøning, forberede et fad med 10 μl dråber embryo dyrkningsmedium for nyttiggjort embryoner (se trin 3.13). Dæk fadet med olie og sted i en CO 2 inkubator indtil brug. Bemærk: Selv om alle medier for rutinemæssig embryo kultur kan bruges i dette eksperiment, anbefaler vi, medier med højere osmolaritet såsom M16 medium.
  2. Varm TS1 til 37 ° C.
  3. Tag en ansigtsmaske og cryogloves. Åbn LN 2 TANK og hente en cryotube indeholder embryoner.
  4. Hurtigt åbne den øverste del af røret og kasseres LN 2. Vent i 30 sekunder for at forhindre TS1 fra at fryse på det næste trin.
  5. Brug en 1000ul pipette for at tilføje 850 μl af TS1 (37 ° C) i glasset og bland den løsning ved forsigtig pipettings (omkring ti gange i 25 sekunder), indtil opløsningen jævnt er opløst.
  6. Overfør hele mængden af røret til en plastik 60 mm petriskål (eller et urglas) (Fig. 3A). Bemærk: Embryoner skal håndteres ved stuetemperatur (22-25 ° C), indtil de er placeret i et CO 2 inkubator ved Step 3.14.
  7. Start en timer i 3 min.
  8. På omkring 2 min i TS1, ryst forsigtigt fadet indtil det medium, der indeholder embryoner er spredt over overfladen af skålen (Fig. 3B). Bemærk: Dette vil hjælpe de befrugtede æg ned til bunden, fordi de er flydende nær overfladen, når den overføres til TS1.
  9. Sæt tre 50 μl dråber TS2 på the parabol (Fig. 3C).
  10. Efter 3 min i TS1, skal du kontrollere morfologien af ​​embryoner af et stereomikroskop, og de bør være lidt indskrumpet. Se morfologi af embryoner i tidligere (Fig. 2B) og senere (Fig. 2C) i TS1. Bemærk: Hvis embryonerne stadig er hævede, holde dem i TS1 for mere 1 til 3 min.
  11. Afhentning af embryoner og overføre dem til den første dråbe af TS2 (Fig. 3D). Start en timer i 3 min
  12. Efter 3 min, overførsel embryoner til anden drop og derefter til den tredje drop (Fig. 3E).
  13. Overfør embryoner til dyrkningsmediet udarbejdet på Trin 3.1. Embryonerne er i den form som vist i Fig. 2D.
  14. Placer fadet i en CO 2 inkubator. Omkring 10 minutter senere, overførsel embryoner til næste dråbe af kultur medium til at vaske ud af saccharose, der er blevet overført fra TS2.
  15. Fortsæt kultur i en CO2 inkubator, indtil ægoplægningen.
    Bemærk: Overførsel Embryos til Æggelederne af modtageren hunner på dagen efter optøning. Lang kultur in vitro kan nedsætte levedygtigheden af embryoner i nogle stammer af mus.

4. Repræsentative resultater:

In vitro - og in vivo-udvikling af embryoner efter optøning er præsenteret i tabel 1 og 2. Fordelene ved denne protokol, er de høje overlevelsesevne embryoner efter optøning og dens brede anvendelighed til forskellige stammer af mus.

Strain Samlet Antal rør Antal forglasset embryoner Gendannede (nr. (%)) Morfologisk normale (nr. (%)) Udvikling til blastocyster (nr. (%))
C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87)
BALB / CA 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84)
ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90)

Tabel 1. In vitro-udvikling af forglasset-optøede æg til fælles mus stammer

Betingelse af embryoner Antal modtager kvinder Antal embryoner overføres Implantationssteder (nr. (%)) Levende afkom (nr. (%))
Frisk 12 180 141 (78.3) 110 (61.1)
Forglasset 16 242 202 (83.5) 125 (51.7)

Tabel 2. In vivo-udvikling af forglasset-optøede æg i C57BL/6J mus.

Figur 1
Figur 1. Den samlede ordning for forsøget, herunder ligevægt, forglasning, og optøning af embryoner.

Figur 2
Figur 2. Morfologi embryoner på hvert trin efter optøning.

Figur 3
Figur 3. Optøning procedure af embryoner. Alle procedurer udføres ved stuetemperatur. (A), Tilsæt 850 μl af TS1 (37 ° C) i en cryotube og overføre hele mængden af ​​løsningen i cryotube på en plastik skål. På dette tidspunkt ser embryoner hævede som vist i Fig. 2B. (B), Spred løsning hen over overfladen af ​​skålen ved forsigtig rystning. (C), Place tre 50 μl dråber TS2 på plastik fad. (D), Overfør embryoner til den første dråbe af TS2. Efter 3 min, ser embryoner shurunken som vist i Fig. 2C. (E), Overfør dem serielly til de resterende TS2 dråber og derefter til dyrkningsmediet.

Discussion

Siden den første rapport af mus embryo forglasning ved Rall og Fahy i 1985 2, har flere tekniske forbedringer er foretaget for at øge overlevelsesevne embryoner efter optøning. En af de mest succesfulde ændringer blev opnået ved brug af ethylenglycol som en kryoprotektant på grund af dets lave toksicitet og høj membran-permeabilitet. Sådanne fordele kunne håndtere nedfrysning embryoner ved stuetemperatur 4; andre forglasning metoder kræver embryo aflevering ved køligere temperaturer og er ikke altid gælder for nogle stammer af mus herunder BALB / C 6. Den første ethylen glycol-baserede forglasning blev udviklet af Kasai et al. i 1990 5,7. Fordi den oprindelige metode er blevet optimeret til plast sugerør som beholdere, har vi ændret lidt protokollen for cryotubes, som er mere let tilgængelige i laboratorier og mere modstandsdygtige over for fysiske skader. Derfor kan forglasning metoden beskrevet her være calicable at mange laboratorier med mus som forskning modeller. Samme metode kan også bruges til mus embryoner på morula og blastocyst stadier 8 og rotte embryoner 9. Men vi har for nylig fundet, at kvaliteten af ​​cryotubes kan påvirke overlevelse af fostre efter frysning-optøning. Derfor er det vigtigt at undersøge indersiden af ​​cryotubes for sin glathed før vitrifying embryoner (f.eks, se på Tabel over specifikke reagenser og udstyr).

Forglasning metoder har mange fordele frem for traditionelle langsomme frysemetoders, men de i sagens natur har en ulempe i forhold til transport formål. Som forglasset embryoner skal opbevares ved under -120 ° C for at bevare deres levedygtighed, er tørre afskibere generelt bruges til deres sikker transport. Tør afskibere er tunge og pladskrævende, og deres tur er dyrt, især for international transport. Vi er nu ved at udvikle en ny forglasning metodesom forglasset embryoner kan opbevares ved tør-is temperatur (ca. -80 ° C) i mindst 7 dage 10. Denne metode bør være forglasning af den næste generation.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev gennemført i samarbejde med National BioResource Project, Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin Merck & Co., Inc. 12657
Ethylene glycol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 058-00986
Ficoll 70 GE Healthcare 17-0310-10
Glucose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 041-00595
NaCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 191-01665
KCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 163-03545
KH2PO4 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 169-04245
Na2HPO4·12H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 500-04195
MgCl2 ·6H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 135-00165
CaCl2 ·2H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 031-00435
Penicillin G Sigma-Aldrich P-4687
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P-8574
Sucrose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 196-00015
M16 medium Sigma-Aldrich M7292
M2 medium Sigma-Aldrich M7167
Cryotube Sumitomo Bakelite Co., Ltd. MS-4501 “Cryogenic Vial”

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
  2. Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
  3. Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
  4. Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
  5. Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
  6. Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
  7. Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
  8. Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
  9. Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
  10. Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).

Comments

14 Comments

  1. Please, one question about the medium EFS²0 and EFS40:
    Are they prepared simply using the proportions described in the table EG/FS 1:4 and EGFS ²:5 (table), or is it the another formula described in the text (EFS²0: ²0% (v/v) etthylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA. Thanks in advance .Cleide from Brazil.

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 17, 2012 - 2:23 PM
  2. Thank you for your interesting.
    The first, we prepare FS solution consist of 30% (w/v) Ficoll and 0.5 mol/L sucrose in PB1 with BSA. And mix with ethylene glycol 1:4 or ²:3 for preparation of EFS²0 and EFS40, respectively. Finally, EFS²0 consists with ²0% (v/v) ethylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA.
    Keiji from Japan

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 18, 2012 - 12:44 AM
  3. Thanks Keiji for your response.
    I have another question: what embryo culture medium did you use until cryopreservation?
    You have very good results.
    congratulations
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 18, 2012 - 3:28 PM
  4. I have always used CZB medium (Chatot CL, et al. 1989, J. Reprod. Fertil. 86:679-688) containing 5.6 mM glucose, 0.1 mg/ml PVA, and 3.0 mg/ml bovine serum albumin after IVF for around ²0 hrs and after cryopreservation until embryo transfer.
    The data in table 1 were obtained with CZB medium.
    I also recommend you to use KSOM medium instead of CZB medium.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 20, 2012 - 9:53 PM
  5. Ok Keiji.
    Thank you very much.
    best regards
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 21, 2012 - 9:56 AM
  6. Keiji,
    I'm very interested in your protocol. I've just a question about the preparation of the PB1 solution. Do you just dissolve all the components in the order of your list in 100mL distilled H²0 or do you readjust the pH?
    Thanks in advance.
    Maryline from Belgium

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 6, 2012 - 4:49 AM
  7. Thank you for your interesting.

    About PB1 preparation , you can also find the protocol in the book, "Manipulating the Mouse Embryo" as modified D-PBS.
    We can prepare this solution to dissolve all components in the order of our list.

    However, usually we prepare PBS (-) solution first, which consists of NaCl, KCl, Na²HPO4 and KH²PO4.
    Then, after preparation of x100 concentrated MgCl² and CaCl² solutions, respectively, each 0.1 ml solution are slowly added in 98 ml of PBS(-) solution with gently mixing.
    Because this PBS(+) solution can be stored in refrigerator for several months.
    Before using, we dissolve other reagents, glucose, Na pyruvate and penicillin G.
    This PB1 solution can be used for at least a few weeks by storing in refrigerator.
    In the other hand, we can buy the powder or tablet of PBS(-) from some companies.

    And we do not adjust the pH.

    I hope this coment will be a help for you.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    July 8, 2012 - 11:05 PM
  8. Thank you very much! Your coment is really helpful.
    Maryline

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 9, 2012 - 2:36 AM
  9. Hello,
    I wanted to try this method using 8-cell embryo. I noticed that the freezing media the PB1 is with BSA. How much BSA do you add?

    Thanks,
    Agnes
    Thanks,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2016 - 5:30 PM
  10. Thank you for your interesting.

    PB1 contains 3 mg/ml of BSA. Finally, vitrification solution (EFS40) contains 1.26 mg/ml of BSA.

    And this method is effective for the embryos at each stage from 1-cell to early blastocyst include 8-cell stage.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    April 6, 2016 - 8:30 PM
  11. Hello,
    I tried the procedure but I found out that it is very hard to see the embryos after transferring them in EFS20. They floated and changed shape. I lost half the number of the embryos that I collected. Is there any practical tip that you can tell me to avoid this problem?
    Also, could I harvest the embryos in M2 and freeze them using you freezing media?

    Thanks again.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2016 - 1:22 PM
  12. Thank you for your interesting.

    If you can release embryos with small volume of medium near the bottom of EFS20 solution, you can find all embryos in small area. And we also recommend that it becomes easy to discover embryos at the surface of EFS20 solution by control of the light with the adjustment lever.

    The developmental ability of embryos will decrease at outside of incubator. However, the embryos must be left outside of incubator more than 10 min., the medium contains HEPES (ex. M2, HEPES-KSOM) or PB1 solution should be used.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:13 AM
  13. Hi,

    I think there is a mistake in the step 1.2.1: Add the following chemicals to 14 ml of PB1 solution in a 50 ml tube.
    Shouldn't it be 20ml?

    Thanks,
    Tony

    Reply
    Posted by: Tony N.
    April 28, 2016 - 4:16 AM
  14. Hi, Tony

    You are right.
    Total volume will be 20 ml.
    The conical tube of 50 ml is useful for preparation of this solution.

    Thank you.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:20 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics