प्रेरण और चूहों में दत्तक विलंबित प्रकार hypersensitivity की निगरानी

Biology

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Summary

विलंबित प्रकार hypersensitivity (डीटीएच) एक सूजन प्रतिक्रिया CCR7 effector स्मृति टी lymphocytes (मंदिर) द्वारा मध्यस्थता है. यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे विशिष्ट प्रतिजन मंदिर कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए, लुईस चूहों में दत्तक डीटीएच प्रेरित और भड़काऊ प्रतिक्रिया की निगरानी.

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Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats. J. Vis. Exp. (8), e325, doi:10.3791/325 (2007).

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Abstract

विलंबित प्रकार hypersensitivity (डीटीएच) एक सूजन प्रतिक्रिया CCR7 effector स्मृति टी lymphocytes कि एक प्रतिजन के खिलाफ जो प्रतिरक्षा प्रणाली primed किया गया है इंजेक्शन के साइट घुसपैठ द्वारा मध्यस्थता है. भड़काऊ प्रतिक्रिया और प्रतिजनी चुनौती के साइट की लालिमा और सूजन की विशेषता है. यह एक सुविधाजनक मॉडल immunosuppressants के vivo प्रभावकारिता में निर्धारित है. प्रतिजन विशेष टी lymphocytes के दत्तक हस्तांतरण या एक प्रतिजन, और दिया त्वचा के क्षेत्र में भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए प्रतिजन के साथ बाद intradermal चुनौती के साथ सक्रिय प्रतिरक्षण द्वारा Cutaneous डीटीएच भी प्रेरित कर सकते हैं. डीटीएच प्रतिक्रियाओं विभिन्न प्रतिजनों के लिए प्रेरित किया जा सकता है उदाहरण के ovalbumin, ट्यूबरकुलीन, टिटनेस toxoid, या ताली लगाने का छेद लंगड़ाहट hemocyanin के लिए. Autoantigen के खिलाफ इस तरह की प्रतिक्रियाओं भी प्रेरित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए प्रयोगात्मक MBP, एकाधिक काठिन्य (1) के लिए एक पशु मॉडल के साथ autoimmune Encephalomyelitis प्रेरित के साथ चूहों में बुनियादी प्रोटीन (MBP) myelin. यहाँ हम प्रदर्शन कैसे लुईस चूहों में एक दत्तक डीटीएच प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए. हम पहले इन विट्रो में ovalbumin विशेष टी कोशिकाओं को प्रोत्साहित करेंगे और अनुभवहीन चूहों को इन सक्रिय कोशिकाओं intraperitoneally इंजेक्षन. कोशिकाओं 2 दिनों के लिए vivo में संतुलित करने की अनुमति के बाद, हम एक कान के पंख में ovalbumin के साथ चूहों को चुनौती, जबकि दूसरे कान wil खारा प्राप्त होगा. भड़काऊ प्रतिक्रिया दिखाई 3-72 घंटे बाद हो जाएगा और कान मोटाई डीटीएच गंभीरता का एक संकेत के रूप में मापा जाएगा.

Protocol

1. Ovalbumin विशेष टी lymphocytes की उत्तेजना

आराम कर ovalbumin विशेष टी कोशिकाओं ovalbumin साथ विकिरणित लुईस प्रतिजन कोशिकाओं (APCs) के रूप में चूहे (30 Gy) thymocytes, उत्तेजना मध्यम में (DMEM + पेन / Strep / एल भरमार + NEAA RPMI + विटामिन में तैयार की उपस्थिति में प्रेरित कर रहे हैं + 2ME + चूहा + सीरम Ovalbumin अंतिम सांद्रता में, सामग्री सूची में उल्लेख किया.)

चूहा सीरम तैयारी

  1. हम चूहों हम thymus दाताओं के रूप में बलिदान से सीरम ले.
  2. चूहे halothane साँस लेना द्वारा गहरा anesthetized हैं और संभव के रूप में ज्यादा खून के रूप में हृदय छिड़काव (चूहा प्रति 5-10 मिलीलीटर) 10 मिलीलीटर सीरिंज और 23 जी एक "सुई, जिसके बाद चूहों तुरंत मौत सुनिश्चित decapitated का उपयोग द्वारा तैयार की गई है.
  3. रक्त 37 पर 10 मिनट के लिए थक्का करने की अनुमति दी है ° सी बर्फ पर 10 मिनट के द्वारा पीछा किया.
  4. थक्का हटा दिया है और शेष तरल घूमती है.
  5. सीरम एकत्र है, बाँझ फ़िल्टर और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत

प्रतिजन कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक decapitated बाँझ उपकरणों का उपयोग चूहे के thymus लो और पीबीएस युक्त पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (पीबीएस पी एस), में यह बर्फ पर जगह.
  2. एक टिशू कल्चर हुड के लिए thymus को ले लो, यह रक्त के थक्के और अन्य contaminating ऊतक से स्वच्छ और छोटे टुकड़ों में यह एक सेल (# फिशर 08-771-2) झरनी एक 10 सेमी पेट्री के 10 मिलीलीटर युक्त पकवान में रखा में कटौती पीबीएस पुनश्च.
  3. प्रत्येक टुकड़ा एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज सवार के पीछे का उपयोग कर सेल झरनी के माध्यम से दबाया जाता है. बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एकल कक्ष निलंबन लीजिए.
  4. पीबीएस - पुनश्च के 20-40 मिलीलीटर के साथ सेल झरनी कुल्ला. अपकेंद्रित्र 1250g पर निलंबन और बर्फ पर पीबीएस पुनश्च में गोली, 5 मिलीग्राम / thymus, resuspend.
  5. एक गामा irradiator में इस निलंबन (30 Gy) चमकाना और तुरंत यह 50 मिलीलीटर PBS-पी एस के साथ दो बार धोने.

    नोट: सबसे अच्छा thymus दाताओं युवा वयस्क चूहों, 5-7 सप्ताह पुराने हैं. 10 हफ्तों के लिए ऊपर चूहे पर इस्तेमाल किया जा सकता है कोशिकाओं की संख्या समय के साथ घट जाती है. लिंग महत्वपूर्ण नहीं है, हालांकि कुछ लोगों का कहना है कि पुरुषों बेहतर thymus दाताओं हैं. हम हमेशा महिलाओं का उपयोग करें, क्योंकि हमारे सभी जानवरों को एक ही कमरे में रखे जाते हैं और हम पुरुषों और महिलाओं को एक ही कमरे में नहीं करना चाहती.

उत्तेजना

  1. टी lymphocytes एक बार धोएं और उन्हें गिनती.
  2. प्रतिजन कोशिकाओं पेश की गणना करें.
  3. 3 मिक्स 10 x 6 ovalbumin विशिष्ट 150 x 10 एक 10 सेमी पेट्री पकवान युक्त उत्तेजना माध्यम के 10 मिलीलीटर में 6 APCs के साथ टी कोशिकाओं .
  4. 37 पर 48 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस

2. Ovalbumin विशेष टी lymphocytes के दत्तक हस्तांतरण

  1. चूहों हम प्राप्तकर्ताओं के रूप में उपयोग महिलाओं 7-10 सप्ताह पुराने हैं.
  2. टी lymphocytes की गणना करने के लिए, वे बड़े और गोल किया जाना चाहिए. प्रतिजन कोशिकाओं पेश मर जाएगा.
  3. अपकेंद्रित्र टी lymphocytes और उन्हें 10 10 6 कोशिकाओं / पीबीएस में मिलीलीटर एक्स पर resuspend.
  4. 1 मिलीलीटर 3 मिलीलीटर सीरिंज और 23 जी एक "सुई का उपयोग intraperitoneally इंजेक्षन.

3. प्रतिजन के साथ कान में चैलेंज

  1. दत्तक हस्तांतरण के दो दिन बाद एक दूसरे कान में कान और खारा (या अप्रासंगिक प्रतिजन) में एक 1 मिलीग्राम / एमएल ovalbumin समाधान (= प्रासंगिक प्रतिजन) के 20 μl इंजेक्षन. प्रतिजन समाधान फिल्टर के रूप में आप समुच्चय है कि भड़काऊ प्रतिक्रिया में वृद्धि को खो सकता है नहीं है.

    नोट: चूहों आंदोलनों से बचने के लिए anesthetized होना चाहिए. यदि आप दाएँ हाथ के हैं, तो अपने बाएं अंगूठे और तर्जनी, सूचकांक उंगली कान के अंदर जा रहा है और आप का सामना चूहे के बीच कान पकड़.

  2. 27G साढ़े "सुई का उपयोग करते हुए कान के पंख में समाधान इंजेक्षन सभी चूहों को एक ही जगह पर बिल्कुल इंजेक्षन करने की कोशिश करो.

4. डीटीएच के मापन

  1. कान लाल और सूजन का एक संकेत के रूप में प्रफुल्लित हो रहा शुरू कर देंगे. वसंत भरी हुई एक micrometer (उदाहरण के मॉडल MITUTOYO से पीके-0505 के लिए) के साथ एक कान की मोटाई उपाय.
  2. प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक कान के लिए 5-6 माप ले लो और औसत की गणना.
  3. अधिकतम सूजन 24 और 72 घंटे के बीच हो जाना चाहिए.

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Discussion

प्रतिजनी चुनौती अन्य साइटों पर भी प्रदर्शन कर सकते हैं उदाहरण के लिए वापस (2) त्वचा में हो. लेकिन हम है कि चुनौतीपूर्ण लगता है. कान के पंख, जैसा कि इस वीडियो में दिखाया गया है, का उपयोग डीटीएच प्रतिक्रिया का सबसे सटीक माप के लिए अनुमति देता है.

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Acknowledgments

हम GFP लेबल, ovalbumin विशेष टी सेल लाइन इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता के साथ हमें प्रदान करने के लिए धन्यवाद डा. सिकंदर Flugel (Martinsried, जर्मनी).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO, by Life Technologies 12430-062 500ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 1 mM final, in Stimulation medium
Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine Cambrex/BioWhittaker 17-718R 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium
Non essential amino acids Sigma-Aldrich R7131 NEAA, 1% final, in Stimulation Medium
RPMI vitamins Sigma-Aldrich R7256 1% final, in Stimulation medium
beta-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium
Syngeneic rat serum 1% final. See explanation in Protocol.
Ovalbumin Sigma-Aldrich A5503 10 μg/ml final, in Stimulation Medium.

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References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166-936 (2001).
  2. Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).

Comments

2 Comments

  1. Hi, Thank you very much for your protocols. Do you have any protocol describing the preperation of Ag specific T cell line (or Ag specific primary culture) from a rat?   Thank you very much in advance, Keren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 11, 2009 - 5:29 PM
  2. Hi Keren, Protocols for generating antigen-specific T cell lines from rats have been published. Basically, you need to immunize the rats with the antigen of interest in emulsion with an adjuvant (Alum, IFA, or CFA) and then collect the draining lymph nodes, isolate the mononuclear cells and stimulate them in vitro with the same antigen. Most cells will die but the antigen-specific cells will grow. Note that you will need to go through several rounds of stimulation in vitro to increase the % of antigen-specific T cells in your culture as some non-specific bystander cells will survive for some time. Here are a few references you may want to look at:     Flügel, A., M. Willem, T. Berkowicz, and H. Wekerle. 1999. Gene transfer into CD4 + T lymphocytes: Green fluorescent protein engineered, encephalitogenic T cells used to illuminate immune responses in the brain. Nature Med. 5:843–847. Ben-Nun, A., Wekerle, H., and I.R. Cohen. 1981. The rapid isolation of clonable antigen-specific T lymphocyte lines capable of mediating autoimmune encephalomyelitis. Eur. J. Immunol. 11:195-199. For immunization of rats you can look at two of my JoVE videos: Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH) in rats, J. Vis. Exp. 6, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²37&VID=²33. PMCID: PMC²557114. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis, J. Vis. Exp. 5, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²²4&VID=²14. PMCID: PMC²557091.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    March 17, 2009 - 7:18 PM

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