Single Cell transkriptionell Profilering av Vuxen mus Cardiomyocytes

Published 12/28/2011
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Enda cell expression profiling gör en detaljerad analys genuttryck av enskilda celler. Vi beskriver metoder för isolering av cardiomyocytes och förbereda den resulterande lysates för antingen hela transkriptom microarray eller qPCR av specifika mål.

Cite this Article

Copy Citation

Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), e3302, doi:10.3791/3302 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Medan många studier har undersökt förändringar genuttryck från homogenat av hjärtvävnad, förhindrar att studera den inneboende stokastiska variationen mellan celler i en vävnad. Isolering av ren cardiomyocyte befolkningar genom en kollagenas perfusion av mus-hjärtan underlättar generations enda cell microarrays för hela transkriptom genuttryck, eller qPCR av specifika mål med hjälp av nanofluidic matriser. Vi beskriver här ett förfarande för att undersöka en enda cell genuttrycksprofilerna av cardiomyocytes isolerade från hjärtat. Detta paradigm möjliggör utvärdering av mätetal av intresse som inte är beroende av medelvärdet (till exempel skillnader mellan celler i en vävnad) vilket inte är möjligt vid användning av konventionella hela vävnad arbetsflöden för utvärdering av genuttryck (Figur 1). Vi har uppnått stark förstärkning av den inre ger cellen transkriptom mikrogram dubbelsträngad cDNA som underlättar användningen av microarrays om jagndividual celler. I det förfarande som vi beskriver användningen av NimbleGen matriser som valdes för sin användarvänlighet och förmåga att anpassa sin design. Alternativt kan ett omvänt transkriptas - låter specifikt mål förstärkning (RT-STA) reaktion, för qPCR av hundratals mål senast nanofluidic PCR. Med någon av dessa metoder är det möjligt att undersöka variationer i uttrycket mellan celler, samt att undersöka uttryck profiler av sällsynta celltyper inifrån en vävnad. Sammantaget gör det enda cell genexpression metod för generering av data som potentiellt kan identifiera idiosynkratiska uttryck profiler som normalt genomsnitt ut när undersöka uttryck av miljontals celler från typiska homogenat genereras från hela vävnader.

Protocol

1. Steg 1 - Cardiomyocyte isolering

  1. Förbered matsmältningen buffert enligt följande:
    10 x Digestion Buffer (görs i ultrarent H 2 O)
    Final Konc. g / L g/500 ml 10x lösning g / L
    NaCl 130 mm 7,597 3,3 75,97
    KCl 5 mM 0,4 0,2 4,0
    Pyrodruvsyra 3 Nm 0,33 0,165 3,30
    HEPES 25 mM 5,96 2,85 59,6
    MgCl 2 0,5 mM 0,101 0,05 1,01
    NaH 2PO 4monobasic 0,33 mm 0,04 0,02 0,40
    Dextros 22 mm 3,96 1,98 39,6

    pH-buffert till 7,4 med NaOH
  2. Använda 10x Digestion Buffer, gör följande fyra lösningar för varje hjärta som kommer att perfusion (gjord i ultra-rent H 2 O):

Digestion buffert A (Gör tre portioner av detta lösningar)

  • 50 ml - 1x Matsmältning buffert som innehåller:
    • 75 mikroliter - EGTA lösning (100 mM EGTA)

Digestion buffert B (Gör en av dessa)

  • 25 ml - 1x Matsmältning buffert som innehåller:
    • 1,25 mikroliter - CaCl 2 Lösning (1 m)
    • 1 mg - Protease
    • 25 mg - kollagenas (can även använda 75% av detta belopp = 18,75 mg) **

Insamling Buffer (Går att en av dessa)

  • 2,5 ml - 1x Matsmältning buffert som innehåller:
    • 1,25 mikroliter - CaCl 2 Lösning (1 m)
    • 0,5 mg - Protease
    • 15 mg - kollagenas (75% = 11,25 mg) **
    • 125 mg - BSA

Neutralisering Tvättbuffert (Går att en av dessa)

  • 25 ml - 1x Matsmältning buffert som innehåller:
    • 6,25 mikroliter - CaCl 2 Lösning (1 m)
    • 250 mg BSA

** Beroende på källan och parti kollagenas kan enzymaktiviteten variera. Det kan vara nödvändigt för att optimera den mängd enzym läggas till denna buffert för att förhindra över-matsmältningen.

  1. Ställ in den isolering system som beskrivits tidigare i Detail 1,2 med tre 15 ml bägare av Digestion buffert A på isen, en 50 ml tub Digestion buffert A och 25 ml Digestion buffert B redo för perfusion (Digestion Buffer A skall spolas genom linjen, på minst 5 ml gå igenom systemet), värmde Insamling buffert i ett vattenbad för att höja temperaturen till 37 ° C, och neutraliseringen tvättbufferten vid RT.
  2. Fyll perfusion kanylen och dissektion maträtt där hjärtat kommer att rengöras och band på perfusionen spetsen med kallt Digestion buffert A. löst knut några suturer (4-O till 6-O storlek) runt den övre delen av kanylen. Detta kommer senare att användas för att hålla stora kroppspulsådern för att förhindra att hjärtat glider av kanylen.
  3. Terminalt stillsam musen med en IP injektion av bedövningsmedel (0,25 ml natriumklorid Pentobarbital lösning) och se till att musen är medvetslös och okänslig för smärta stimuli. Skär öppna brösthålan försiktigt längs bröstkorg marginalen genom att skära membranet(Figur 2). Skär fint uppåt och återspeglar den främre bröstkorgen (Dessa snitt betecknas B och A, respektive i figur 2) Kritisk -. Musen måste fortfarande andas före dessa snitt.
  4. Med hjälp av en plastpipetten skära till, försiktigt suga hjärtat i pipetten. Skär hjärtat ur brösthålan var noga med att lämna tillräckligt av aorta på hjärtat att tydligt identifiera kroppspulsådern gren (Figur 3). En pipett används eftersom det orsakar minimal skada på hjärtat.
  5. Släpp hjärtat i en bägare med iskall Digestion buffert A och skölj blod bort. Efter 15 till 45 sekunder plats mitt i den andra bägaren av iskall Digestion Buffert A till kort spola igen. Överför hjärtat i petriskål också fylld med kallt Digestion buffert A.
  6. Visa hjärta i skålen för matsmältningen Buffer A under dissektion omfattning och försiktigt isolera aorta och dess filialer. Trimma försiktigt bara underlägsen den sista branch (Figur 4).
  7. Montera kanyl spetsen i aorta och ligate på plats med 4-O till 6-O sutur med scenen installationsprogrammet under en dissektion mikroskop. Se till att kanylen inte sitter för lågt i aorta och förblir ovanför hjärtats kranskärl (Figur 4).
  8. Med matsmältningen Buffert A flyter genom perfusion setup, placera perfusionen tips på setup, och börja BEGJUTA hjärtat tills majoriteten av blod tvättas bort från hjärtat och vätska som lämnar hjärtat är tydlig. Kritisk - temperaturen på perfusionen vätskan måste vara så nära som möjligt till 37 ° C när det kommer ut av katetern. Om lösningen är för varmt eller för kallt då perfusionen kommer att döda vävnaden. Tiden fram perfusion av hjärtat är också kritisk. Tidsfönstret måste vara mindre än 5-10 min från Avlägsnandet av hjärta tills perfusion börjar. Hjärtat måste tas bort under bedövning, inte CO 2 stämpling eller halsdislokation.
  9. När blodet varhed från hjärtat, byt till Digestion Buffer B från matsmältningen Buffer A. Se till att matsmältningen buffert B nu flödar genom hjärtat. Lösningen kommer att börja få en gul nyans. Vänta 2-3 min tills hjärtat visar tecken på att tappa sin form och börjar se runda vilket är en indikation på att matsmältningen fungerar. Hjärtmuskeln ska visas ljusare som perfusion vinning.
  10. Klipp av ventriklarna av med sax och lägg i ett 50 ml koniskt rör som innehåller 15 ml Insamling buffert vid 37 ° C. Försiktigt skära kammare i små bitar medan placera vävnaden i samlingen Buffer. Blanda försiktigt med en plast pipett för att lösa upp cell-cell adherenser och göra en enda blandning cell cardiomyocyte.
  11. När de flesta av vävnaden är upplöst, (mindre än 1 min) låter större vävnaden bitarna sjunka till botten. Ta bort och spara supernatanten till ett 15 ml koniskt rör. Låt gravitationen drar ett pellets från supernatanten över 10 till 20 min (15min föredra) vid rumstemperatur.
  12. Avlägsna och kassera supernatanten. Tvätta pelleten genom att tillsätta 5 ml av Neutralisering tvättbuffert pelleten och blanda försiktigt cellerna att resuspendera dem. Vid denna punkt cellerna är omedelbart redo att väljas för en enda cell analys (gå vidare till steg 2).

2. Steg 2 - Isolering av enskilda celler

  1. Förbered en mikromanipulator med hjälp av en låga och ett glas kapillärrör som kommer att användas för att manipulera celler. Den mikromanipulator är helt enkelt en mycket fin kapillärrör som sedan är kopplad till en lång bit av slangar som kan flytta eller plocka upp celler sug tillämpas.
  2. Omedelbart vidare till val av enskilda celler i mikroskop (Nikon Eclipse TS100, 20x) med en mikromanipulator som skapades med en drog pipett och en luftsluss för att förhindra att material från att överföras till det samlade cellprover prov. Se till att cellen befolkningen är frisk(70% livskraftiga) och inte skadade från isoleringen processen.
  3. Späd cellerna i en liten petriskål så att de kan väljas individuellt. När plocka celler vara säker på att fånga cellerna i en liten volym (mindre än 2 mikroliter). Markera bara friska celler som har distinkta normala cardiomyocyte morfologi (Figur 5).
  4. Placera enskilda celler i botten av enskilda PCR-rör och frysa dem omedelbart på torr-is. Dessa celler är sedan förvaras vid -80 ° C tills de ska användas för genuttryck analys.

3. Steg 3A - Single cell qPCR genuttryck

För att utföra qPCR på enskilda celler använder ett protokoll som anpassats från ett utvecklat för enskild cell genuttrycket Fluidigm Corporation för deras Biomark nanofluidic qPCR kedjor (Fluidigm - Advance Development Protocol # 30) 3,4.

  1. Förbereda omvänd transkription - Specifik amplifiering (RT-STA). Att varagin, resuspendera alla primerpar (vi har använt upp till 125 primerpar framgångsrikt) för gener av intresse vid 100 nm i 1x DNA fjädring buffert (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA). Kombinera och späd ytterligare framåt och bakåt primerpar till 20 mikroM för varje analys. Slutligen, späd alla primerpar till en lösning med en slutlig koncentration av 200 nm för varje analys som kommer att förstärkas i RT-STA reaktion. För att göra detta, ta varje primer par och späda ut dem 1:100. Till exempel, om du har 30 par test primer vid 20 mikroM, måste du lägga till 1 mikroliter i varje par (30 mikroliter totalt) och fyll sedan resten av volymen med 70 mikroliter av DNA fjädring buffert att nå den slutliga spädningsvolymen av 100 mikroliter.
  2. Nu när primern lösningarna bereds, montera RT-STA mix reaktion mästare. Förbered tillräckligt Master Mix för varje enskilda celler du vill förstärka.
    Reagens Volym i mikroliter (per reaktion)
    CellsDirect 2x reaktionsblandning 5,0
    Upphöjd III RT Plantinum Taq mix 0,2
    RT-STA primermix (200 nM varje analys) 2,5
    Nukleasfritt Gratis H 2 O (eller 1x DNA fjädring buffert) 1,3
    Totalt 9,0
    Tabell 1. RT-STA Master Mix
  3. Omedelbart ta bort frusna celler och centrifugera vid maximal RCF i 30 sekunder för att säkerställa att cellerna är placerade i botten av röret. Tillsätt 9 mikroliter av RT-STA mix till röret och vidare till reaktion i en termocykler.
    1. 50 ° C - 15 minuter
    2. 95 ° C - 2 minuter
    3. 18 cykler av
      1. 95 ° C i 15 sekunder
      2. 60° C i 4 minuter
    4. Håll vid 4 ° C
  4. Ta bort rören från PCR-maskin och tillsätt 4 mikroliter av ExoSAP-IT för att reaktionen. ExoSAP-IT är en PCR-sanering reagens som kommer att avlägsna överskott av primers och enzymet från RT-STA reaktion. Kör rören genom följande reaktion i en PCR-maskin.
    1. 37 ° C - 15 minuter
    2. 80 ° C - 15 minuter
    3. Håll vid 4 ° C
  5. När ExoSAP-IT-behandlingen är klar, späd proverna 1:05 med DNA fjädring buffert. Proverna är nu förberedda för qPCR analys. Vi använder detta material i samband med Fluidigm s qPCR Gene expression Arrays (48,48 eller 96,96 plåtar). Det är också möjligt att använda denna metod med mer traditionella qPCR instrument (96 bra eller 384 bra format). Men dessa instrument kräver normalt betydligt fler prov ingång som begränsar antalet analyser som kan performed från en enda cell.

3. Steg 3b - Hela transkriptom förstärkning och microarray av enskilda celler

Extraktion och förstärkning

  1. Använd Sigmas WTA2 kit (Cat # WTA2) för att förstärka dubbelsträngad cDNA från både pellets och enstaka celler. Enstaka celler "extraherade" via det första steget i Sigmas WTA2 protokoll enligt tillverkarens anvisningar. Under detta första steg inkubering med biblioteket syntes buffert vid 37 ° C i 5 minuter stör membranet i enskilda celler och "extrakt" meddelandet för förstärkning.
  2. Förstärk enskilda celler i två omgångar, med hjälp av anvisningar från Sigma-Aldrich är WTA2 kit. Utför steg biblioteket prep enligt tillverkarens protokollet, lägg sedan till 1 / 5 av biblioteket prov till 70 mikroliter av WTA2 förstärkning
    Master Mix. Förstärka prover för 25 cykler med den rekommenderade cykling parametrar.
  3. Rena prover USIng Qiagens QIAquick PCR Purification Kit (Cat # 28.104) och processen på Qiagens Qiacube använda "Cleanup QIAquick PCR amplifieringsreaktionerna Standard V4" protokoll.
  4. Koncentrera det renade prover till 5 mikroliter, med en hastighet vakuum, och genomgår en andra omgång av förstärkning för 17 cykler (WTA2 förstärkning protokoll och parametrar cykel upprepas).
  5. Rena prover med QIAquick PCR Purification Kit och kontrollera kvaliteten med hjälp av en NanoDrop spektrofotometer och Agilents BioAnalyzer DNA-7500 kit enligt leverantörsspecifika protokoll.

Märkning och NimbleGen Gene Arrays Expression

  1. Etikett 2 mikrogram dubbelsträngad cDNA från varje amplifieras cellprov med NimbleGen One Kit Color märkning (katt # 05223555001) enligt tillverkarens protokollet.
  2. Hybridisera 5 mikrogram Cy3 märkt prov till Mus musculus 12x135k, NimbleGen Gene Expression Arrays (Cat # 05543797001) enlOrding tillverkarens protokoll. Efter hybridisering av proverna till matriser bör glider sedan tvättas och torkas innan de kan avbildas på en laserscanner.
  3. Scan Gene Expression Arrays med en laserscanner. Här använder vi ett Molecular Devices GenePix 4200A Skanner med inställningar av 100POW och 300-350PMT. Sedan generera paret filer för varje array med hjälp NimbleGen är NimbleScan mjukvara och därefter analysera hela transkriptom uttryck från varje enskild cell array (en tabell över typiska stabilt uttryckt cardiomyocyte avskrifter ingår som ett komplement, tabell S1).

Om hjärtat perfusionen fungerat bra bör det finnas en hög andel av friska hjärtceller som har kvar sin typiska rektangulär morfologi vid isolering. Om perfusionen inte vidare bra då blir det en stor andel av döda celler (se bilder i Figur 5). Om cellerna är korrekt förstärks med antingen WTA2 eller RT-STA metoder somn slutprodukten ska passera efterföljande tester kvalitetskontroll för kvaliteten på mRNA-prover genom NanoDrop och BioAnalyser (Figur 6). För microarray arbetsflödet är detta avslutas efter WTA förstärkning där mRNA är testad av både NanoDrop och Bioanalyzer. Representant positiva resultat för denna analys visas i Figur 6. Den WTA2 proverna ska visa en robust förstärkning med både NanoDrop spektrofotometer läsning, liksom electropherogram avläsning från Bioanalyzer (BA) chip (Figur 6). En tabell av gener som stabilt upptäckts via microarray av enstaka celler ingår som ett exempel (tabell S1). För qPCR processen, kan kvaliteten på de data bedömas genom att utföra en smälta steg i slutet av PCR-reaktionen att se till att primern uppsättningar förstärka den önskade produkten (Figur 7). Om det stämmer bör detta smälta steg generera en viss smälta topp. För att illustrera denna punkt, är en delmängd av nanofluidic qPCR data som visas i en heatmap av topp smälter temperature (Figur 8) 8. Det är möjligt att bedöma kvaliteten på en PCR-produkt av sin smälta temperatur för att säkerställa avsaknaden av icke-specifika produkter 5. Varje rad i den här kartan är ett cellprov (S1-S40) testas i 43 separata qPCR analyser (A1-A43). I denna siffra är det tydligt att vissa analyser är ganska varierande och är troligen mindre tillförlitliga än de mer stabila analyser med högre PCR specificitet.

Figur 1
Figur 1. Översikt över enskild cell isolering och genuttryck analys. Förfarandet kommer att visa kirurgiskt avlägsnande av musen hjärta och isolering av enskilda cardiomyocytes. De metoder som diskuteras i denna innefattar metoder för antingen qPCR eller microarray analys efter hela transkriptom förstärkning (WTA). WTA inleds med lys (A) då bindningen av Sigmas universella primers (B) till mRNApool. Förlängningen av dessa grundfärger (C) och förstärkning (D) fas skapa mikrogram förstärkt material. Denna förstärkning är sedan upprepas (E) för att generera tillräckligt med material för microarray förfarande.

Figur 2
Figur 2. Representation av platsen för snitt för att ta bort hjärtat från musen. Klipp längs den laterala väggen i bröstkorgen (A), klipp längs sämre marginal av bröstkorgen (B). Kapning av fartyg över och under hjärtat tillåter borttagning och samtidigt lämnar tillräckligt av aorta till cannulate hjärtat. Bilder anpassas från MJ Cook 6.

Figur 3
Figur 3. Schema över bröstkorgen på musen. De streckade linjerna visar de platser i snitt (A) för excising hjärtat ur brösthålan utan att skada h eart vävnad. Bilder anpassas från MJ Cook 6.

Figur 4
Figur 4. Bild av aortabågen och dess grenar. Den grå linjen visar den idealiska platsen där att trimma aorta (A). De resterande aorta knuten till hjärtat är kanylerade så att spetsen på kanyl (B) går till lämplig nivå inom aorta (C). Bilder anpassas från F. Gaillard 7.

Figur 5
Figur 5. Val av enstaka celler för genuttryck analys. Varje panel visar cardiomyocytes avbildas under ljusmikroskop visar typiska morfologi av cardiomyocytes. Friska cardiomyocytes indikeras med de gröna pilarna. Celler som är döda eller döende visas med röda pilar. Dessa döda celler bör inte användas i analysen.

iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg "alt =" Figur 6 "/>
Figur 6. Kvalitetskontroll WTA resultat för enskild cell förstärkning. (A) Bild på ett NanoDrop spektrofotometer avläsning som är lämplig för det förstärkta avskrifter från WTA reaktion. (B) avläsningen från BioAnalyzer chip visar resultaten från tre förstärkta celler.

Figur 7
Figur 7. QPCR förstärkning kurvor (vänster diagram) och maximal smälta temperaturkurvor (höger diagram). (A) Uttrycket resultat från en kvalitets-analys visas med en enda smälta topp trots olika förstärkning kurvor. (B) Smält kurvor för en fattig primer uppsättning, som har mycket varierande smälta toppar som inte är idealiskt för uttryck analys.

Figur 8
Figur 8. Kvalitetskontroll resultat för enskild cell qPCR reagerarjoner. Denna värme karta skapades för att visa smälta temperaturer som en färgskala. Den högsta smälttemperatur för varje qPCR analys (A1-A43) visas för 40 enskilda celler (S1-40). Analyserna var grupperade enligt deras smälter temperatur. Genom att titta ner i kolumnen för varje analys är det möjligt att se variationen smälta i alla prover. Denna siffra visar att några qPCR analyser är mycket specifika medan andra är mycket varierande och därför inte är lämpliga för enskild cell analys.

Tabell S1. Kompletterande tabell med microarray-data. Dessa gener är listade enligt den robusthet som de upptäcks i singel cardiomyocytes över ett stort dataset. Denna gen förteckningen anges känsligheten för upptäckt ett antal gener som normalt uttrycks i samma cardiomyocytes.

Discussion

Denna metod har möjlighet att generera cardiomyocytes för ett antal funktionella samt gener studier uttryck. Granskningen av enskilda celler är en spirande område i genuttryck analys. Fördelen med att undersöka transkriptionella nivåer på samma nivå som den enda cell är att det tillåter en undersökning av en ren cell befolkning, vilket inte är möjligt från hela vävnaden förberedelser. Dessutom ger en enda cell analys för granskning av stokastiska variationen av mRNA nivåer i enskilda celler att definiera cellpopulationer som tidigare ansågs vara homogen 8,9. Förutom att identifiera gener som är potentiellt stokastiska i deras genuttryck 10,11,12, kan metoden även för identifiering av sällsynta cellpopulationer definieras av sina profiler genuttryck.

Även om denna metod ger ett antal spännande potentiella användningsområden i genuttryck analys, det finns SOM-e varningar och överväganden i användningen av enskilda celler. Den främsta begränsningen till enskild cell analys, är att samla in tillräckligt många celler i försöket att uppnå statistisk signifikans när det gäller det metriska av intresse, till exempel varians. I de fall där antalet celler som isolerats från vävnaden av intresse är inte en begränsning, kan man undersöka hundratals celler per grupp, med hjälp av metoder såsom nästa generations sekvensering eller nanofluidic matriser. Men i vissa fall kan det vara svårt att få tillräcklig celler från vävnaden av intresse. Detta kan delvis bero på idiosynkratiska tidsödande förfaranden för insamling av de riktade celltyp. Kan dock noggrann planering och förberedelse innan du fortsätter med en enda cell samling kan fortfarande rigorös enskild cell analys med begränsat tekniskt fel. När man granskar resultaten måste beaktas, att även om detta förfarande för att isolera celler har använts i många Studies (inklusive mikroskopi, elektrofysiologi, etc.), kan isoleringen i sig effekten potentiellt genuttryck. Som med alla metod som manipulerar biologiska prover, bör resultaten av dina fynd noga valideras för att säkerställa en enda cell uttrycket är representativt för den vävnad i sig och inte tekniska bias. Metoder såsom in situ hybridisering kan vara användbar för att verifiera dessa resultat i den intakta vävnaden. Slutligen är det viktigt att säkerställa att de data som genereras noggrant kontrolleras för kvalitetskontroll. De data som visas i figur 8 visar att qPCR tester kan vara mycket robust i sin specificitet, såsom analys # 13 (A13) eller ha en hög grad av variation som kan leda till tekniska varians som analysen # 34 (A34).

Acknowledgements

Författarna vill tacka för det tekniska bistånd av C. Zambataro under inspelningen av detta protokoll. Vi erkänner tacksamt stöd av Glenn Stiftelsen för medicinsk forskning (SM), The Hillblom Foundation och National Institutes of Health för en Nathan Shock Center Award (P30AG025708) och PO1AG025901. JMF stöddes av T32AG000266 tilldelas Buck institutet för forskning om åldrande.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich 71378
KCl Sigma-Aldrich 60128
Pyruvic Acid Sigma-Aldrich P4562
Hepes Sigma-Aldrich 54457
MgCl2 Sigma-Aldrich M1020
NaH2PO4 monobasic Sigma-Aldrich P9791
Dextrose Sigma-Aldrich G6721
NaOH Sigma-Aldrich 72068
EGTA Sigma-Aldrich O3777
CaCl2 Sigma-Aldrich 21115
Protease, Type XIV Sigma-Aldrich P5147
Collagenase, Type I Worthington Biochemical C9891
1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) TEKnova, Inc. PN T0221
BSA Sigma-Aldrich B8667
Sodium Pentobarbital Henry Schein Contact supplier for ordering *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional
ExoSAP IT Affymetrix 78201
CellsDirect 2x Rxn Mix Invitrogen 11737-030
SuperScript III RT Platinum Taq Mix Invitrogen 10928-042
RT-STA Primer Mix IDT Custom
Nuclease Free water Sigma-Aldrich W4502
WTA2 Sigma-Aldrich WTA2-50rxn
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
Qiacube Qiagen 9001292
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop 2000c
BioAnalyzer DNA 7500 kit Agilent Technologies 7500 kit
One Color Labeling kit Roche Group 5223555001
Mus Musculus 12x135k array Roche Group 5543797001
GenePix 4200A Scanner Molecular Devices 4200A
TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) Sigma-Aldrich WTA2-50RXN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am. J. Physiol. 271, (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).
  2. Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J. Physiol. Sci. 57, (6), 327-335 (2007).
  3. Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Dev. Cell. 18, (4), 675-685 (2010).
  4. Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 121, (3), 1217-1221 (2011).
  5. D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR. Methods. 50, (4), 262-270 (2010).
  6. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. Academic Press. (1965).
  7. Gaillard, F. Aorta. Radiopaedia. (2008).
  8. Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations. Nucleic Acids Res. 39, (4), e24-e24 (2011).
  9. Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab Chip. 8, (1), 68-74 (2008).
  10. Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart. Nature. 441, (7096), 1011-1014 (2006).
  11. Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135, (2), 216-226 (2008).
  12. Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, (5584), 1183-1186 (2002).

Comments

1 Comment

  1. My 1st visit!
    As a retired physicist your site best exemplfies the exponential growth of technology-for useful and benefical purposes! Of course duality applies and the potential for misuse cannot be overestimated ! Envy greed and ego are primitive impulses :)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 31, 2011 - 12:09 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats