Multiparametric खरगोश Langendorff perfused हार्ट के ऑप्टिकल मानचित्रण

Bioengineering
 

Summary

यह आलेख Langendorff - perfused खरगोश नयनाभिराम इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर दिल में ऑप्टिकल मानचित्रण प्रयोगों का आयोजन करने के लिए बुनियादी प्रक्रियाओं, और दोहरी वोल्टेज (और कैल्शियम) इमेजिंग साधन का वर्णन करता है.

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Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart. J. Vis. Exp. (55), e3160, doi:10.3791/3160 (2011).

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Abstract

Protocol

1. तैयारी

  1. हौसले से बनाया Tyrodes समाधान (मिमी, NaCl 128.2, 1.3 CaCl दो, 4.7 KCl, 1.19 नाह 2 पीओ 4, 1.05 2 MgCl, 20.0 NaHCO 3, और 11.1 ग्लूकोज में) तैयार है. समाधान के दैनिक तैयारी में तेजी लाने के लिए, अग्रिम में दो स्टॉक समाधान तैयार करने और उन्हें चार पर दुकान डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर: (1) स्टॉक मैं (g/2L में, 374.6 NaCl, 9.56 2 CaCl, 17.52 KCl, 8.21 2 नाह पीओ 4 10.67 MgCl 2) और (2) स्टॉक II (g/2L में, 84.01 NaHCO 3). Tyrodes एक प्रयोग लेने के लिए पर्याप्त समाधान के 2L बनाने विआयनीकृत जल और यह स्टॉक मैं, 80ml के स्टॉक द्वितीय, और ग्लूकोज के 4g के 80ml मिश्रण के 1840mL.
  2. रंजक और uncouplers के शेयर समाधान तैयार: (1) uncoupler उत्तेजना - संकुचन blebbistatin शेयर समाधान (Tocris बायोसाइंस, DMSO में 2mg/mL समाधान), (2) वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई शेयर di-4-ANEPPS समाधान (Invitrogen, 1mg/mL DMSO समाधान में), (3) वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई आरएच 237 शेयर समाधान (Invitrogen, DMSO में 1.25mg/ml समाधान), (4) कैल्शियम सूचक Rhod 02:00 स्टॉक समाधान (Invitrogen, DMSO में 1mg/ml समाधान). एक एकल खरगोश प्रयोग di-4-ANEPPS शेयर समाधान RH237 शेयर समाधान के 30 μL और Rhod - 02:00 स्टॉक समाधान की 200 μL के लगभग 30 μL की आवश्यकता है. दोहराया ठंड और विगलन से बचने के लिए, हम -20 डिग्री सेल्सियस पर di-4-ANEPPS 100 μL aliquots की दुकान अन्य रंजक भी -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किए जाते हैं 4 ° सी रेफ्रिजरेटर में भंग blebbistatin स्टोर.
  3. पहले 2L बोतल में दिल, स्थानांतरण 'Tyrodes समाधान कटाई करने के लिए और एक पानी स्नान (फिशर साइंटिफिक) ° जो 37 पर समाधान तापमान बनाए रखता है सी. में जगह 5% सीओ 2 - 95% 2 हे समाधान के साथ oxygenated है. पीएच 7.35 पर बनाए रखा है ± oxygenation स्तर का समायोजन करके 0.05. समाधान Langendorff छिड़काव प्रणाली में वितरित किया जाता है और एक नायलॉन शुद्ध (ताकना आकार: 11μm, Millipore) फिल्टर द्वारा छनित प्रवेशनी पहले छिड़काव लाइन में रखा.
  4. निगरानी उपकरणों से पहले तैयार करने के लिए दिल कटाई. एक दबाव transducer (डब्ल्यूपीआई) के प्रयोग के दौरान महाधमनी दबाव की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है. दबाव transducer के आधारभूत mmHg शून्य जब दिल छिड़काव प्रणाली से जुड़ा नहीं है निकाला जाता है. छद्म - ईसीजी इलेक्ट्रोड अनुमानित लीड मैं, द्वितीय, और Einthoven त्रिकोण ईसीजी के III के चैम्बर में रखा जाता है.

2. फसल काटने वाले और खरगोश दिल के छिड़काव

  1. खरगोश restrainer में खरगोश को ठीक करें. सोडियम pentobarbital 2000 (50 मिग्रा / किग्रा) के साथ यू हेपरिन की एक अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा खरगोश euthanize. जब खरगोश पूरी तरह euthanized, जो दर्द प्रतिवर्त की कमी के द्वारा निर्धारित किया जाता है, वक्ष गुहा जल्दी और खोला है दिल और फेफड़े excised हैं.
  2. महाधमनी चाप की सभी शाखाओं से पहले आरोही महाधमनी के ऊपरी अंत में कटौती करें. आरोही महाधमनी से हवा बाहर फ्लश और फिर जल्दी से एक 16 गेज प्रवेशनी, जो पहले किया गया है कि coronaries के बाहर हवा रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है एक बुलबुला trapper जुड़ी दिल cannulate. एक बार दिल प्रतिगमनपूर्वक से एक गैर - recirculating Langendorff छिड़काव प्रणाली में perfused है, एक कट pericardium खोलने के लिए जल्दी कर.
  3. फेफड़े, ट्रेकिआ, वसा, और संयोजी ऊतक निकालें, जबकि रक्त छिड़काव द्वारा बाहर प्लावित है.
  4. बहुत महत्वपूर्ण है! एक सिलिकॉन टयूबिंग (~ 3cm लंबे, और 2mm व्यास में) एक फुफ्फुसीय शिरा और बाएं वेंट्रिकल (LV) में mitral वाल्व के माध्यम से डाला जाता है और प्रयोग भर वहाँ रखा. इस ट्यूब समाधान है कि एल.वी. में फंस गया है विज्ञप्ति. एक यंत्रवत् स्थिर दिल में प्रयोग Langedorff छिड़काव के दौरान घंटे के लिए संचलन के बिना, यह एल.वी. गुहा में गंभीर ischemia के कारण और अतालता उत्पादन की संभावना है.
  5. ऑप्टिकल मानचित्रण तंत्र के साथ Langendorff - छिड़काव recirculating प्रणाली प्रवेशनी के साथ दिल ले जाएँ.

3. Panoramic ऑप्टिकल मानचित्रण प्रणाली का उपयोग प्रयोगों का आयोजन

  1. कस्टम बनाया षट्भुज कक्ष में दिल प्लेस और छिड़काव प्रणाली को प्रवेशनी कनेक्ट. छिड़काव पंप के प्रवाह की दर के समायोजन से 60 पर महाधमनी दबाव ± 5 mmHg बनाए रखें. मैं छद्म ईसीजी सीसा मॉनिटर. 7.35 के आसपास पीएच ± 0.05 रखें.
  2. बंद कमरे की बत्ती बंद, क्योंकि blebbistatin यूवी और कम (450-490 एनएम) स्पेक्ट्रम के दृश्य भाग के अंत में 17 के द्वारा photoinactivated है . धीरे धीरे हवा बुलबुला प्रवेशनी ऊपर स्थित trapper में इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से blebbistatin शेयर समाधान इंजेक्षन. धीरे धीरे हर सांस में इंजेक्शन के लिए 0.1ml blebbistatin इंजेक्षन. अगले इंजेक्शन से पहले स्थिर दबाव के लिए रुको.
  3. धीरे अपने प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए विशिष्ट स्थान पर पेसिंग इलेक्ट्रोड जगह है.
  4. तीन से प्रत्येक फोटो डायोड सरणी की छवि विमान (पीडीए) में स्थित पाले सेओढ़ लिया गिलास में दिल की छवि का फोकससमान रूप से दिल के आसपास के कोण दूरी पर है. प्रवेशनी और प्रत्येक पीडीए और दिल के बीच दूरी की स्थिति को समायोजित करने में सभी तीन पीडीए के क्षेत्र के दृश्य में दिल फिट. पाले सेओढ़ लिया गिलास में प्रत्येक केंद्रित छवि की एक तस्वीर ले लो.
  5. धीरे - धीरे 10 इंजेक्षन ~~ 20μL di चार - ANEPPS छिड़काव समाधान में हवा बुलबुला जाल में इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से शेयर समाधान. ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग लेने से पहले 1 ~ 3 मिनट रुको.
  6. पहली रिकॉर्डिंग के लिए, हरी एलईडी प्रकाश (कोई उत्तेजना फिल्टर, एलईडी बाढ़, Lumileds) पर बारी, ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग तीन कस्टम डाटा अधिग्रहण प्रणाली के साथ जुड़े पीडीए, 5 से एक साथ ले और एलईडी प्रकाश बंद . सभी तीन पीडीए के विभिन्न पिक्सल से संकेतों की गुणवत्ता की जाँच करें. अगर ऑप्टिकल संभावित कार्रवाई में गति कलाकृतियों गौर कर रहे हैं 0.1 ~ 0.2mL blebbistatin शेयर समाधान जोड़ें. एक और 5 μL शेयर di 4 ANEPPS समाधान जोड़ें यदि संकेत से शोर अनुपात कम है.
  7. समाप्त डिजाइन कार्यात्मक अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल. अतिरिक्त 5μL शेयर di-4-ANEPPS समाधान के साथ दिल पुनः दाग अगर संकेत photobleaching या वार्शआउट कारण प्रयोगों के दौरान कमजोर होती जाती है.
  8. कार्यात्मक अध्ययन के पूरा होने के बाद कमरे की बत्ती पर मुड़ें. 36 कोण समान रूप से स्थान से दिल की तस्वीरें ले लो. यह 10 डिग्री के एक कदम पर एक डिजिटल कैमरा के साथ एक पीडीए के स्थान पर तय दिल rotating द्वारा हासिल की है.
  9. चैम्बर के बाहर दिल ले लो. सभी समाधान नाली. डि पानी, 70% अभिकर्मक शराब, और फिर से डि पानी के अनुक्रम में छिड़काव प्रणाली धो लें.
  10. डेटा विश्लेषण 36 डिजिटल तस्वीरें, खंगाला ज्यामिति की सतह पर ऑप्टिकल संकेत के पंजीकरण, और कार्रवाई संभावित अवधि (APD) की मात्रा का ठहराव, प्रवाहकत्त्व वेग (CV), चरण 6, आदि से दिल की ज्यामिति के पुनर्निर्माण शामिल

4. दोहरी मानचित्रण प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रयोगों का आयोजन

  1. (भाग 2 के बाद जारी रखें) एक गिलास कक्ष (Radnoti) में cannulated दिल प्लेस और छिड़काव प्रणाली को प्रवेशनी कनेक्ट. नीचे निलय सुप्रीम और atria में चैम्बर के सिलिकॉन नीचे दिल पिन.
  2. कमरे की बत्ती बंद है. धीरे धीरे blebbistatin शेयर समाधान इंजेक्षन (15 ~ 20 मिनट 10μM तक पहुँचने) इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से पहले छिड़काव प्रवेशनी के लिए दिल स्थिर.
  3. समाधान सतह की गति को कम करने के लिए एक प्लास्टिक पेट्री डिश, या epicardial सतह से ऊपर अन्य कांच की खिड़की को कवर, रखो.
  4. देखने का एक ही क्षेत्र में दोहरी मानचित्रण प्रणाली (चरम - एल, SciMedia) में दो CMOS कैमरों ध्यान दें. उत्सर्जित प्रतिदीप्ति एक dichroic दर्पण (635nm cutoff, ओमेगा ऑप्टिकल) के द्वारा अलग है, और वोल्टेज संकेतों के लिए एक 700nm longpass फ़िल्टर (Thorlabs) और एक कैल्शियम संकेतों के लिए 590/30 एनएम bandpass फिल्टर (ओमेगा ऑप्टिकल) द्वारा फ़िल्टर.
  5. दो हलोजन लैंप (न्यूपोर्ट गढ़ा उपकरण, स्ट्रैटफ़ोर्ड, सीटी, SciMedia, कोस्टा Mesa, CA के) के प्रकाश गाइड उद्देश्य देखने के मानचित्रण के क्षेत्र की ओर भी रोशनी को प्राप्त करने. उत्तेजना फिल्टर (531 / 40 एनएम, SemRock) का इस्तेमाल कर रहे हैं.
  6. वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई आरएच 237 इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से शेयर समाधान (10 ~ 30 μL) के साथ दिल का दाग.
  7. (0.2mL) शेयर समाधान Rhod 02:00 Pluronic एफ 127 के साथ मिक्स (Invitrogen, 01:01 मिश्रण). एक पानी स्नान sonicator में 1min के लिए Sonicate. बुलबुला है trapper बंदरगाह के माध्यम से मिश्रण इंजेक्षन. लगभग 20 मिनट के लिए रुको करने की अनुमति Rhod 2 डी - esterification मानचित्रण शुरू होने से पहले AM के लिए.
  8. एक रिकॉर्डिंग के लिए, बंद superfusion पंप बारी करने के लिए समाधान की सतह पर गति से बचने, उत्तेजना प्रकाश स्रोत (हलोजन लैंप) पर बारी, दोनों कैमरों के डाटा अधिग्रहण प्रणाली (चरम - एल, SciMedia) से जुड़े का उपयोग ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग ले , उत्तेजना प्रकाश बारी, और superfusion पंप पर बारी. ऑप्टिकल संकेतों की गुणवत्ता की जाँच करें. यदि आवश्यक ऊतक पुनः दाग.
  9. डिजाइन एक अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के बाकी खत्म करो.
  10. कमरे की बत्ती पर मुड़ें और देखने के क्षेत्र युक्त दिल की एक तस्वीर ले. चैम्बर के बाहर दिल ले लो. सभी समाधान नाली. डि पानी, 70% अभिकर्मक शराब (फिशर साइंटिफिक), और डि पानी के अनुक्रम में छिड़काव प्रणाली धो लें.
  11. डेटा विश्लेषण APD, CV, कैल्शियम क्षणिक अवधि (CaTD) एपी शिरोरेखा और कैट वृद्धि, क्षणिक कैल्शियम की वृद्धि समय, और बिल्ली क्षय का एक monoexponential फिट के निरंतर समय के बीच में देरी की माप शामिल हैं.

प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1
चित्रा 1 प्रतिनिधि एक खरगोश Langendorff perfused नयनाभिराम ऑप्टिकल मानचित्रण प्रणाली का उपयोग करके प्रयोग के परिणाम है. (ए) खरगोश और एक तीन आयामी सतह मेष ग्रिड के रूप में खंगाला खरगोश दिल ज्यामिति दिल की पूर्वकाल दृश्य. (बी) टीवह epicardial सतह unwrapped रंग कोडित. चरण (चरण विमान 18 विश्लेषण से प्राप्त) tachyarrhythmia के एक प्रकरण के दौरान लाल रंग में दिखाया wavefront का संकेत द्वारा (सी) ऑप्टिकल चरण पैनल बी (डी) सक्रियण (लाल रंग) wavefront प्रचार के आठ फोटो में 1-5 की एक स्थिर रैत्रांत अतालता के एक चक्र के दौरान चिह्नित अपूर्वता के आसपास पांच स्थानों से कार्रवाई संभावित रिकॉर्डिंग. wavefront हलकों, जो दिल की पूर्वकाल सतह पर दिखाई देता है एक चरण अपूर्वता के चारों ओर दक्षिणावर्त हैं. repolarization (नीला) के लिए रंग के लिए आंशिक रूप से पारदर्शी है ताकि पीछे wavefront दिखाई देता है (उदाहरण के लिए, 80ms, 100ms, और 120ms पर) होना तय है. इस रैत्रांत अतालता की एक फिल्म पूरक एक वीडियो में प्रदान की जाती है. ज्यामिति पुनर्निर्माण, संकेत पंजीकरण, चरण नक्शे की गणना, और सतह unwrapping के लिए तरीके कहीं 6 विवरण में वर्णित हैं .

चित्रा 2
चित्रा 2 एक खरगोश Langendorff - perfused दिल दोहरी मानचित्रण प्रणाली (संभावित कार्रवाई और क्षणिक कैल्शियम के साथ - साथ मानचित्रण) का उपयोग करके प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम है. (ए) काले डॉट्स द्वारा कवर देखने के मानचित्रण के क्षेत्र के साथ दिल के पूर्वकाल सतह. (बी) एक साइट से रिकॉर्डिंग का एक क्लोज़ - अप दृश्य. (सी) संभावित कार्रवाई का नमूना निशान (नीला) और समान रूप से स्थान पैनल ए नोट में काले डॉट्स कि पिक्सेल नहीं सभी रिकॉर्डिंग से पता चला रहे हैं और स्थानिक संकल्प 200μm है द्वारा चिह्नित स्थानों की एक सरणी से क्षणिक (लाल) कैल्शियम.

Discussion

हमारे अनुभव के आधार पर, एक सफल खरगोश Langendorff perfused दिल प्रयोग के लिए कुंजी समाधान अच्छी तरह से तैयार 'Tyrodes, दिल की जल्दी फसल अच्छी तरह से बनाए रखा छिड़काव दबाव, और छिड़काव प्रणाली में oxygenated समाधान के उचित पीएच शामिल हैं. आदेश में उच्चतम संभव संकेत से शोर अनुपात के साथ संकेत रिकॉर्ड करने के लिए, हम प्रकाश स्रोत, ऑप्टिकल फिल्टर, प्रकाशिकी ध्यान केंद्रित, photodetectors, 19 आदि सहित कारकों पर विचार करने की जरूरत है. इन पहलुओं का विवरण कहीं 19 से चर्चा कर रहे हैं . युवा खरगोश (उम्र: 4-5 महीने, वजन: 7-9 पाउंड) epicardial वसा, जो ऑप्टिकल संकेतों के शोर अनुपात करने के लिए संकेत कम हो जाती है से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

प्रत्येक पिक्सेल द्वारा दर्ज संकेत के ऊतक के एक मात्रा से उत्सर्जित प्रकाश की एक भारित एकीकरण है. इस ऊतक की मात्रा के गहराई इस्तेमाल डाई की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्य पर निर्भर करता है. Di चार - ANEPPS के लिए, एक उदाहरण के रूप में अनुमानित प्रवेश गहराई खरगोश 20 दिल में 300μm है. इस प्रकार, ऑप्टिकल संकेत की व्याख्या सावधानी के साथ किया जाना चाहिए जब बिजली समारोह के स्थानीय विविधता sinoatrial नोड, अलिंदनिलय संबंधी नोड में मौजूद हैं, और वेंट्रिकुलर अतालता 1,21,22 के दौरान .

इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के साथ तुलना में ऑप्टिकल मानचित्रण तकनीक की एक सीमा है कि ऑप्टिकल संभावित कार्रवाई के repolarization चरण अक्सर हृदय संकुचन के कारण गति artifact के द्वारा distored है. यांत्रिक बाधा artifact के कम इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह खत्म नहीं कर सकते हैं पूरी तरह. इसकी तुलना में, औषधीय उत्तेजना - संकुचन uncouplers गति artifact के हटाने में प्रभावी रहे हैं. हालांकि, इन uncouplers (जैसे Monoxime 2,3 Butanedione -) महत्वपूर्ण electrophysiological साइड इफेक्ट हो सकता है. Blebbistatin सामान्य 23 दिल में हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर कोई प्रतिकूल दुष्प्रभाव प्रदर्शन किया गया था, और इस प्रकार ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए एक आशाजनक uncoupler है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संकुचन के समाप्त करने के लिए कारण edema के त्वरण भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को प्रभावित कर सकता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

एनआईएच HL085369 R01 अनुदान, HL067322, HL082729, EB008999

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-1
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500
KCl Fisher Scientific S217-500
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3
D-Glucose Fisher Scientific D16-1
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760
Di-4-ANEPPS Invitrogen D1199
RH237 Invitrogen S1109
Rhod-2AM Invitrogen R1244
Pluronic F127 Invitrogen P3000MP
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650

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References

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