Author Produced

Flash fotolyse van Gekooide verbindingen in de Cilia van olfactorische sensorische neuronen

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fotolyse van gekooide verbindingen maakt de productie van snelle en gelokaliseerde toename van de concentratie van diverse fysiologisch actieve verbindingen. Hier laten we zien hoe de patch-clamp opnames gecombineerd met fotolyse van gekooide cAMP of gekooid Ca voor de studie van olfactorische transductie in gedissocieerde muis olfactorische sensorische neuronen te verkrijgen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fotolyse van gekooide verbindingen maakt de productie van snelle en gelokaliseerde toename van de concentratie van diverse fysiologisch actieve verbindingen 1. Gekooide verbindingen zijn moleculen gemaakt fysiologisch inactief door een chemische kooi die kan worden doorbroken door een flits van ultraviolet licht. Hier laten we zien hoe de patch-clamp opnames gecombineerd met fotolyse van gekooide verbindingen voor de studie van olfactorische transductie in gedissocieerde muis olfactorische sensorische neuronen te verkrijgen. Het proces van olfactorische transductie (figuur 1) vindt plaats in de cilia van olfactorische sensorische neuronen, waar odorant binding aan receptoren leidt tot de toename van cAMP dat cyclische nucleotide-gated (CNG) kanaal 2 wordt geopend. Ca ingang door CNG kanalen activeert Ca-geactiveerde Cl kanalen. We laten zien hoe de neuronen distantiëren van de muis olfactorische epitheel 3 en hoe CNG kanalen of Ca-geactiveerde Cl-kanalen activeren door fotolyse van gekooide cAMP 4 of gekooid Ca 5 </ Sup>. We maken gebruik van een flitslamp 6,7 aan ultraviolette flitsen van toepassing op de ciliaire regio vrij maken cAMP of Ca, terwijl patch-clamp opnames worden genomen om de stroom te meten in de whole-cell voltage-clamp configuratie 8-11.

Discussion

Flash fotolyse van gekooide verbindingen in combinatie met patch-clamp opnames is een handige techniek om een ​​snelle en lokale sprongen te krijgen in de concentratie van fysiologisch actieve moleculen binnen en buiten cellen. Verschillende soorten gekooide compounds1 zijn gesynthetiseerd, en deze techniek kan worden toegepast op verschillende soorten cellen, met inbegrip van gekweekte cellen die ion kanalen die kunnen worden geactiveerd of gemoduleerd door fotolyse van enkele van de beschikbare gekooide verbindingen 11.

Fotolyse van gekooide verbindingen vereist pulsen van hoge intensiteit van de UV-licht om in de buurt van een voldoende hoeveelheid van moleculen vrij maken in een korte tijd. Verschillende lichtbronnen kan worden gebruikt: een continu werkende kwik of xenon-arc lamp bestuurd door een sluiter en gekoppeld aan de epifluorescerende poort van de microscoop, een Xenon flitser lamp, een UV-laser, en de recent ontwikkelde high power UV-licht emitterende diode (LED ). Elk type lichtbron heeft voordelen en nadelentages op basis van de specifieke toepassing en de kosten van het apparaat. Vergeleken met een flash-lamp, de continu werkende lampen hebben een lagere lichtintensiteit en dus de duur van de lichtpulsen gecontroleerd door een sluiter moet worden verhoogd tot enkele honderden ms tot het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid Uncaged moleculen. UV-lasers zijn erg duur. High power LED's UV-14 voor flash fotolyse zijn onlangs in de handel verkrijgbaar en kunnen een goed alternatief voor andere methoden te bieden. Echter, een voordeel van flash-lampen is dat ze een breder emissiespectrum dan UV LED's hebben, waardoor het gebruik van verschillende soorten gekooide verbindingen met verschillende spectrale eigenschappen De belangrijkste voordelen op een Xenon flitslamp te gebruiken voor uncaging in onze applicatie zijn: een goede tijdsresolutie, inderdaad de duur van de lichtpuls is ongeveer 1 ms; een breed UV-spectrum dat geschikt is voor fotolyse van moleculen met verschillende fotochemische eigenschappen, de mogelijkheid om te kiezen voor de dubbeltjension van de lichtvlek op de ciliaire regio te verlichten, de mogelijkheid om eenvoudig kiezen uit verschillende lichtintensiteiten 6. Daarnaast is de Xenon flash-lamp een redelijke prijs heeft, is het gemakkelijk geïmplementeerd in een elektrofysiologische set-up, en vereist geen speciaal onderhoud.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70
Air table TMC MICRO-g 63-534
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8
Data Analysis Software WaveMetrics Igor
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U
Faraday’s cage Custom Made
Filter cube Olympus Corporation U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments, Inc. 14099
Glass capillaries World Precision Instruments, Inc. PG10165-4
Glass bottom dish World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Illuminator Olympus Corporation Highlight 3100
Inverted microscope Olympus Corporation IX70
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I
Micropipette Puller Narishige International PP-830
Monitor HesaVision MTB-01
Neutral density filters Omega Optical varies
Objective 100X Carl Zeiss, Inc. Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus Corporation UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments, Inc. AGT1025
Silver ground pellet Warner Instruments 64-1309
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML
Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma-Aldrich C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma-Aldrich C7275
CsCl Sigma-Aldrich C4036
DMSO Sigma-Aldrich D8418
DNAse I Sigma-Aldrich D4527
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P3911
KOH Sigma-Aldrich P1767
Leupeptin Sigma-Aldrich L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma-Aldrich P3125
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1274
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Sigma-Aldrich S5881
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
  2. Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
  3. Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
  4. Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
  5. Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
  6. Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
  7. Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
  8. Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
  9. Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
  10. Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
  11. Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
  12. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
  13. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
  14. Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics