कार्सिनोमा - एसोसिएटेड Fibroblasts के प्रायोगिक मानव स्तन Fibroblasts से जनरेशन (CAFs)

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Summary

कार्सिनोमा - जुड़े fibroblasts (CAFs) ट्यूमर stroma भीतर मौजूद myofibroblasts में अमीर, ट्यूमर प्रगति ड्राइविंग में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं. हम प्रयोगात्मक मानव स्तन fibroblasts से CAFs पैदा करने के लिए एक coimplantation ट्यूमर xengraft मॉडल विकसित किया है. प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे स्थापित करने के लिए CAF myofibroblasts कि tumourigenesis को बढ़ावा देने की क्षमता हासिल है.

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Polanska, U. M., Acar, A., Orimo, A. Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts. J. Vis. Exp. (56), e3201, doi:10.3791/3201 (2011).

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Abstract

Protocol

1. प्राथमिक सभ्य मानव सामान्य स्तन fibroblasts के अलगाव

प्राथमिक सभ्य मानव सामान्य स्तन fibroblasts को अलग करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाओं छवि में रेखांकित कर रहे हैं. 1A.

  1. 10% भ्रूण बछड़ा (FCS) सीरम, (200 / इकाइयों मिलीलीटर) पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन (, collagenase प्रकार (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर) मैं और hyaluronidase के साथ है Dulbecco संशोधित है ईगल मध्यम (DMEM): सेल हदबंदी बफर, के रूप में 12 पहले से वर्णित तैयार 125 इकाइयों / मिली).
  2. स्तन कमी mammoplasty (~ 0.5 ग्राम) फॉस्फेट में कई बार buffered खारा (पीबीएस) से dissected ऊतक धो लें. छोटे टुकड़े (<1.5 3 मिमी) बाँझ रेजर ब्लेड का उपयोग करने में ऊतक क़ीमा .
  3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ऊपर सेल हदबंदी बफर (ऊतक के 0.5 ग्राम प्रति 10 मिलीलीटर) और अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए भंवर का एक उचित मात्रा युक्त ट्यूब में ऊतक टुकड़े स्थानांतरण.
  4. सेल हदबंदी बफर च में ऊतक टुकड़े डाइजेस्टया 12-18 37 घंटे डिग्री सेल्सियस धीमी आंदोलन के साथ * ध्यान दें कि वहाँ अभी भी पचाया नहीं ऊतक ट्यूब में शेष टुकड़े के कई टुकड़े .
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए आंदोलन के बिना ट्यूब सेते हैं. एक नया शंक्वाकार 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप stromal सेल समृद्ध सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
  6. 250 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए stromal अंश अपकेंद्रित्र और पीबीएस में सेल गोली resuspend. 250 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र और DMEM में सेल गोली 10% के साथ पूरक FCS resuspend. संस्कृति DMEM एक 15 सेमी पेट्री डिश में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 10% FCS युक्त कोशिकाओं.
  7. सहधारा जब तक कोशिकाओं प्रचार. यह आमतौर पर 8-10 दिनों ले जाएगा. -80 में कोशिकाओं स्टोर डिग्री सेल्सियस ठंड मध्यम (10% डाइमिथाइल sulfoxide और एफसीएस DMEM में 20%) का उपयोग. एक मूल स्टॉक के रूप में 5 जमी शीशियों को तैयार है. एक शीशी पहले गला लें, और कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए माध्यमिक fibroblasts युक्त स्टॉक के लिए तैयार 5 शीशियों 5 आबादी के भीतर passagedदोहरीकरण (पीडीएस) के बाद के प्रयोगों के लिए. इन प्रक्रियाओं clonal चयन और संस्कृति तनाव है कि विस्तारित टिशू कल्चर के दौरान हो सकता है कम से कम. * ध्यान दें कि P1.1-7 भी एक 12 स्तन द्वारा प्राप्त स्तन कार्सिनोमा से अलग CAFs करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. GFP लेबल puromycin प्रतिरोधी, अमर मानव सामान्य स्तन fibroblasts पीढ़ी

  1. Immortalise प्राथमिक मानव सामान्य स्तन P1.7 में अलग fibroblasts), एक रेट्रोवायरल (MSCV IRES - GFP) pMIG 12 वेक्टर, दोनों hTERT और GFP व्यक्त परिचय. संस्कृति 4-5 दिनों के लिए कोशिकाओं और फिर GFP सकारात्मक प्रवाह cytometry कोशिकाओं का उपयोग सॉर्ट करें.
  2. परिचय एक रेट्रोवायरल pBabe - puro GFP लेबल अमर fibroblasts में एक puromycin प्रतिरोध जीन एन्कोडिंग निर्माण. संस्कृति puromycin की उपस्थिति में 5-7 दिनों (अंतिम एकाग्रता: 1 μg / एमएल) के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए GFP सकारात्मक (+ GFP), (puromycin प्रतिरोधी puro आर
  3. अगला जांच, कि क्या इन fibroblasts सक्रिय वायरस, 2.5x10 GFP 5 + puro आर 2 दिनों के लिए 6 सेमी पेट्री डिश में मानव स्तन fibroblasts अमर जो GFP और puromycin प्रतिरोध जीन एन्कोडिंग की क्षैतिज हस्तांतरण करने के लिए नेतृत्व विकसित कर सकते हैं उत्पादन
  4. फ़िल्टर मध्यम एक सिरिंज फिल्टर (ताकना आकार: 0.45 सुक्ष्ममापी) का उपयोग करते हुए इन fibroblasts द्वारा वातानुकूलित और 10T1 / 2 माउस तंतुप्रसू संबंधी कोशिकाओं पर 12h के लिए यह protamine सल्फेट (5 μg / मिलीलीटर) है जो वायरस के संक्रमण की क्षमता बढ़ जाती है की उपस्थिति में जोड़ें. मध्यम तो अतिरिक्त 2 दिनों के लिए 10% FCS-DMEM बदल दिया है.
  5. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की जांच करते हैं. 10T1 / 2 GFP वायरस से संक्रमित कोशिकाओं GFP सकारात्मक हो जाएगा. 5-7 दिनों के लिए भी puromycin (1 μg / एमएल) के साथ कोशिकाओं को समझो और प्लेट निरीक्षण अगर किसी भी 10T1 आर puro / 2 कोशिकाओं puromycin उपचार के बाद वर्तमान और फार्म कालोनियों हैं.
  6. नोट करें कि क्षैतिज जीन ट्रॅनसक्रिय माता पिता GFP + puro आर मानव स्तन fibroblasts द्वारा उत्पादित वायरस द्वारा sfer आसपास murine कोशिकाओं और / या ट्यूमर xenografts के भीतर कार्सिनोमा कोशिकाओं GFP + आर puro कर सकता है . यह GFP शुरू इंजेक्शन + puro आर ट्यूमर xenografts से मानव स्तन fibroblasts अलग करने की प्रक्रिया में बाधा सकता है.

3a. स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ मानव स्तन fibroblasts की एक immunodeficient चूहे में Coinjection

ऍक्स्प CAFs पैदा करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाओं छवि में सचित्र हैं. 1Ba.

  1. मिक्स 1x10 6 MCF 7 - रास मानव स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं और 3x10 GFP 6 + puro आर, अमर मानव स्तन P2.2 में उत्पन्न fibroblasts). संस्कृति के माध्यम से 400 μl में 50% (v / v) इंजेक्शन प्रति Matrigel के साथ कोशिकाओं को तैयार है.
  2. Subcutaneously एक immunodeficient नग्न माउस में सेल मिश्रण इंजेक्षन. जब CAFs से अलग स्वतंत्र निकाले जाते हैंट्यूमर, कई चूहों के दाएँ और बाएँ flanks में प्रत्येक मिश्रण प्रत्यारोपण.

3b. मानव स्तन fibroblasts की एक immunodeficient चूहे में इंजेक्शन

  1. ऍक्स्प-CAFs के खिलाफ नियंत्रण fibroblasts उत्पन्न करने के लिए, 3x10 6 GFP + puro आर अमर मानव संस्कृति के माध्यम से 400 μl में P2.2 में 50% (v / v) Matrigel प्रति इंजेक्शन (1Bb छवि) के साथ उत्पन्न स्तन fibroblasts तैयार करते हैं. कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ fibroblasts मिश्रण नहीं है.
  2. नग्न चूहों के चमड़े के नीचे साइटों में P3b.1 में तैयार fibroblasts प्रत्यारोपण.

* नोट है कि inoculated fibroblasts त्वचा के नीचे तंतुप्रसू संबंधी लेकिन नहीं ट्यूमर ऊतक फार्म का होगा .

4a. ट्यूमर xenograft के विच्छेदन

  1. 42 दिन पोस्ट आरोपण (1Ba छवि) * नोट उपचर्म मानव स्तन कैंसर xenograft शरण है कि जब अन्य कार्सिनोमा कोशिकाओं और / या fibroblasts coimplanted हैं माउस Euthanise, Fibroblasts अब से 42 दिनों के लिए ट्यूमर xenograft के भीतर incubated उनके myofibroblastic phenotype आरंभ करने की आवश्यकता हो सकती है.
  2. कुंद संदंश और कैंची का उपयोग विच्छेदन के द्वारा माउस के पार्श्व से ट्यूमर xenograft हार्वेस्ट. पीबीएस में ट्यूमर ऊतक विसर्जित कर दिया.

4b. Fibroblast xenograft के विच्छेदन

  1. Fibroblast xenograft 42 दिनों के बाद आरोपण (1Bb छवि) शरण माउस Euthanise.
  2. उपचर्म fibroblast xenograft काटना संदंश और कैंची का उपयोग. पीबीएस में तंतुप्रसू संबंधी ऊतक प्लेस * ध्यान दें कि एक fibroblast xenograft, जो एक छोटे से पारदर्शी ऊतकों के रूप में प्रकट होता है त्वचा के नीचे खोजने के लिए मुश्किल हो सकता है.

5. Xenografts से प्राथमिक संवर्धित कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग करने के लिए ट्यूमर (~ 0.5 ग्राम) या तंतुप्रसू संबंधी ऊतक (~ 0.1 ग्राम) टुकड़े करना. एक 15 सेमी संस्कृति घ के शीर्ष पर excised ऊतकों स्थानांतरणपीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ ish. छोटे ऊतक (<1.5 3 मिमी) टुकड़े बाँझ रेजर ब्लेड का उपयोग करने में ऊतकों क़ीमा . * नोट है कि अगर fibroblast xenograft कम से कम 0.1 ग्राम वजन का होता है, कुछ अतिरिक्त fibroblast xenografts इकट्ठा करने और उन्हें एक साथ मिश्रण करने के लिए अलगाव के लिए कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि.
  2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब युक्त सेल हदबंदी बफर (ऊतक के 0.5 ग्राम प्रति 10 मिलीलीटर) और अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए भंवर में ऊतक टुकड़े स्थानांतरण.
  3. 37 पर 3 घंटे के लिए सेल निलंबन सेते ° सी धीमी गति से निरंतर आंदोलन के साथ.

6. संस्कृति में puromycin प्रतिरोधी कोशिकाओं के अलगाव

  1. सेल निलंबन dissociated या तो ट्यूमर या fibroblast xenograft से 250 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए और अपकेंद्रित्र पीबीएस में सेल गोली resuspend. 250 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र 10% FCS-DMEM में जिसके परिणामस्वरूप सेल गोली Resuspend. संस्कृति puromycin (1 μg / एमएल) की उपस्थिति में एक 15 सेमी पेट्री डिश में 37 कोशिकाओं डिग्री सेल्सियसऔर 5% के क्रम में कार्बन डाइऑक्साइड के किसी भी contaminating कार्सिनोमा कोशिकाओं और / या murine stromal कोशिकाओं को खत्म करने के लिए. सहधारा (2-4 सप्ताह) तक कोशिकाओं प्रचार. -80 में कोशिकाओं स्टोर ° ठंड माध्यम का उपयोग सी. * ध्यान दें कि जिसके परिणामस्वरूप puro आर कोशिकाओं, नामित 42 दिन पुरानी CAF1 ऍक्स्प (1Ba छवि) या नियंत्रण fibroblast 1 (1Bb छवि) कोशिकाओं, अमर और GFP के लिए सकारात्मक रहे हैं. यह जांच अगर इन कोशिकाओं को सक्रिय वायरस उत्पादन 10T1 / 2 कोशिकाओं, के रूप में P2.3-6 में वर्णित का उपयोग की सिफारिश की है.

7a. संस्कृति में EXP CaF2 कोशिकाओं का अलगाव

आगे CAFs की सक्रिय myofibroblastic फेनोटाइप को बढ़ावा देने के लिए, 42 दिन पुरानी MCF 7 - रास कोशिकाओं के साथ ऍक्स्प-CAF1 कोशिकाओं मिश्रण और उन्हें फिर से 200 दिनों की अतिरिक्त अवधि के लिए एक नग्न माउस में subcutaneously इंजेक्षन. काटना और एक एकल कोशिका निलंबन और puromycin (1 μg / एमएल) की उपस्थिति में एक 15 सेमी 10% FCS-DMEM के साथ पेट्री डिश में कोशिकाओं संस्कृति में ट्यूमर xenograft अलग कर देना, के रूप में P6 में संकेत दिया0.1. सहधारा (8-10 दिन) तक कोशिकाओं प्रचार. -80 में कोशिकाओं स्टोर ° ठंड माध्यम का उपयोग सी. परिणामस्वरूप puro आर कोशिकाओं 242 दिन पुराने ऍक्स्प-CaF2 कोशिकाओं (1Ba छवि) नाम हैं.

7b. नियंत्रण संस्कृति में fibroblast-2 कक्षों का निष्कर्षण

ऍक्स्प-CaF2 कोशिकाओं के खिलाफ नियंत्रण fibroblasts उत्पन्न करने के लिए, 42 दिन पुरानी नियंत्रण fibroblast-1 कोशिकाओं कार्सिनोमा कोशिकाओं के बिना अकेले subcutaneously एक नग्न माउस में अतिरिक्त इंजेक्षन 200 दिनों के लिए. काटना और एक एकल कक्ष निलंबन और puromycin (1 μg / एमएल) की उपस्थिति के रूप में P6.1 में संकेत में एक 15 सेमी 10% FCS-DMEM के साथ पेट्री डिश में कोशिकाओं संस्कृति में तंतुप्रसू संबंधी ऊतकों को अलग कर देना. जब तक (3-4 सप्ताह) सहधारा कोशिकाओं प्रचार. -80 में कोशिकाओं स्टोर ° ठंड माध्यम का उपयोग सी. परिणामस्वरूप puro आर कोशिकाओं नियंत्रण fibroblast 2 कोशिकाओं (1Bb छवि) का नाम हैं .

8. प्रतिनिधि परिणाम:

Fibroblast-2 और cel ऍक्स्प-CaF2 नियंत्रणरास, जो स्तन ट्यूमर xenografts से निकाले गए मानव विशिष्ट vimentin prolyl-4-hydroxylase कोलेजन 1A, fibronectin, S100A4, और fibroblast सतह प्रोटीन (2A छवि) 11 सहित mesenchymal मार्करों, के लिए सकारात्मक दृढ़ता से सना हुआ है, मानव का संकेत मूल और इन कोशिकाओं की mesenchymal प्रकृति. इसके विपरीत, cytokeratin, उपकला कोशिकाओं के लिए एक मार्कर, इन GFP + fibroblasts (चित्र 2B) में दाग नहीं था . इसलिए इन निष्कर्षों को सुझाव है कि निकाले ऍक्स्प CaF2 और नियंत्रण fibroblast-2 कोशिकाओं पैतृक मानव स्तन शुरू माउस xenografts में पेश fibroblasts से उत्पन्न है.

महत्वपूर्ण बात, ऍक्स्प-CaF2 कोशिकाओं की एक उच्च अनुपात α-SMA और बाह्य मैट्रिक्स tenascin सी ग्लाइकोप्रोटीन 5, जो दोनों के myofibroblasts के मार्करों 42 दिन पुरानी ऍक्स्प CAF1 और नियंत्रण fibroblast-2 कोशिकाओं (चित्र के लिए तुलना कर रहे हैं के लिए सकारात्मक दाग -2 सी, डी) 11. इन आंकड़ों कि निवासी मानव स्तन fibr से संकेत मिलता हैओब्लास्ट्स उत्तरोत्तर ट्यूमर xenografts भीतर CAF myofibroblasts में विकसित.

चित्रा 1
चित्रा 1 मानव स्तन fibroblasts की अलगाव की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. ए) में कमी mammoplasty ऊतक बाँझ रेज़र ब्लेड (P1.2) का उपयोग कर कीमा बनाया हुआ था और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (P1.3) में स्थानांतरित. छोटे ऊतक टुकड़े सेल हदबंदी बफर (P1.4) में पचा थे और इन विट्रो (P1.5-7) में संस्कृति के लिए तैयार है . पृथक प्राथमिक मानव स्तन fibroblasts, रेट्रोवायरल (MSCV IRES GFP) pMIG वेक्टर, दोनों hTERT और GFP व्यक्त immortalise करने के लिए, शुरू किया गया था और जिसके परिणामस्वरूप GFP सकारात्मक कोशिकाओं प्रवाह cytometry (P2.1) का उपयोग करके हल किया गया. एक रेट्रोवायरल pBabe puro एक puromycin प्रतिरोध जीन एन्कोडिंग वेक्टर तो इन कोशिकाओं में पेश किया गया था. Puromycin उपचार पर, GFP लेबल (GFP +) (Puro नि.) puromycin प्रतिरोधी, immortalised मानव स्तन fibroblasts (P2.2) अलग थे.

बा) उत्पन्न करने के लिए ऍक्स्प-CAFs, GFP + आर puro अमर मानव स्तन fibroblasts एक immunodeficient नग्न माउस (P3a) में subcutaneously MCF-7-रास स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ coinjected थे . ट्यूमर xenograft आरोपण के बाद 42 दिनों (P4a) में resected किया गया था और एक एकल कोशिका (P5) निलंबन में dissociated. इन कोशिकाओं को फिर puromycin की उपस्थिति में इन विट्रो में संवर्धित करने के लिए किसी भी contaminating कार्सिनोमा कोशिकाओं और माउस stromal कोशिकाओं (P6) को खत्म करने. puromycin - प्रतिरोधी कोशिकाओं को परिणामस्वरूप प्रयोगात्मक उत्पन्न CAF1 कोशिकाओं (ऍक्स्प-CAF1) करार दिया गया. इन कोशिकाओं को, आरोपण के बाद 42 दिनों resected, MCF 7 - रास कोशिकाओं के साथ एक बार फिर से मिलाया गया और एक मेजबान माउस में subcutaneously पहले (P7a) के रूप में प्रत्यारोपित किया. परिणामस्वरूप ट्यूमर को 200 दिनों की अतिरिक्त अवधि के लिए बढ़ने की अनुमति दी गई थी, तो dissected, अलग, और puromycin की उपस्थिति में सुसंस्कृत. पृथकpuromycin प्रतिरोधी कोशिकाओं ऍक्स्प-CaF2 कोशिकाओं (242 दिन पुरानी) करार दिया गया.

) बी बी ऍक्स्प-CAFs के खिलाफ नियंत्रण कोशिकाओं को अलग करने के लिए, GFP puro + आर अमर मानव स्तन fibroblasts subcutaneously शुद्ध संस्कृतियों के रूप में एक नग्न माउस में MCF 7 - रास कोशिकाओं (P3B ) के बिना अंतःक्षिप्त थे. तंतुप्रसू संबंधी ऊतक, dissected 42 दिनों के बाद आरोपण (P4b), एकल कोशिका (P5) निलंबन और puromycin प्रतिरोधी कोशिकाओं नियंत्रण fibroblast एक कोशिकाओं के नाम में अलग किया गया था, थे के रूप में पहले वर्णित पृथक (P6). इन fibroblasts एक बार फिर एक नग्न माउस में subcutaneously 200 दिन (P7B) के लिए MCF-7-रास अतिरिक्त कोशिकाओं के बिना प्रत्यारोपित किया गया. dissected तंतुप्रसू संबंधी ऊतक, अलग, और puromycin की उपस्थिति में सुसंस्कृत. पृथक puromycin प्रतिरोधी कोशिकाओं को नियंत्रण fibroblast 2 कोशिकाओं (242 दिन पुरानी) करार दिया गया.

चित्रा 2
चित्रा 2 दाग (बी) के विपरीत, अखिल cytokeratin, उपकला कोशिकाओं के लिए एक मार्कर ऍक्स्प-CaF2 GFP (हरा) व्यक्त की कोशिकाओं में पता नहीं है. सेल नाभिक (DAPI) 4'6 Diamidino-2 - phenylindole (नीला) के साथ दाग रहे हैं. स्केल बार, 50 सुक्ष्ममापी (Kojima एट अल से संदर्भित 11.)

(सी) ऍक्स्प CaF2 कोशिकाओं और नियंत्रण fibroblast-2 कोशिकाओं (नियंत्रण एफ) α-SMA (लाल) या tenascin - सी (TN सी) (लाल) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करने के immunofluorescence. सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग हैं. स्केल पट्टी, 50 सुक्ष्ममापी (डी) ऍक्स्प-CaF2 कोशिकाओं के 48%. Α-SMA के लिए सकारात्मक है, जबकि 1 , दाग42 दिन पुरानी ऍक्स्प-CAF1 के 4% और नियंत्रण fibroblast-2 सेल आबादी के 2.5% α-SMA के लिए सकारात्मक रहे हैं. (Kojima एट al.11 से संदर्भित)

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Discussion

CAF विशेष मार्करों और विविधता के स्तर की कमी मनाया बीच CAFs इस सेल प्रकार अपने आप में एक चुनौती के लक्षण वर्णन सौंपनेवाला. इन विट्रो में अध्ययन CAFs भी अतिरिक्त जटिलता द्वारा निस्र्द्ध गया है कि इन कोशिकाओं को senesce और जब एक लंबी अवधि के लिए संवर्धित proliferating बंद. हमारे पिछले सीधे प्राथमिक रेट्रोवायरल hTERT सीडीएनए का निर्माण का उपयोग CAFs immortalise करने का प्रयास असफल रहा था. इसलिए, आगे से इन कोशिकाओं के गुणों को बढ़ावा देने के ट्यूमर की जांच करने के लिए, हम मानव स्तन एक coimplantation ट्यूमर xenograft मॉडल का उपयोग कर fibroblasts से अमर CAFs उत्पन्न करने के लिए एक विधि विकसित की. प्राथमिक मानव स्तन fibroblasts, कमी mammoplasty ऊतकों से निकाली गई, स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ चूहों में इंजेक्ट किया जा रहा से पहले अमर थे. मानव fibroblasts तो जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर xenografts है (चित्र देखें 1Ba विवरण के लिए.) से अलग थे. महत्वपूर्ण बात, मानव स्तन fibroblasts तेजी से ईट्यूमर ट्यूमर प्रगति के दौरान myofibroblastic CAFs को बढ़ावा देने में volved. हम वास्तव में कहा है कि 242 दिन की उम्र में ऍक्स्प-CaF2 कोशिकाओं तक अधिक से अधिक ट्यूमर को बढ़ावा देने के लिए 42 तुलना में myofibroblastic क्षमता दिखाने के लिए - या 70 दिन पुरानी ऍक्स्प CAF1 कोशिकाओं और नियंत्रण fibroblast-2 कोशिकाओं 11. इस तरह के ट्यूमर ऍक्स्प-CaF2 कोशिकाओं है, जो भी स्तन कैंसर के रोगियों से तैयार CAFs में मनाया जाता है myofibroblastic क्षमता को बढ़ावा देने, autocrine संकेतन TGF-β और एसडीएफ -1 11 साइटोकिन्स द्वारा मध्यस्थता छोरों की स्थापना पर निर्भर करता है. न तो जीन या सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं और fibroblasts, mediates हमारे xenograft मॉडल 11 में उत्पन्न CAFs के phenotypes के बीच संलयन हस्तांतरण . साथ में ले ली, इन टिप्पणियों का सुझाव है कि xenograft व्युत्पन्न ऍक्स्प-CAFs मानव स्तन कार्सिनोमा के भीतर मौजूद CAFs के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा. वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल भी विभिन्न मानव carcinomas के अन्य प्रकार से प्रारंभिक CAFs को अलग करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम उदार और इस काम और इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण संपादन के लिए श्री कीरन Mellody (मैनचेस्टर, मैनचेस्टर विश्वविद्यालय) के समर्थन के पर्यवेक्षण के लिए डॉ. रॉबर्ट ए Weinberg (व्हाइटहेड जैव चिकित्सा अनुसंधान, कैम्ब्रिज के लिए संस्थान) धन्यवाद. इस परियोजना अनुसंधान (सीआर ब्रिटेन) अनुदान C147/A6058 संख्या (एओ) ब्रिटेन द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 61965-026
Fetal calf serum GIBCO, by Life Technologies 10270
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-1G
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272
Vimentin (V9) antibody Novocastra Laboratories

NCL-L-

VIM-V9
Tenascin C (BC-8) antibody

a gift from
Dr. Luciano

Zardi
α-SMA-Cy3 (1A4) antibody Sigma-Aldrich C6198

Prolyl-4-hydroxylase

Dako M0877
(5B5) antibody
Collagen type1 1A antibody Sigma-Aldrich HPA011795
Pan-cytokeratin antibody Sigma-Aldrich C5992
Fibronectin antibody BD Biosciences 610077

S100A4/FSP-1 (fibroblast-

specific protein-1) antibody
Dako A5114

Fibroblast surface protein

(clone 1B10) antibody
Abcam ab11333
MSCV-IRES-GFP construct Request to the the authors
pBabe-puro construct

Purchase

from Addgene
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
DAPI Sigma-Aldrich D9564
15 ml conical tube Corning 430766
Nude mouse Taconic NCRNU-F Female NCr nude
C3H/10T1/2 cells ATCC CCL-226

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References

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Comments

1 Comment

  1. Can I immortalize the primary fibroblasts with pBaba-hygro-hTERT plasmid directly? Should I make viral particles or direct transfection in the fibroblasts will work? If direct transfection, what reagent is suitable for primary fibroblasts? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 2:44 PM

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