Induzione e Monitoraggio adottivi di ipersensibilità ritardata nei ratti

Biology

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Summary

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione infiammatoria mediata da CCR7-memoria T effettrici (TEM) linfociti. Qui mostriamo come attivare antigene-specifiche cellule TEM, inducono DTH adottivi nei ratti Lewis e monitorare la risposta infiammatoria.

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Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats. J. Vis. Exp. (8), e325, doi:10.3791/325 (2007).

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Abstract

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione infiammatoria mediata dai linfociti memoria CCR7-T effettrici che si infiltrano nel sito di iniezione di un antigene contro il quale il sistema immunitario è stato innescato. La reazione infiammatoria è caratterizzata da arrossamento e gonfiore nel sito di uno stimolo antigenico. Si tratta di un modello pratico per determinare l'efficacia in vivo di immunosoppressori. DTH cutanea può essere indotta in seguito a trasferimenti adottivo di antigene-specifica dei linfociti T o per l'immunizzazione attiva con un antigene, e la successiva sfida intradermica con l'antigene per indurre la reazione infiammatoria della pelle in una zona determinata. Risposte DTH può essere indotto a vari antigeni, per l'ovoalbumina esempio, tubercolina, tossoide tetanico, o hemocyanin patelle buco della serratura. Tali reazioni possono anche essere indotta contro autoantigene, ad esempio per proteina basica della mielina (MBP) nei ratti con encefalomielite autoimmune sperimentale indotta con MBP, un modello animale di sclerosi multipla (1). Qui mostriamo come per indurre una risposta adottiva DTH nei ratti Lewis. Per prima cosa stimolare ovalbumina specifiche cellule T in vitro e iniettare queste cellule attivate via intraperitoneale a ratti ingenuo. Dopo che permette alle cellule di equilibrare in vivo per 2 giorni, ci sarà una sfida per i topi con ovalbumina nel padiglione di un orecchio, mentre l'altro orecchio wil ricevono soluzione salina. La reazione infiammatoria sarà visibile 3-72 ore dopo l'orecchio e lo spessore sarà misurato come indice di gravità DTH.

Protocol

1. La stimolazione del ovalbumina specifici dei linfociti T

Riposo ovalbumina specifiche cellule T vengono stimolati con ovalbumina in presenza del combustibile irraggiato timociti di ratto Lewis (30 Gy) come cellule presentanti l'antigene (APC), in media stimolazione (Preparare in DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitamine + + 2ME Rat Siero + ovoalbumina, alle concentrazioni finale indicato nella lista dei materiali.)

Rat preparazione del siero

  1. Prendiamo siero dai topi ci sacrifichiamo come donatori di timo.
  2. I ratti sono profondamente anestetizzati per inalazione alotano e il sangue il più possibile è tratto da perfusione cardiaca (5-10 ml per topo) con siringhe da 10 ml e 23 G 1 "aghi, dopo di che i ratti sono immediatamente decapitati per assicurare la morte.
  3. Il sangue viene lasciato coagulare per 10 minuti a 37 ° C seguita da 10 minuti sul ghiaccio.
  4. Il coagulo viene rimosso e il liquido rimasto filate.
  5. Il siero viene raccolto, sterile, filtrata e conservati a -20 ° C.

Preparazione delle cellule presentanti l'antigene

  1. Prendete il timo di un topo decapitato con strumenti sterili e collocarlo in PBS contenente penicillina e streptomicina (PBS-PS), sul ghiaccio.
  2. Prendete il timo ad un cappuccio colture di tessuti, pulirlo da coaguli di sangue e altri tessuti contaminare e tagliarlo a piccoli pezzi in un colino cella (Fisher # 08-771-2) posto in una capsula di Petri di 10 cm contenente 10 ml di PBS- PS.
  3. Ogni pezzo viene premuto attraverso il filtro delle cellule utilizzando il retro di una sterile uno stantuffo della siringa ml. Raccogliere la sospensione singola cella in una provetta da 50 ml su ghiaccio.
  4. Sciacquare il filtro cella con 20-40 ml di più di PBS-PS. Centrifugare la sospensione a 1250g e risospendere il pellet in PBS-PS, 5 ml / timo, sul ghiaccio.
  5. Irradiare questa sospensione (30 Gy) in un irradiatore gamma e immediatamente lavare due volte con 50 ml di PBS-PS.

    Nota: I migliori donatori timo sono ratti adulti giovani, 5-7 settimane di età. Ratti fino a 10 settimane può essere utilizzato, ma il numero delle cellule diminuisce con il tempo. Genere non è importante, anche se alcune persone dicono che i maschi sono meglio i donatori timo. Usiamo sempre le femmine, perché tutti i nostri animali sono alloggiati nella stessa stanza e non vogliamo che maschi e femmine nella stessa stanza.

Stimolazione

  1. Lavare i linfociti T, una volta e contarli.
  2. Contare le cellule presentanti l'antigene.
  3. Mescolare 3 x 10 6 ovalbumina specifiche cellule T con 150 x 10 6 APC in un piatto da 10 cm di Petri contenente 10 ml di terreno stimolazione.
  4. Incubare per 48 ore a 37 ° C.

2. Trasferimento adottivo del ovalbumina specifici linfociti T

  1. I ratti che usiamo come destinatari sono femmine 7-10 settimane di vita.
  2. Contare i linfociti T, dovrebbero essere grandi e rotondi. Le cellule presentanti l'antigene sarà morto.
  3. Centrifugare i linfociti T e risospendere loro a 10 x 10 6 cellule / ml in PBS.
  4. Iniettare 1 ml per via intraperitoneale con siringhe da 3 ml e 23 G 1 "aghi.

3. Sfida con l'antigene nell'orecchio

  1. Due giorni dopo il trasferimento adottivo, iniettare 20 ml di un 1 mg / ml soluzione ovalbumina (antigene = necessario) da un orecchio e salino (o antigene irrilevante) a l'altro orecchio. Non filtrare la soluzione antigene come è possibile perdere aggregati che aumentare la reazione infiammatoria.

    Nota: I ratti devono essere anestetizzati per evitare movimenti. Se siete di mano destra, tenere l'orecchio tra il pollice sinistro e l'indice, l'indice è dentro l'orecchio e il topo rivolto verso l'alto.

  2. Iniettare la soluzione nel padiglione dell'orecchio con 27G ½ "aghi. Prova a iniettare tutti i topi esattamente nello stesso luogo.

4. Misura della DTH

  1. L'orecchio inizierà a girare rossa e gonfia come un segno di infiammazione. Misurare lo spessore di ciascun orecchio con una molla micrometro (per esempio il modello PK-0505 da Mitutoyo).
  2. Prendere 5-6 misurazioni per ciascun orecchio ad ogni time-point e calcolare la media.
  3. Il gonfiore massimo dovrebbe avvenire tra il 24 e 72 ore.

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Discussion

La sfida antigenico può essere eseguita anche in altri siti, ad esempio nella pelle della schiena (2). Noi però scoprire che impegnativo. Utilizzando il padiglione dell'orecchio, come mostrato in questo video, permette per la misurazione più precisa della reazione DTH.

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Acknowledgments

Ringraziamo il Dott. Alexander Flugel (Martinsried, Germania) per averci fornito la GFP-etichettata, ovalbumina specifica linea cellulare T utilizzati in questo protocollo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO, by Life Technologies 12430-062 500ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 1 mM final, in Stimulation medium
Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine Cambrex/BioWhittaker 17-718R 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium
Non essential amino acids Sigma-Aldrich R7131 NEAA, 1% final, in Stimulation Medium
RPMI vitamins Sigma-Aldrich R7256 1% final, in Stimulation medium
beta-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium
Syngeneic rat serum 1% final. See explanation in Protocol.
Ovalbumin Sigma-Aldrich A5503 10 μg/ml final, in Stimulation Medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166-936 (2001).
  2. Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).

Comments

2 Comments

  1. Hi, Thank you very much for your protocols. Do you have any protocol describing the preperation of Ag specific T cell line (or Ag specific primary culture) from a rat?   Thank you very much in advance, Keren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 11, 2009 - 5:29 PM
  2. Hi Keren, Protocols for generating antigen-specific T cell lines from rats have been published. Basically, you need to immunize the rats with the antigen of interest in emulsion with an adjuvant (Alum, IFA, or CFA) and then collect the draining lymph nodes, isolate the mononuclear cells and stimulate them in vitro with the same antigen. Most cells will die but the antigen-specific cells will grow. Note that you will need to go through several rounds of stimulation in vitro to increase the % of antigen-specific T cells in your culture as some non-specific bystander cells will survive for some time. Here are a few references you may want to look at:     Flügel, A., M. Willem, T. Berkowicz, and H. Wekerle. 1999. Gene transfer into CD4 + T lymphocytes: Green fluorescent protein engineered, encephalitogenic T cells used to illuminate immune responses in the brain. Nature Med. 5:843–847. Ben-Nun, A., Wekerle, H., and I.R. Cohen. 1981. The rapid isolation of clonable antigen-specific T lymphocyte lines capable of mediating autoimmune encephalomyelitis. Eur. J. Immunol. 11:195-199. For immunization of rats you can look at two of my JoVE videos: Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH) in rats, J. Vis. Exp. 6, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²37&VID=²33. PMCID: PMC²557114. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis, J. Vis. Exp. 5, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²²4&VID=²14. PMCID: PMC²557091.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    March 17, 2009 - 7:18 PM

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