高效的推导人类心脏的前体和从多能干的小分子诱导人类胚胎干细胞的心肌细胞

Biology
 

Summary

我们已经建立了诱导多能干人类胚胎干细胞与小分子物质,使推导一个人类心脏的祖细胞和心血管修复功能心肌的大量供应定义的条件下保持直接从cardioblasts协议。

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Parsons, X. H., Teng, Y. D., Parsons, J. F., Snyder, E. Y., Smotrich, D. B., Moore, D. A. Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction. J. Vis. Exp. (57), e3274, doi:10.3791/3274 (2011).

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Abstract

至目前为止,一直缺乏一个合适的人类心脏细胞来源的人类心肌再生的重大挫折,通过细胞移植或心脏组织工程1-3。心肌细胞分化成为末期出生后不久,失去增殖能力。没有证据显示,从其他来源如骨髓或脐带血来源的干/祖细胞,都能够引起收缩的心脏肌肉细胞移植到心脏 1-3 。需要再生或修复受损的心脏肌肉没有得到满足成人干细胞疗法,无论是内源性或通过细胞传递1-3。基因稳定的人类胚胎干细胞(胚胎干细胞)的无限扩张能力和无限制的可塑性,无心,听者有意 ,在体外培养的人体细胞的大量供应受到限制,以在需要的血统的推导多能干水库4,5修复和再生。由于全球心血管疾病和急性器官捐赠短缺的患病率,有浓厚的兴趣开发基于人类胚胎干细胞的疗法作为一种替代办法。然而,如何进行渠道广泛的分化潜能的多能胚胎干细胞是有效的和可预见的所需的表型的发育研究和临床翻译的一个重大挑战。依靠传统的方法多通过自发的胚层分化的多能干细胞系的倾向,造成效率低下和不可控的谱系承诺,往往是由表型异质性和不稳定性,因此,一个高风险致瘤性6-8 (见原理图图1a)。此外,未定义外国/动物生物补充和/或通常被用于隔离,扩建,和人类胚胎干细胞分化的馈线可能直接使用这种细胞的带鱼ZED移植患者问题9-11。为了克服这些障碍,我们已经解决了定义的文化系统必要和足够维持的人类胚胎干细胞的外胚层pluripotence的元素服务从头推导临床适合人类胚胎干细胞作为一个平台,有效地指导对临床相关的谱系,这样的人类胚胎干细胞均匀12小分子(在中看到的示意图 。1B )。各种小分子和生长因子的筛选后,我们发现,这些规定的条件提供足够的诱导多能胚胎干细胞,进一步发展到产生高效率的人力跳动的心肌细胞的cardioblasts 直接cardiomesoderm规范(图2烟酰胺(NAM) )。我们定义为cardioblasts多能胚胎干细胞直接诱导的条件下,不干预多系胚体阶段,从而使控制效率的推导整个基于细胞疗法的发展阶段的频谱的人体心脏细胞的大量供应。

Protocol

1。解决方案和媒体准备

  1. 明胶涂层解决方案:0.1%(W / V),蒸压在DDH 2 O的明胶和储存于4 ° C。
  2. 基质胶涂层解决方案。联合解决方案:缓慢解冻基质胶(10毫升)于4 ° C过夜,加10毫升冰冷的DMEM或DMEM/F12,拌匀等分1毫升/管消毒的组织文化引擎盖底下,储存在-20 ° C.工作液:缓慢解冻1毫升基质胶分装在4 ° C 1-2小时,转移到14毫升冷冻的DMEM或DMEM/F12,拌匀涂装前消毒的组织文化引擎盖下方。
  3. 人层粘连蛋白涂层解决方案:稀释1毫升人类层粘连蛋白溶液(0.5毫克/毫升的Tris缓冲盐,储存在-80℃,在4 ° C缓慢解冻1-2小时),用冰冷的DMEM或DMEM/F12到12.5毫升工作液(40微克/毫升)消毒的组织文化引擎盖下方紧接涂层。
  4. 生长因子库存解决方案(500 - 1000X):溶解在10微克生长因子/ ml的消毒缓冲(0.5%BSA,1.0毫米的数码地面电视,10%甘油,1XPBS)和存储50-100μL/管分装在-80 ° C
  5. HESC媒体的DMEM/F12或Ko - DMEM(80%),KO血清替代(20%),L -丙氨酰- L -谷氨酰胺和L -谷氨酰胺(2毫米),纪念不必要的氨基酸(MNAA 1X),并β-巯基乙醇(100微米),过滤和储存于4 ° C,使用前20毫微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子的补充。或更换自定义组件的“正血清替代品”的DMEM/F12或KO - DMEM(100%),L -丙氨酰- L - GLN或L -谷氨酰胺(2毫米),MNAA(1X),纪念必不可少的氨基酸(MEAA 1X),和β-巯基乙醇(100μM),过滤和储存在4 ° C,辅以碱性成纤维细胞生长因子(20毫微克/毫升),人胰岛素(20微克/毫升),抗坏血酸(50微克/毫升),人力激活素A(50毫微克/毫升),人血白蛋白/ Albumax(10毫克/毫升),和人转(8微克/毫升),使用前。
  6. HESC心脏分化媒体:DMEM/F12(90%),定义FBS(10%),L -丙氨酰- L -谷氨酰胺或L -谷氨酰胺(2毫米)。
  7. 媒体含有烟酰胺(NAM):增加N上午HESC媒体或心脏HESC分化媒体终浓度为10毫米,过滤,储存于4 ° C和使用在2周的准备。

2。板的涂层

  1. 涂层板明胶:添加2.5毫升/明胶溶液6孔板,在37 ° C培养箱孵育过夜。
  2. 涂层板与层粘连蛋白:寒意明胶涂层钢板和删除明胶,添加2.5毫升/良好的基质胶或人类的层粘连蛋白涂层工作方案预冷糊化6孔板孵育在4 ° C过夜。

3。在规定条件下未分化的人类胚胎干细胞的传代和播种

  1. 允许人类胚胎干细胞菌落生长到5-7天左右,并采取胚胎干细胞培养板,解剖显微镜(剖析阶段预温至37 ° C)下方解剖消毒罩。
  2. 选择被分裂的胚胎干细胞菌落。形态上,这些殖民地应该有> 75%的未分化的人类胚胎干细胞(SM所有紧凑型细胞),通常轻微不透明(不白堆砌的细胞,不明确的分化细胞)定义解剖显微镜底下的边缘。小心地勾勒出选定的殖民地和删除分化成纤维细胞层周围的殖民地和所有有区别的部分(如果任何殖民地)与P2的无菌枪头边缘拉玻璃毛细管。
  3. 取下吸浮动分离分化的细胞含有的旧媒体。人类胚胎干细胞介质(无碱性成纤维细胞生长因子),一次洗干净。加入3毫升/以及含有20 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子的新鲜胚胎干细胞媒体。
  4. 切成小块的未分化的胚胎干细胞菌落,用无菌枪头或拉玻璃毛细管和分离。
  5. 池媒体中含有50毫升的锥形管分离的殖民地拼凑。洗板一次1毫升/人类胚胎干细胞以及媒体含有20毫微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子和池一起。
  6. 吸新鲜的涂层板的基质胶或人类的层粘连蛋白溶液。分装4毫升/ hESC媒体包含殖民地件到6孔板。轻轻板转移到孵化器,无晃动,让殖民地件的种子没有令人不安的气氛中5%的CO 2,饱和湿度37℃培养箱过夜。

4。心脏的胚胎干细胞的诱导下的定义与烟文化体系

  1. 在播种后第3天,从每个板块以及删除最旧的媒体和留下足够的媒体,让人类胚胎干细胞的殖民地被淹没(决不允许人类胚胎干细胞向干出)。更换4毫升/新鲜胚胎干细胞含有20 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和10毫米烟酰胺(NAM)的媒体。
  2. 与新鲜胚胎干细胞含有20 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和10毫米南隔日媒体替换旧媒体,并允许心脏诱导的人类胚胎干细胞殖民地成长为每天8-10。暴露在不结盟运动,殖民地内的所有细胞将发生大分化的细胞,继续繁殖的形态变化。殖民地将扩大规模,并每天8-10,D细胞就会开始堆积在一些地区的殖民地。

5。悬浮培养持续心脏分化

  1. 以人类胚胎干细胞培养板解剖显微镜消毒罩下面剖析(剖析阶段预温至37 ° C)。小心地勾勒出殖民地和成纤维细胞层周围的殖民地(分化的细胞迁移的殖民地)与P2的无菌枪头边缘删除或拉玻璃毛细管。
  2. 取下吸浮动分离的成纤维细胞中含有的旧媒体。人类胚胎干细胞介质(无碱性成纤维细胞生长因子),一次洗干净。加入3毫升/以及新鲜的人类胚胎干细胞介质(无碱性成纤维细胞生长因子)。
  3. 切成小块的心脏诱导人类胚胎干细胞集落,并用无菌枪头或拉玻璃毛细管分离。
  4. 池媒体中含有50毫升的锥形管分离的殖民地拼凑。洗板一次1毫升/以及人类胚胎干细胞介质(无碱性成纤维细胞生长因子)和汇集。
  5. 分装4米L /以及无血清胚胎干细胞媒体殖民地件含有6以及超低附件板和孵化在37 ° C培养箱允许浮动(cardioblasts)蜂窝集群,形成4-5天。

6。跳动的心肌细胞表型胶粘剂文化成熟

  1. 池媒体一起包含在一个50毫升的锥形管的浮动cardioblasts。在5分钟1400转的离心机。吸的,你可以多旧媒体,并加入等量的新鲜胚胎干细胞的心肌分化含10 mM的不结盟运动的媒体。
  2. 移液器上下混合浮动cardioblasts和等分4毫升/ 6孔板。板块转移到了37 °彗星培养箱允许cardioblasts附加过夜。
  3. 更换心脏胚胎干细胞分化的介质含有10毫米不结盟运动隔日。
  4. 在第8天,没有不结盟运动的心脏与人类胚胎干细胞分化的媒体取代,并继续以取代心脏HESC分化媒体发送很其他的一天。跳动的心肌细胞就会开始出现在连续种植约1-2周后退出不结盟运动,并随着时间的数字增加,并可以保留3个月以上的强烈而有节奏的收缩。

7。代表性的成果:

烟酰胺(NAM)呈现足以引起人类胚胎干细胞保持在定义的文化体系,从多能性完全过渡到cardiomesodermal表型图2B)。不结盟运动的未分化的人类胚胎干细胞的暴露后,殖民地内的所有细胞发生形态的变化,大分化的细胞,下调Oct - 4的表达,并开始表达心脏特异性转录因子(CSX)Nkx2.5和α-辅,与cardiomesoderm表型( 图2B)一致。这些分化的细胞,继续繁殖和殖民地的大小增加。 Nkx2.5强度增加通常观察到的细胞开始堆积( 图2B)的殖民地地区。后不结盟运动处理的胚胎干细胞的分离,将形成一个悬浮培养浮动蜂窝集群(cardioblasts),继续心脏的分化过程。允许cardioblasts重视和继续与不结盟运动治疗1周后,将开始跳动的心肌细胞出现约1-2周连续种植了效率的大幅增加后,退出不结盟运动相比,自发的多系分化人类胚胎干细胞治疗不超过同一时期( 图2C)。跳动的心肌细胞簇内的细胞会表达标记心肌细胞的特性,包括Nkx2.5和α-辅肌动蛋白( 2C )。跳动的心肌细胞的收缩确认电气型材强,有节奏,以及协调,夹带与回忆的P经常冲动,- QRS - T复合物临床心电图体表电极( 图2C,也见视频)。心肌细胞可保留3个月以上的强烈收缩。

图1
图1。常规方法与小分子诱导方法对人类多能干专门的功能细胞的干细胞分化的总体计划。 (A)常规方法使用通过自发的胚层分化的人类多能干细胞的多系倾向示意图。 (B)原理控制的高效诱导人类多能干细胞专门为特定的临床相关的宗族提供简单的小分子。

图2
图2烟诱导多能性心脏谱系在规定条件下的规范和对跳动的心肌细胞进展直接(一)原理图,描绘了心脏的胚胎干细胞定向分化的协议的时间线。 (b)在未分化的人类胚胎干细胞暴露于烟酰胺(NAM)下定义的文化系统,大的区别的10月4(红色)阴性细胞内的殖民地开始出现,相比模拟处理(DMSO)为控制人类胚胎干细胞。南诱导10月4负的细胞开始表达Nkx2.5(绿色)和α-辅肌动蛋白(红色),与早期心脏分化相一致。 Nkx2.5强度逐渐增加,通常在殖民地的细胞开始堆积的地方观察。所有的细胞都表示其原子核的DAPI染色(蓝色)。 三)南诱导心脏致力于人类胚胎干细胞产生与效率的大幅增加跳动的心肌细胞,细胞簇评估器显示的节律性收缩(见电剖面和视频),Nkx2.5(绿色)和α-辅肌动蛋白(红色)免疫阳性。承包心肌代表的代表大跳动的心肌细胞集群和更高功率的图像相图像显示(还可以看到相应的视频)。箭头指示的大跳动的心肌细胞集群电生理记录。跳动的心肌细胞电生理剖面显示定期,夹带,让人联想到在临床心电图的P - QRS - T复合物有节奏的冲动。比例尺:0.1毫米。

视频:从南诱导人类胚胎干细胞分化的心肌细胞视频1和2显示代表约1个月和3个月大的跳动心肌细胞簇后附件。视频3和4代表,承包心脏肌肉在更高的功率。视频5显示了一个typica升小跳动的心肌细胞群自发地分化从胚胎干细胞没有不结盟运动作为治疗控制。

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Discussion

的发育研究和临床翻译的重大挑战之一是如何进行渠道广泛的分化潜能的多能干的人类干细胞所需的表型,高效和可预见的的。虽然这种细胞可以自发地在体外分化成胚层细胞通过多血统的聚合阶段,人类胚胎干细胞衍生的多系聚合(胚体),只有一个非常小的一部分细胞(<2 %)自发分化成心肌13-15( 图1A)。继免疫选择,心肌细胞丰富的人口能够作为生物起搏器的功能来抢救损坏的心肌功能,机械和电子注入动物模型的心脏13。在啮齿动物的心肌梗死模型,嫁接人类胚胎干细胞衍生的心肌后代能够生存和成熟的长达12周,部分remuscularIZE受伤的心脏,并改善收缩功能 14,15 。然而,通过多系分化多能干细胞,移植后的致瘤性的高风险的人类心脏承诺细胞中产生的低效率,阻碍了进一步的临床翻译。渠道广泛的多能胚胎干细胞分化潜能,完全可预见的心脏表型的发展战略是利用人类胚胎干细胞生物学在心脏领域的力量至关重要。为了实现统一的一个特定的血统的人类多能干细胞的转换,我们雇用了一个定义文化系统有能力投保未分化的人类胚胎干细胞的增殖完全确定条件,以及控制多能胚胎干细胞的有效诱导到一个特定的临床相关的谱系提供简单的小分子( 图1B)。我们发现,烟从P直接诱发心系承诺根据定义文化luripotent的人类胚胎干细胞,进一步发展到与高效率( 图2)跳动心肌细胞。 Nkx2.5是正常的心脏发育的基因突变是必不可少的一个进化保守的同源盒转录因子与人类先天性心脏疾病(CHD)的,人类最常见的出生缺陷16。 Nkx2.5表达到目前为止,检查所有脊椎动物最早是心脏前体细胞的标志和必要的适当的心脏septation和形成/成熟的电气传导系统16。在脊椎动物中,发病早期Nkx2.5表达模式大致配合的时间和面积在早期胚胎的心脏规范,Nkx2.5基因继续通过发展中的心脏 16表示。在我们的人类胚胎干细胞模型,不结盟运动的出现引发心脏诱导多能性胚胎干细胞直接促进的心肌特异性transcri表达ption因子Nkx2.5,一个过程,可能会效仿从人类胚胎cardiogenesis的多能干外胚层cardiomesoderm规范。未来的研究将揭示人类心脏发育的遗传和表观遗传控制分子作为替代品,可能为人类胚胎干细胞多能性的命运的小分子介导的直接控制和调制方式时所产生再生疗法的临床相关的谱系。没有不结盟运动治疗,<2%的人类胚胎干细胞进行自发分化成跳动的心肌细胞 12-15 。不结盟运动治疗,我们已经能够产生大于95%的胚胎的心脏前体跳动的心肌细胞> 50%,并从下一个定义文化的人类胚胎干细胞保持在一个过程,可能会仿效人类胚胎心脏发育12。近日,已知的心脏命运决定基因已被用于transdifferentiate产后击败了<0.5%17,18的低效率的心肌细胞的小鼠成纤维细胞</ SUP>。不过,体细胞重新编程历史上一直与基因表达异常加速衰老和受损的治疗公用事业 19-21 。最后,我们在这里建立的协议是有限的多能胚胎干细胞内细胞团(ICM)或人类囊胚4,5的外胚层衍生,可能并不适用于其他的多能干细胞,包括动物起源的胚胎干细胞,胚胎干细胞从早期的桑椹胚的(8细胞)胚胎阶段的22日23人为地重新编程的细胞。

Disclosures

作者声明竞争的利益。 XHP是Xcelthera创始人。 XHP和余仁生有关人类胚胎干细胞的知识产权。

Acknowledgments

XHP一直支持由国家卫生研究院(NIH)国家老龄问题研究所(NIHK01AG024496)和尤尼斯肯尼施莱佛国立儿童健康和人类发展研究所(NIHR21HD056530)的赠款。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Matrigel BD Biosciences 356231 Growth factor reduced
Human laminin Sigma-Aldrich L6274
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
DMEM/F12 Invitrogen 10565042
DMEM Invitrogen 31053036
DMEM-KO Invitrogen 10829018
Knock-out serum replacement Invitrogen 10828028
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) Invitrogen 11140050
MEM amino acids solution(MEAA, 100X) Invitrogen 11130050
β-Mercapt–thanol Invitrogen 21985023
Albumax Invitrogen 11020021
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human transferrin Sigma-Aldrich T8158
Human bFGF PeproTech Inc AF-100-18B
Human insulin Invitrogen 12585014
Human activin A PeproTech Inc 120-14E
Defined FBS Hyclone SH30073-03
6-well ultralow attachment plate Corning 3471
6-well plate Corning 3516

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References

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Comments

1 Comment

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    I participated running exercise at ITRI, I fall down, I saw my
    mother, She told me " It is not the time for you to come here,
    go back!" I also saw my brother in law, two uncles, and
    grandma! Few days later, I was moved to major hospital at Taipei!
    One night, I waked up, and knell down against the window,
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    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2011 - 11:43 AM

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