Author Produced

Флэш Фотолиз клетке соединений в ресничек Обонятельные сенсорные нейроны

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Фотолиз клетке соединений позволяет получать быстрое и локализованные увеличение концентрации различных физиологически активных соединений. Здесь мы покажем, как получить патч-зажим записи в сочетании с фотолиза клетках или в клетках цАМФ Ca для изучения обонятельной трансдукции в диссоциированных мыши обонятельной сенсорных нейронов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Фотолиз клетке соединений позволяет получать быстрое и локализованные увеличение концентрации различных физиологически активных соединений 1. Клетке соединений молекулы, физиологически неактивных по химической клетки, которые могут быть нарушены вспышки ультрафиолетового света. Здесь мы покажем, как получить патч-зажим записи в сочетании с фотолиза клетке соединений для изучения обонятельной трансдукции в диссоциированных мыши обонятельной сенсорных нейронов. Процесс обонятельной трансдукции (рис. 1) имеет место в ресничками обонятельных сенсорных нейронов, где одоранта связывания с рецепторами приводит к повышению цАМФ, который открывает циклических нуклеотидов закрытого (СПГ) каналы 2. Са запись с помощью СПГ каналов активирует Са-активированных каналов Cl. Мы покажем, как отделить нейроны от мыши обонятельный эпителий 3 и инструкции по активации СПГ каналов или Ca-Cl активированного каналы фотолиза клетке цАМФ 4 или клетку Са 5 </ SUP>. Мы используем лампы-вспышки 6,7 применять ультрафиолетовые вспышки для цилиарной региона выпускать из клетки цАМФ или Са в то время как патч-зажим записи взяты для измерения тока в цельноклеточной напряжения зажим конфигурации 8-11.

Discussion

Флэш фотолиза клетке соединений в сочетании с патч-зажим записи является полезным методом для получения быстрого и местных скачков концентрации физиологически активных молекул внутри и вне клетки. Несколько типов клетке compounds1 были синтезированы, и эта техника может быть применена к различным типам клеток, включая культивируемые клетки выразив ионных каналов, которые могут быть активированы или модулируется фотолиза некоторые из имеющихся клетке соединений 11.

Фотолиз клетке соединений требует импульсов высокой интенсивности ближнего ультрафиолета, чтобы выпускать из клетки достаточного количества молекул в короткий промежуток времени. Различные источники света могут быть использованы: постоянно работает ртути или ксеноновой дуговой лампы контролируется затвора и связан с epifluorescent порт микроскоп, ксеноновой вспышкой лампы, УФ-лазера, а недавно разработала высокой мощностью УФ-светоизлучающих диодов (LED ). Каждый тип источника света имеет свои преимущества и недостаткищества в зависимости от конкретного применения и стоимость аппарата. По сравнению с лампой-вспышкой, постоянно работает лампы низкой интенсивности света и, следовательно, длительность импульсов света контролируется затвора должна быть увеличена до нескольких сотен мс для получения достаточного количества Uncaged молекул. УФ-лазеры стоят очень дорого. Высокая мощность УФ-светодиоды 14 для фотолиза являются в последнее время коммерчески доступны и могут обеспечить хорошую альтернативу другим методам. Тем не менее, преимущество импульсных ламп является то, что они имеют более широкий спектр излучения, чем УФ-светодиодов, что позволяет использовать несколько типов клетке соединений с различными спектральными характеристиками основных преимуществ использования лампы ксеноновой вспышкой для uncaging в нашем приложении, являются: хорошее Временное разрешение, в самом деле длительность светового импульса около 1 мс; широкий спектр УФ, который подходит для фотолиза молекул с различными фотохимических свойств; возможность выбора центовnsion светового пятна, чтобы осветить цилиарной регионе; возможность легко выбрать различной интенсивности света 6. Кроме того, ксеноновая вспышка, лампа имеет разумную цену, он легко реализуется в электрофизиологической установки, и не требует специального обслуживания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70
Air table TMC MICRO-g 63-534
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8
Data Analysis Software WaveMetrics Igor
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U
Faraday’s cage Custom Made
Filter cube Olympus Corporation U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments, Inc. 14099
Glass capillaries World Precision Instruments, Inc. PG10165-4
Glass bottom dish World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Illuminator Olympus Corporation Highlight 3100
Inverted microscope Olympus Corporation IX70
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I
Micropipette Puller Narishige International PP-830
Monitor HesaVision MTB-01
Neutral density filters Omega Optical varies
Objective 100X Carl Zeiss, Inc. Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus Corporation UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments, Inc. AGT1025
Silver ground pellet Warner Instruments 64-1309
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML
Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma-Aldrich C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma-Aldrich C7275
CsCl Sigma-Aldrich C4036
DMSO Sigma-Aldrich D8418
DNAse I Sigma-Aldrich D4527
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P3911
KOH Sigma-Aldrich P1767
Leupeptin Sigma-Aldrich L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma-Aldrich P3125
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1274
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Sigma-Aldrich S5881
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
  2. Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
  3. Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
  4. Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
  5. Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
  6. Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
  7. Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
  8. Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
  9. Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
  10. Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
  11. Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
  12. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
  13. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
  14. Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics