Ex Vivo Organotypic Corneal Modell av Akutt Epiteliale Herpes simplex virus type I infeksjon

Published 11/03/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

I denne video artikkelen beskriver vi bruken av en ny

Cite this Article

Copy Citation

Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. J. Vis. Exp. (69), e3631, doi:10.3791/3631 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Herpes keratitt er en av de mest alvorlige sykdommer forbundet med herpes simplex virus-type 1 (HSV-1). Herpes keratitt er i dag den ledende årsaken til både hornhinnen-avledet og infeksjon-assosiert blindhet i den industrialiserte verden. Typisk presentasjon av herpes keratitt omfatter infeksjon i hornhinnen epitel og noen ganger dypere hornhinnen stroma og endotel, som fører til slike permanente hornhinnen patologi som arrdannelse, tynning, og opasitet en.

Corneal HSV-1-infeksjon er tradisjonelt studert i to typer eksperimentelle modeller. In vitro-modellen, der dyrkede monolag av corneale epitele celler infisert i en petriskål, og tilbyr enkelhet, høy replikerbarhet, raske eksperimenter, og relativt lave kostnader. På den annen side, gir in vivo modell, der dyrene som kaniner eller mus er inokulert direkte i hornhinnen, en meget sofistikert fysiologisksystem, men har høyere kostnader, lengre eksperimenter, nødvendig dyr omsorg, og en større grad av variasjon.

I denne videoen artikkelen gir vi en detaljert demonstrasjon av en ny ex vivo modell av hornhinneepitel HSV-1-infeksjon, som kombinerer styrken av både in vitro og in vivo-modeller. Ex vivo Modellen benytter intakt hornhinner organotypically vedlikeholdt i kultur og infisert med HSV-1. Bruken av den ex vivo-modellen muliggjør høyt fysiologisk baserte konklusjoner, men det er ganske billig og krever tid forpliktelse sammenlignbar in vitro modellen.

Protocol

Alle reagenser og utstyr ble kjøpt sterile eller ble sterilisert før prosedyren. Denne artikkelen beskriver fremgangsmåten for å sette opp ex vivo-modellen begynner med en pre-enucleated øyet. I våre eksperimenter, bruker vi fersk hel øyeepler fra unge (8-12 uker) albinokaniner (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). I tillegg bruker vi menneskelige hornhinner hentet fra lokale øye bank. Hvis du utfører enucleation selv, ta vare å unngå å skade hornhinnen eller Limbus under prosedyren. Rabbit enucleation protokoller kan bli funnet andre steder to.

Del 1: Eksisjon av Corneoscleral Button

  1. Fukt en smal stripe av gasbind med PBS og pakk det rundt øyeeplet for å lette å holde det under inngrepet.
  2. Bruke en skarp skalpell å foreta en tangential innsnitt i sklera, ca 0,5 cm vekk fra Limbus.
  3. Bruk skarp saks til å forlenge snitt og helt avgiftsdirektoratet corneoscleral knappen.
  4. Når corneoscleral knappen er isolert, erte bort iris mens du holder skleral felgen med tang. Unngå skader på endotelet eller øve mye stress på hornhinnen.

Del 2: Innføring av Hornhinnen inn Organotypic Kultur

  1. Eksplanterte hornhinner dyrkes i Minimum Essential Medium (MEM) supplert med ikke-essensielle aminosyrer (1X), L-glutamin (2 mM), penicillin (200 U / ml), og streptomycin (200 ug / ml). En soppdrepende middel, såsom amfotericin, kan også tilsettes om nødvendig.
  2. Forberede en 1% agarose-løsning i dyrkingsmedium og holde den klar ved 55 ° C.
  3. Skyll hornhinnen sterilt PBS inneholdende penicillin (200 U / ml) og streptomycin (200 ug / ml).
  4. Plasser hornhinnen epiteliale siden ned i en brønn av en steril flekk plate.
  5. Legg agarosen-holdige medium til endotelial konkavitet av hornhinnen akkurat nok tilfylle det helt. Tillat ~ 1 min for agarose å stivne.
  6. Plasser hornhinnen med den støttende gel stillaset epiteliale side opp i et 35 mm vevskultur form og legg kulturmedium til dekke epitelial overflate.
  7. Hornhinnen kan dyrkes på denne måten over en uke, med middels endres hver 48 hr.

Del 3: Infeksjon med HSV-1 og Behandling med eksperimentelt stoff

  1. Tilsett 1 ml medium inneholdende den ønskede mengde av virus i en 35 mm vevskultur parabolen. Vi vanligvis infisere med 1x10 4 PFU av stamme KOS HSV-1 per hornhinnen. Våre lager titere bestemmes ved å utføre plakk analyser på CV-en monolayers.
  2. Plasser hornhinnen sammen med agarose stillaset epiteliale side ned i virus-inneholdende medium.
  3. Plasser hornhinnen i en vev kulturinkubatoren å infisere for 1 hr med intermitterende rocking hvert 10-15 minutt.
  4. Etter 1 time, suge virus-containing medium og skyll 2-3 ganger med PBS for å fjerne eventuelle gjenværende viruspartikler.
  5. Plasser hornhinnen tilbake til sin tidligere stilling og legge friskt kulturmedium til dekke epitelial overflate.
  6. Eksperimentelle behandlinger kan startes før eller etter infeksjon, avhengig av arten av eksperimentet.
  7. Kulturmediet skiftes hver 48 hr.

Del 4: Prøvetaking

  1. Medium for plakk analysen analyse. Bland middels godt og bruke den umiddelbart for en plakett analysen eller oppbevar ved -80 ° C for senere bruk hvis prøvetaking ved ulike tidspunkt.
  2. DNA, RNA, protein, eller celler fra hornhinnen epitel
    1. Fjerne agarose stillaset og skyll hornhinnen godt med PBS.
    2. Avgiftsdirektoratet ringen av skleral vev fra hornhinnen for å sikre at bare hornhinneepitel materiale samles.
    3. Usynge en skalpell, skrape av corneale epitele celler i passende buffer, avhengig av hvilken type materiale som skal isoleres. For isolering av DNA og RNA, bruker vi DNeasy Blood & Tissue Kit og RNeasy Mini Kit, henholdsvis (QIAGEN, Hilden, Tyskland). For innsamling av protein lysates, bruker vi Laemmli buffer. Ved flowcytometri analyse av corneale epitelceller, vi pre-inkuberes hornhinnene i en liten mengde av trypsin å løsne cellene, og deretter løsne dem inn trypsin med en skalpell. Siden skraping hornhinnen epitel ikke gir like mengder vev, er det viktig å ta med hensiktsmessige kontroller når analysere prøvene. Vi bruker 18S rRNA som referanse karakterutskrift i QRT-PCRs, GAPDH som en referanse genet i qPCRs, og nucleolin som lasting kontroll for vestlige blotter.
  3. Vevsprøver for immunhistokjemi eller immunfluorescens
    1. Fjerne agarose stillaset og skyll kornetEa godt med PBS.
    2. Avhengig av eksperimentelle målet, bruk hornhinnen for å gjøre en parafin vevsblokk eller en frosset vev blokk, som vist i videoen. Vi følger standard prosedyrer ved utarbeidelse hornhinnen vev seksjoner.

Representant Resultater

De fleste av de tilgjengelige metoder for å studere celler i vevskultur kan lett tilpasses for bruk i hornhinner infisert med HSV-1 ex vivo. Vist her er representative resultater for noen av de mest vanlige teknikker gjelder å studere HSV-1 infeksjon - qPCR (figur 1D), Qrt-PCR (figur 1B), Western blot (Figur 1F), plakk-analyse (figur 1C), og vev immunfluorescens (Figur 1E).

Figur 1
Figur 1. Analyse av hornhinner infisert med HSV-1 ex vivo. (A) Skjematisk representasjon av den ex vivo-modell av akutt hornhinneepitel HSV-1 infeksjon. (BF) Analyse av hornhinner smittet ved hjelp av metoden beskrevet i denne video artikkelen. Eksplanterte rabbit hornhinner ble infisert med 1x10 4 PFU / hornhinnen av stamme KOS HSV-1 og dyrket i nærvær (PAA) eller fravær (Mock) av phosphonoacetic syre (400 ug / ml), en kjent inhibitor av HSV replikasjon. (B) total RNA ble oppsamlet ved de angitte tidspunkter, og viral transkripsjon ble vurdert av QRT-PCR med primere for HSV-1-polymerase. Primere mot 18S rRNA ble brukt som referanse. n = 3. Feilfelt indikerer ± SEM. (C) Kultur medium ble samlet i 48 hpi, og smittsomme partikkel produksjon ble vurdert av plakk analysen på CV-en monolayers. (D) Total DNA ble samlet i 48 hpi, og viral genom replikering ble vurdert i en qPCR analysen med primere for HSV-1 genomet. Primers mot GAPDH ble brukt som referanse. n = 3. Feilfelt indikerer ± SEM. (E) Mock-behandlede hornhinner ble flash-frosset i 48 hpi, seksjonert, og analysert ved indirekte immunfluorescens for tilstedeværelsen av en viral tidlig protein (ICP8) innenfor den infiserte epitel. Kjerner kontrafarget med Höchst 33258. (F) Protein lysates ble samlet i 48 hpi, og uttrykk for en viral protein (ICP0) ble vurdert av Western blot. BCA assay ble brukt for å sikre lik belastning av prøvene. HPI = timer etter infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne video artikkelen beskriver vi en fremgangsmåte for å studere akutt hornhinneepitel HSV-1 infeksjon i et ex vivo-modell. Denne modellen er en nyttig springbrett mellom in vitro og in vivo-modeller, fordi det gir mulighet for fysiologisk-nøyaktige validering av cellekultur resultater og derved begrenser mengden av dyreforsøk som må utføres. I tillegg gir den ex vivo-modellen en unik og uvurderlig mulighet til å studere epithelial herpes infeksjon i intakte menneskelige hornhinner. Skissert nedenfor er noen hensyn som må tas i betraktning når du bruker denne modellen:

  • Det er viktig å understreke at tilnærmingen er beskrevet i denne video artikkelen er ikke ment å være en modell for herpes keratitt, men er snarere en modell av akutt hornhinneepitel HSV-1 infeksjon. Herpes keratitt er et resultat av flere konfunderende prosesser, blant annet infeksjon, betennelse, og verten imMune respons på viruset. Antigen-spesifikke CD4 + og CD8 + T-celle-responser er en vesentlig komponent av patogenesen ved herpes keratitt, som ikke kan reproduseres i denne modellen, fordi eksplanterte hornhinner er ikke underlagt infiltrasjon av celler i immunsystemet. Av denne grunn, har de ikke utvikle typiske epiteliale dendrittiske sår og mangler stromal engasjement klassisk observert i herpes stromal keratitt 3. Derfor, scoring av sykdommen alvorlighetsgrad og fluorescein avbildning av hornhinnen ulcers er ikke mulig i ex vivo modell. I tillegg er de fleste tilfeller av herpes keratitt forårsaket av viral reaktivering fra latency. Siden vår tilnærming er avhengig av direkte smitte av eksplanterte hornhinner med eksogen virus, modellerer det akutt HSV-1 hornhinnen infeksjon og ikke reaktivering sykdom. Av disse grunner, er modellen presentert her ikke egnet for å forstå den generelle sykdommens patologi, men heller should brukes til å studere virusreplikasjon og virus-vert interaksjoner strengt i hornhinnen epitel.
  • Ex vivo herpes keratitt modell gir resultater med større variasjon enn in vitro vev kultur eksperimenter. Dette er sannsynligvis på grunn av det faktum at hver hornhinnen samles fra en annen kanin og kan behandles litt annerledes. Menneskelige hornhinner viser en enda større variasjon av resultater enn kanin hornhinner, fordi de kommer fra givere av variabelen alder, rase og helsetilstand, og er bevart for ulike mengder tid post mortem. Imidlertid, med bruk minst fem hornhinner per eksperimentell behandling, var vi i stand til å generere statistisk pålitelige data.
  • Den tradisjonelle metoden for dyrking eksplantert hornhinner 4-5 foreslår å bruke akkurat nok kulturmedium til dekke Limbus av hornhinnen. Vi fant at økende mengden av middels til fullstendig dekke epitelet gir mer konsistente resultater,sannsynligvis på grunn av minimere forskjellene mellom de enkelte hornhinner adgang til middels og eksperimentelle medikamenter som finnes der.
  • Når du bruker kanin hornhinner for enhver applikasjon utnytte antistoffer, er det viktig å huske på at tradisjonelle antistoffer med særegenheter til menneske, mus, rotte, etc. er trolig ikke kryssreagerer mot kanin antigener. I tillegg kan ekstra anti-kanin antistoffer selvfølgelig ikke benyttes i disse søknadene. Av disse grunner, bruker vi menneskelige hornhinner i forsøk med antistoffarging av mobilnettet mål.
  • Ved innsamling epitelceller for flowcytometri analyse, må eksperimentator være forsiktige om effekten av trypsin på membran-bundet proteiner. Således, for deteksjon av overflateproteiner, kan det være fordelaktig å bruke andre midler for omplassering cellene, for eksempel kollagenaser eller ikke-trypsin proteaser.
  • Dyremodeller av herpes keratitt stole på hornhinnen scarification før inokulering medviruset. Vi har vært i stand til å oppnå konsistente nivåer av infeksjon uten fresing de eksplanterte hornhinner. Dette er mest sannsynlig på grunn av fravær av tårefilm og blinker som raskt fjerne viruset fra hornhinnen overflaten i et levende dyr.

Potensielle modifikasjoner av ex vivo herpes keratitt modell ikke utforsket i denne videoen artikkelen:

  • Genetisk modifikasjon av corneale epitelceller før HSV-1 infeksjon ved hjelp av DNA leveringsmåte benyttes i cellekultur og i genterapi forskning, for eksempel transfeksjon, viral produksjonstid, og genet Gunning 6.
  • Bruk av GFP-uttrykkende HSV-7-8 januar eller FITC-konjugerte anti-HSV-antistoffer 9-10 å visuelt vurdere omfanget av infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Støtte fra Lions Eye Bank of Delaware Valley var uvurderlig for dette arbeidet. Primære monoklonalt antistoff mot ICP8 var en slags gave fra Dr. David Knipe (Harvard Medical School). Vi vil også takke Dr. Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) og Dr. Peter Laibson (Wills Eye Institute) for personer diskusjoner og kompetanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium (MEM) Mediatech, Inc. 10-010-CV
Non-Essential Amino Acids (100x solution) Mediatech, Inc. 25-025-CI
L-Glutamine Mediatech, Inc. 25-005-CI
Penicillin G Sodium Salt Sigma-Aldrich P3032
Streptomycin Sulfate Salt Sigma-Aldrich S9137
Agarose Invitrogen 15510-027
Phosphate Buffered Saline (PBS) Prepared in Lab N/A
Trypsin EDTA (1x) Mediatech, Inc. 25-053-CI
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Laemmli Buffer Prepared in Lab N/A
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound Tissue-Tek 4583
Whole Rabbit Eyes (Young) Pel-Freez Biologicals 41211-2
Human Corneas and Whole Eyes Local Supplier N/A
12 Well Porcelain Spot Plate Avogadro’s Lab Supply 1877
35 mm Tissue Culture Dish Falcon BD 353001
6 Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One 657160
Cryomold Intermediate Tissue-Tek 4566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaye, S., Choudhary, A. Herpes simplex keratitis. Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).
  2. Holmberg, B. J. Enucleation of exotic pets. Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).
  3. Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
  4. Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
  5. Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
  6. Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. Corneal gene therapy. J. Control Release. 124, 107-133 (2007).
  7. Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
  8. Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
  9. Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
  10. Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats