इमेजिंग ल्युकोसैट उच्च Intraluminal दबाव में संवहनी endothelium के लिए आसंजन

Immunology and Infection
 

Summary

यह एक विधि काटा दबाव वाहिकाओं में endothelium के लिए ल्युकोसैट आसंजन कल्पना है. तकनीक कतरनी प्रवाह के तहत intraluminal दबाव भिन्न 200 mmHg इस प्रकार उच्च रक्तचाप के pathophysiological शर्तों नकल - आईएनजी के साथ संवहनी आसंजन का अध्ययन सक्षम बनाता है.

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Michell, D. L., Andrews, K. L., Woollard, K. J., Chin-Dusting, J. P. Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure. J. Vis. Exp. (54), e3221, doi:10.3791/3221 (2011).

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Abstract

Protocol

1. मन्या धमनियों को अलग

  1. Euthanase10 सप्ताह सीओ 2 / O 2 asphyxiation के माध्यम से पुराने Sprague Dawley चूहों.
  2. आबकारी महाधमनी और दिल के साथ छोड़ दिया और सही आम मन्या धमनियों वाहिकाओं के न्यूनतम खींच सुनिश्चित करने.
  3. अलग बर्फ ठंड क्रेब्स बफर के महाधमनी और दिल से मन्या धमनियों और करीब विच्छेदन प्रदर्शन.
  4. बर्फ पर बढ़ते पहले क्रेब्स में पृथक वाहिकाओं रखें.

लगभग. समय = 45 मिनट

2. भड़काना पोत कक्ष

  1. बफर के माध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस, पोत चैम्बर फ्लश क्रेब्स बफर carbogen गैस (5% सीओ 2 के 95% 2 हे) infusing द्वारा शारीरिक पीएच पर बनाए रखा के प्रॉक्सिमल और डिस्टल connectors कम
  2. सुनिश्चित टयूबिंग और cannulas पूरी तरह से प्लावित कर रहे हैं और गठबंधन.
  3. P1 (प्रॉक्सिमल) और p2 transducers (डिस्टल) के माध्यम से Kreb बफर फ्लश. बंद करने के लिए transducers में कोई हवाई बुलबुले सुनिश्चित नल.
  4. इसी connectors के लिए transducers कनेक्ट और फिर से अधिक क्रेब्स कोई हवाई बुलबुले को सुनिश्चित करने के बफर फ्लश. चैम्बर के लिए बंद नल.

लगभग. समय = 15 मिनट

3. पोत कक्ष दबाव

  1. दबाव उपकरणों पर मुड़ें: दबाव सहायक, प्रेशर मॉनीटर, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (चित्रा 1).
  2. 20 (1 पर डायल) mmHg, कोई हवाई बुलबुले सुनिश्चित करने पर टयूबिंग के माध्यम से दबाव और स्वत: चलाने के क्रेब्स बफर पर दबाव इमदादी पर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के साथ.
  3. बंद P2 transducer के लिए टयूबिंग कनेक्ट. दबाव स्थिर हो जाएगा.
  4. पोत चैम्बर P2 नल खोलने के लिए बाहर फ्लश किसी भी बुलबुले को फिर से बंद है.
  5. क्रेब्स बफर (- 7 एमएल 5) के साथ स्नान भरें.

लगभग. समय = 10 मिनट

4. पोत बढ़ते

  1. प्रत्येक प्रवेशनी पर एक विदारक माइक्रोस्कोप जगह काले पॉलिएस्टर संबंधों (चित्रा 2) के तहत.
  2. Cannulas और प्रवेशनी धारकों के अलावा ले जाएँ और माउंट ¼ पोत पर P1 प्रवेशनी (महाधमनी चाप अंत). पोत आँसू नहीं सुनिश्चित करें.
  3. क्रेब्स बफर के साथ भरा सिरिंज का प्रयोग धीरे P1 transducer के माध्यम से पोत के अतिरिक्त रक्त बाहर निकलवाने. चैम्बर के लिए P1 बंद.
  4. पॉलिएस्टर टाई के साथ P1 प्रवेशनी सुरक्षित पोत.
  5. P2 प्रवेशनी पर बढ़ते के लिए cannulas / प्रवेशनी करीब धारकों ले जाएँ.
  6. माउंट पोत के बाहर का अंत (~ की लंबाई ¼) बाहर का प्रवेशनी पर. पॉलिएस्टर टाई के साथ सुरक्षित.

लगभग. समय = 20 मिनट

5. पोत पर दबाव

  1. प्रवेशनी धारकों को समायोजित करने के लिए मोड़ नहीं है या बर्तन में खिंचाव सुनिश्चित.
  2. साथ P1 और p2 चैम्बर के लिए बंद कर दिया मैनुअल के लिए स्वत: से दबाव सहायक स्विच. दबाव इमदादी पर की जाँच करें वहाँ 10 सेकंड के भीतर दबाव में कोई निरंतर कमी नहीं है. अगर वहाँ है, एक दरार उत्पन्न है और कनेक्शन और transducers के लिए जगह में सुरक्षित करने की आवश्यकता है.
  3. दबाव सहायक वापस स्वत तो खुले चैम्बर के लिए P2 के लिए समायोजित करें. माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण पोत चौड़ा करना है जब नल चैम्बर खोला है.
  4. पुस्तिका दबाव सहायक स्विच. 10 सेकंड के भीतर दबाव में लगातार कमी के लिए फिर से जाँच करें. अगर वहाँ एक दरार है तो प्रणाली तंग दबाव नहीं है और वहाँ के बर्तन में छेद होने की संभावना है.
  5. स्वत: खुला P1 वापस चैम्बर के लिए स्विच. मैनुअल सेटिंग में जाँच करें कि दबाव स्थिर रहता है.
  6. यदि पुस्तिका सेटिंग वृद्धि डायल पर 2 (40 mmHg) कोई रिसाव,.
  7. स्वत: समायोजित और माइक्रोस्कोप के तहत पोत का निरीक्षण. यदि आवश्यक हो, प्रवेशनी धारक को समायोजित पुस्तिका सेटिंग पर लीक के लिए vessel.Check में कोई मोड़ सुनिश्चित करने के लिए.
  8. 5.7 डायल 3 (60 mmHg) में वृद्धि, जब तक वांछित दबाव तक पहुँच जाता है पर - 5.6 4 (80 mmHg) और इसलिए कदम दोहराएँ.

लगभग. समय = 15 - 30 मिनट

6. दबाव पोत incubating

  1. तापमान नियंत्रक 37 सेट डिग्री सेल्सियस कनेक्ट
  2. एक दूसरे के पोत कक्ष स्नान में क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप perfuse क्रेब्स बफर (1 एमएल / मिनट) के साथ.
  3. कनेक्ट केवल स्नान के ऊपर परत सुनिश्चित करने के चैम्बर के लिए Aspirator निकाल दिया जाता है.
  4. 37 ° C पर दबाव स्वचालित करने के लिए सेट के साथ एक घंटे के लिए दबाव पोत सेते हैं.
  5. दबाव (मार्गदर्शन करने के लिए स्विचन) समय - समय पर नहीं लीक कर रहा है की जाँच करें.
  6. विभिन्न औषधीय हस्तक्षेप के प्रभाव बस ऊष्मायन के दौरान स्नान करने के लिए यौगिक जोड़कर देखा जा सकता है है.

लगभग. समय = 1 घंटे

7. पूरे रक्त के साथ दबाव पोत Perfusing

  1. ऊष्मायन के दौरान कम से कम 7.5 एमएल मानव पूरे रक्त / 40 यू हेपरिन / एमएल रक्त में एकत्र पोत प्राप्त करते हैं. 37 पर एक 50 मिलीलीटर बाज़ में सेते डिग्री सेल्सियस
  2. टी के अंत से पहले 10 मिनट37 पर 10 मिनट के लिए VybrantDil (1:1000) के साथ ऊष्मायन लेबल रक्त वह ° सी के अंधेरे में.
  3. 10 मिनट के बाद, किसी भी बुलबुले समाशोधन सिरिंज में रक्त इकट्ठा करने और एक गर्मी 37 पर सेट जैकेट ° सी. के साथ एक सिरिंज पंप पर देते हैं
  4. चैम्बर / पोत P1 transducer और बंद सिरिंज और बेकार टयूबिंग कनेक्ट.
  5. 1000 μL / मिनट बर्बाद टयूबिंग के माध्यम से किसी भी बुलबुले को दूर करने पर पर्ज रक्त.
  6. चैम्बर के लिए P1 खोलें. दबाव सहायक स्वचालित रूप से समायोजित करने के लिए वांछित दबाव बनाए रखना होगा.
  7. 100 μL / मिनट पर खून Perfuse.
  8. एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन 15 सेकंड के लिए एक डिजिटल कैमरा रिकॉर्ड perfused पोत के दो 1 पर, फ़ील्ड 3, 5, 7.5 और 10 मिनट के लिए युग्मित का उपयोग करना.
  9. डाक छिड़काव endothelial अखंडता और समारोह जैसे आगे भड़काऊ प्रतिक्रिया को मान्य myograph और आसंजन अणु अभिव्यक्ति immunohistochemistry द्वारा निर्धारित किया जा सकता है औषधीय तकनीकों के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है.

लगभग. समय = 15 मिनट

8. प्रतिनिधि परिणाम:

दबाव कक्ष की स्थापना के एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में दिखाया गया है. साथ लाइव वीडियो रिकॉर्डिंग के माध्यम से एक डिजिटल कैमरा एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन परिणाम के लिए मिलकर तुरन्त कल्पना कर सकते हैं. प्रतिनिधि वीडियो छवियों चित्रा 3 जहां leukocytes endothelium के अनुयायी हो सकता है अगर वे 10 सेकंड के लिए स्थिर बने रहे पर विचार कर रहे हैं में देखा जाता है. सतत पाश पालन कोशिकाओं पर वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ एक औसत प्रति क्षेत्र के रूप में गिना जा सकता है है. जबकि दोनों (चित्रा 3A) कम और उच्च दबाव (3B चित्रा) आसंजन के कुछ राशि का कारण होगा उच्च intraluminal दबाव में ल्युकोसैट आसंजन में महत्वपूर्ण वृद्धि देखी है और यह भी मात्रात्मक प्रदर्शन किया है (चित्रा 4).

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रेशराइज्ड पूर्व vivo पोत चैम्बर योजनाबद्ध एक cannulated पोत एक प्रॉक्सिमल (P1) transducer और एक बाहर का (P2) transducers है कि रक्तचाप पोत के भीतर सक्षम बनाता है चालाकी से किया जा से जुड़े. छिड़काव P1 transducer और दबाव के माध्यम से है P2 transducer के माध्यम से बनाए रखा है.

चित्रा 2
चित्रा 2. संबंधों के साथ Cannuala काले पॉलिएस्टर संबंधों प्रत्येक प्रवेशनी से जुड़े होते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिनिधि वीडियो छवियों प्रतिदीप्ति तहत गतिशील सेल (लाल तीर) 80 mmHg (ए) और 120 mmHg पर आसंजन (बी) के छिड़काव के 10 मिनट के बाद.

चित्रा 4
चित्रा 4 Sprague Dawley में ल्युकोसैट आसंजन कम से कम 1 घंटे ऊष्मायन (80 mmHg) और उच्च दबाव (120 mmHg) के बाद मन्या धमनियों. *** 0.001 <पी, के रूप में 2 तरह दोहराया एनोवा उपायों Bonferroni अस्थायी पद परीक्षण का उपयोग से विश्लेषण.

Discussion

यह एक संशोधित बरकरार वास्तविक समय में दबाव की शर्तों के तहत अलग रक्त वाहिकाओं में endothelium ल्युकोसैट आसंजन अध्ययन विधि है. अकेले पोत चैम्बर के छिड़काव बड़े चूहों और चूहे वाहिकाओं के समर्थक भड़काऊ उपभेदों के एक त्वरित सत्यापन के लिए सक्षम बनाता है. सक्षम करने से दबाव हेरफेर गतिशील सेल बातचीत बहुत उच्च intraluminal दबाव है, इस प्रकार बेहतर नकल रही शारीरिक और pathophysiological शर्तों को कम से मनाया अनुमति देता है. जहाजों के व्यास भी पर्याप्त सेल इमेजिंग प्रोग्राम का उपयोग और इसलिए कतरनी प्रवाह और दर और निर्धारित किया जा सकता है इसलिए चालाकी से मापा जा सकता है.

अपनी myograph क्षमताओं के साथ, औषधीय स्नान में रखा हस्तक्षेप इस मॉडल यंत्रवत और संकेत रास्ते के अध्ययन को सक्षम करने के साथ प्रयोगात्मक संभव स्थिति के लिए एक और आयाम जोड़. जबकि endothelial संरक्षण दबाव हेरफेर के दौरान पुष्टि नहीं हो सकते हैं, ACH और पीई के लिए प्रतिक्रियाओं के बाद 9 छिड़काव आयोजित किया जा सकता है.

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस सेटअप सेल के लिए सेल काँपने के गुणवाला रक्त प्रवाह और न ही सिस्टोलिक या diastolic दबाव के प्रभाव नहीं बातचीत पर intraluminal दबाव के प्रभाव को दर्शाता है. इसके अलावा, जबकि ल्युकोसैट आसंजन पर तीव्र दबाव परिवर्तन मनाया गया, इस सेटअप भी हो सकता है पुरानी दबाव प्रभाव (यानी ऊष्मायन बार बढ़ती है और एक पुरानी दबाव पशु मॉडल का उपयोग) को देखने का उपयोग कर सकते हैं. Sprague Dawley आम मन्या धमनियों इस सेट में प्रदर्शन कर रहे हैं, लेकिन अन्य उपभेदों और प्रजातियों प्रवेशनी आकार के लिए उपयुक्त समायोजन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. वास्तव में, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि और जानवरों की उम्र और वजन पोत आकार को प्रभावित और इस तरह है कि सेट अप के लिए प्रत्येक पोत के लिए व्यक्तिगत की जरूरत है. संयोजी ऊतक के बंद और सावधान विच्छेदन leukocytes के दृश्य काफी सुधार कर सकते हैं.

Disclosures

अध्ययन प्रोटोकॉल अल्फ्रेड मेडिकल रिसर्च और शिक्षा सीमा पशु आचार समिति और अल्फ्रेड अस्पताल आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.

Acknowledgments

इस अध्ययन में भाग विक्टोरियन है सरकार OIS कार्यक्रम, राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया कार्यक्रम और परियोजना अनुदान के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (JPF ठोकरें - चिन) और स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति (डी मिचेल) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Carl Zeiss, Inc. SteREO Discovery V.20
PHD 2000 Syringe Pump Harvard Apparatus 70-2016
Digital Camera and Controller Hamamatsu Corp. C4742-95
Fluorescence Illumination System Lumen Dynamics X-Cite 120
Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH/1/SH
Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS - 200
Perfusion Pressure Monitor Living Systems Instrumentation PM - 4
2 x Pressure Transducer Living Systems Instrumentation PT - F
Temperature Controller Living Systems Instrumentation TC-01
Peristaltic Pump Instech Laboratories, Inc P720
VybrantDil cell-labelling solution Invitrogen V-22885 Use 1:1000

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References

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