Ex Vivo Organotypische Corneal model van acute Epitheliale Herpes Simplex Virus Type I infectie

Published 11/03/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

In deze video artikel beschrijven we het gebruik van een nieuw

Cite this Article

Copy Citation

Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. J. Vis. Exp. (69), e3631, doi:10.3791/3631 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Herpes keratitis is een van de meest ernstige pathologieën geassocieerd met het herpes simplex virus type 1 (HSV-1). Herpes keratitis is momenteel de belangrijkste oorzaak van zowel hoornvlies-afgeleid en infectie-geassocieerde blindheid in de ontwikkelde wereld. Typische presentatie van herpes keratitis omvat infectie van het hoornvliesepitheel en soms de diepere hoornvlies stroma en endotheel, wat leidt tot die vaste hoornvlies pathologieën zoals littekens, dunner, en de dekking 1.

Cornea HSV-1 infectie wordt traditioneel bestudeerd in twee soorten experimentele modellen. De in vitro model, waarin gekweekte monolagen van corneale epitheelcellen geïnfecteerd in een petrischaal, biedt eenvoud, hoge reproduceerbaarheid, snelle experimenten en relatief lage kosten. Anderzijds, het in vivo model, waarbij dieren zoals konijnen of muizen rechtstreeks geïnoculeerd in het hoornvlies, biedt een zeer geavanceerde fysiologischesysteem, maar heeft hogere kosten, meer experimenten nodig dierverzorging en een hogere variabiliteit.

In deze video artikel we een gedetailleerde demonstratie van een nieuwe ex vivo model van hoornvliesepitheel HSV-1 infectie, die de kracht van beide de in vitro en in vivo modellen combineert. De ex vivo model gebruikt intact cornea organotypically in kweek gehouden en geïnfecteerd met HSV-1. Het gebruik van het ex vivo model maakt zeer fysiologisch gebaseerde conclusies, nog tamelijk goedkoop en vereist tijdsbesteding vergelijkbaar met die van de in vitro model.

Protocol

Alle reagentia en materialen werden gekocht steriel werden voorafgaand aan de procedure gesteriliseerd. Dit artikel beschrijft de stappen van het opzetten van de ex vivo model begint met een pre-ontkernde oog. In onze experimenten gebruiken we verse hele oogballen uit jonge (8-12 wkn) albino konijnen (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Bovendien gebruiken we menselijke cornea verkrijgbaar bij het oog bank. Bij het uitvoeren van enucleatie jezelf, zorg om te voorkomen dat schade aan het hoornvlies of de limbus tijdens de procedure. Konijn enucleatie protocollen kunnen elders 2 worden gevonden.

Deel 1: Excisie van de Corneoscleral Button

  1. Bevochtig een smalle strook van gaas met PBS en wikkel het rond de oogbol te vergemakkelijken vast te houden tijdens de procedure.
  2. Met een scherp scalpel een tangentiële incisie in de sclera, ongeveer 0,5 cm vanaf de limbus.
  3. Gebruik een scherpe schaar om de incisie te breiden en volledig accijnzen de corneoscleral knop.
  4. Zodra de corneoscleral knop wordt geïsoleerd, plagen weg de iris terwijl u de sclerale velg met een pincet. Voorkom beschadiging van het endotheel of het uitoefenen van overmatige stress op het hoornvlies.

Deel 2: Introductie van Hoornvlies in Organotypische Cultuur

  1. Geëxplanteerde cornea worden gekweekt in Minimum Essential Medium (MEM) aangevuld met niet-essentiële aminozuren (1X), L-Glutamine (2 mM), penicilline (200 U / ml) en streptomycine (200 ug / ml). Een antischimmelmiddel, zoals amfotericine, kunnen eveneens worden toegevoegd indien nodig.
  2. Bereid een 1% agarose-oplossing in kweekmedium en bewaar deze bij 55 ° C.
  3. Spoel de cornea in steriele PBS bevattende penicilline (200 U / ml) en streptomycine (200 ug / ml).
  4. Plaats de cornea epitheel omlaag in een putje van een steriele spot plaat.
  5. Voeg agarose bevattende medium om de endotheliale holte van de cornea net genoeg omvolledig vullen. Toestaan ​​~ 1 min voor de agarose is gestold.
  6. Plaats het hoornvlies met de ondersteunende gel schavot epitheliale zijde naar boven in een 35 mm weefselkweekplaat en voeg kweekmedium aan het epitheliale oppervlak te bedekken.
  7. Het hoornvlies kan worden gekweekt op deze manier meer dan een week, met een gemiddelde veranderingen per 48 uur.

Deel 3: Infectie met HSV-1 en Behandeling met Experimental Drugs

  1. Voeg 1 ml medium bevattende de gewenste hoeveelheid virus in een 35 mm weefselkweekplaat. We meestal infecteren met 1x10 4 PFU van stam KOS HSV-1 per hoornvlies. Onze voorraad titers worden bepaald door het uitvoeren van plaque assays op CV-1 monolagen.
  2. Leg de cornea met agarose steiger epitheliale omlaag in de virus bevattende medium.
  3. Plaats de cornea in een weefselcultuurincubator te infecteren gedurende 1 uur met onderbroken rocking elke 10-15 minuten.
  4. Na 1 uur, zuigen het virus-containersning medium en spoel 2-3 keer met PBS om resten virale deeltjes te verwijderen.
  5. Plaats de cornea weer in de vorige positie door vers kweekmedium om het epitheliale oppervlak.
  6. Experimentele behandelingen worden gestart vóór of na infectie, afhankelijk van de aard van het experiment.
  7. Kweekmedium wordt elke 48 uur.

Deel 4: Monsterneming

  1. Medium voor plaque assay analyse. Meng het medium en onmiddellijk voor een plaque assay of winkel te gebruiken bij -80 ° C voor later gebruik als monsters op verschillende tijdstippen.
  2. DNA, RNA, eiwit of cellen van hoornvliesepitheel
    1. Verwijder de agarose schavot en spoel het hoornvlies met PBS.
    2. Accijnzen de ring van sclerale weefsel van het hoornvlies dat alleen het cornea-epitheel materiaal sneller te verzamelen.
    3. Uzingen een scalpel, schraap de corneale epitheelcellen in de juiste buffer, afhankelijk van het soort materiaal te isoleren. Voor isolatie van DNA en RNA, gebruiken we de DNeasy Tissue Kit Blood & en de RNeasy Mini Kit respectievelijk (QIAGEN, Hilden, Duitsland). Voor het verzamelen van eiwitlysaten gebruiken we Laemmli buffer. Voor flowcytometrie analyse van corneale epitheelcellen, we pre-incubeer de hoornvliezen in een kleine hoeveelheid trypsine om de cellen los te maken en ze in trypsine los met een scalpel. Aangezien schrapen het hoornvliesepitheel levert geen gelijke hoeveelheden weefsel is belangrijk om de juiste controles omvatten de analyse van de monsters. We gebruiken 18S rRNA als referentie transcript in qRT-PCR, GAPDH als referentiegen in qPCRs en nucleoline als ladingcontrole voor Western blots.
  3. Weefselmonsters voor immunohistochemie of immunofluorescentie
    1. Verwijder de agarose steiger en spoel het korenEA goed met PBS.
    2. Let op experimentele doel met de cornea tot een paraffine tissue block of bevroren weefsel-blok zoals getoond in de video. We volgen standaardprocedures bij het opstellen van het hoornvlies weefsel secties.

Representatieve resultaten

De meeste methoden voor het bestuderen van cellen in weefselkweek kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in hoornvlies geïnfecteerd met HSV-1 ex vivo. Hier worden representatieve resultaten voor een aantal van de meest gebruikte technieken voor het bestuderen van HSV-1 infectie - qPCR (Figuur 1D), qRT-PCR (Figuur 1B), Western blot (Figuur 1F), plaque assay (figuur 1C) en tissue immunofluorescentie (Figuur 1E).

Figuur 1
Figuur 1. Analyse van cornea geïnfecteerd met HSV-1 ex vivo. (A) Schematische weergave van de ex vivo model van acute hoornvliesepitheel HSV-1 infectie. (BF) Analyse van cornea geïnfecteerd volgens de methode beschreven in dit artikel video. Geëxplanteerde konijnen hoornvlies werden geïnfecteerd met 1x10 4 PFU / cornea van stam KOS HSV-1 en gekweekt in aanwezigheid (PAA) of afwezigheid (Mock) van phosphonoacetic acid (400 ug / ml), een bekende remmer van HSV-replicatie. (B) Totaal RNA werd verzameld op de aangegeven tijdstippen en virale transcriptie werd bepaald door qRT-PCR met primers voor HSV-1 polymerase Primers tegen 18S rRNA werden gebruikt als referentie. n = 3. Foutbalken geven ± SEM. (C) Kweekmedium werd verzameld op 48 hpi en infectieuze deeltjes productie werd bepaald door plaque assay op CV-1 monolagen. (D) Totaal DNA werd verzameld op 48 hpi en virale genoomreplicatie werd beoordeeld in een qPCR assay met primers voor de HSV-1 genoom. Primers tegen GAPDH werden gebruikt als referentie. n = 3. Foutbalken geven ± SEM. (E) Mock behandelde hoornvliezen werden snel bevroren op 48 hpi, doorsnede, en met indirecte immunofluorescentie op de aanwezigheid van een virale vroege eiwitten (ICP8) in de geïnfecteerde epitheel. Kernen worden tegengekleurd met Höchst 33258. (F) Protein lysaten werden verzameld op 48 hpi en expressie van een viraal eiwit (ICP0) werd bepaald door Western blot. BCA assay werd gebruikt om gelijke belasting van monsters te garanderen. hpi = uur na infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel video beschrijven we een methode voor het bestuderen acute hoornvliesepitheel HSV-1 infectie in een ex vivo model. Dit is een nuttig stap tussen de in vitro en in vivo modellen, omdat daardoor fysiologisch accurate validatie van cel kweek en daarmee beperkt de hoeveelheid dierproeven die moeten worden uitgevoerd. Bovendien is de ex vivo model een unieke en waardevolle gelegenheid aan epitheliale herpes infectie bestuderen intact menselijk hoornvlies. Hieronder volgt een overzicht zijn een aantal overwegingen die moeten worden gehouden bij het gebruik van dit model:

  • Het is belangrijk te benadrukken dat de benadering die in dit artikel video is niet bedoeld om een model van herpes keratitis, maar eerder een model van acute hoornvliesepitheel HSV-1 infectie. Herpes keratitis is een resultaat van verschillende storende processen, waaronder infectie, ontsteking en de gastheer immune reactie op het virus. Antigeenspecifieke CD4 + en CD8 + T cel responsen een belangrijke component van de pathogenese van herpes keratitis, die niet kan worden gereproduceerd in dit model omdat geëxplanteerde hoornvliezen niet onder infiltratie door cellen van het immuunsysteem. Daarom zijn ze niet ontwikkelen typische epitheliale dendritische ulcera en missen de stromale betrokkenheid klassiek waargenomen herpes stromal keratitis 3. Daarom scoren van de ernst van de ziekte en fluoresceïne beeldvorming van ulcera is niet mogelijk in het ex vivo model. Bovendien zijn de meeste gevallen van herpes keratitis veroorzaakt door virale reactivering van latentie. Sinds onze aanpak is gebaseerd op directe infectie van geëxplanteerde hoornvliezen met exogene virus, modelleert acute HSV-1 cornea infectie en niet reactivering ziekte. Om deze redenen is de hier gepresenteerde model niet geschikt voor het begrijpen van de totale pathologie van de ziekte, maar should worden gebruikt om virale replicatie en virus-gastheer interacties strikt studeren in het cornea-epitheel.
  • De ex vivo herpes keratitis model geeft resultaten met een grotere variabiliteit dan de in vitro weefselkweek experimenten. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat elke cornea wordt vanuit een ander konijn en enigszins anders worden verwerkt. Human hoornvliezen tonen een nog grotere variabiliteit van de resultaten dan konijn hoornvliezen, omdat ze afkomstig zijn van donoren van de variabele leeftijd, ras, en de gezondheidstoestand, en worden bewaard voor verschillende bedragen van de tijd na het overlijden. Echter, het gebruik ten minste vijf cornea per experimentele behandeling, konden we statistisch betrouwbare gegevens te genereren.
  • De traditionele methode voor het kweken van geëxplanteerd hoornvliezen vier-vijf suggereert het gebruik van net genoeg kweekmedium de limbus van het hoornvlies te dekken. We vonden dat verhogen van de hoeveelheid medium volledig te bedekken het epitheel consistentere resultaten oplevert,waarschijnlijk te wijten aan het minimaliseren van de verschillen tussen de individuele hoornvliezen de toegang tot het medium en experimentele drugs daarin.
  • Bij gebruik konijnen hoornvlies gebruik voor elke toepassing antilichamen is het van belang te bedenken dat traditionele antilichamen met specificiteiten voor mens, muis, rat, etc. waarschijnlijk geen kruisreactie tegen konijnen antigenen. Bovendien kunnen secundaire anti-konijnenantilichamen natuurlijk niet worden gebruikt in deze toepassingen. Daarom gebruiken we menselijke cornea in experimenten met antilichaamkleuring van cellulaire doelwitten.
  • Bij het verzamelen van epitheliale cellen voor flowcytometrie-analyse, moet de onderzoeker voorzichtig over de effecten van trypsine op de membraan-gebonden eiwitten. Dus voor detectie van oppervlakte-eiwitten, kan het nuttig zijn om andere middelen loskomen van de cellen, zoals collagenasen of niet-trypsine proteases gebruikt.
  • Diermodellen herpes keratitis afhankelijk corneale insnijding vóór inoculatie methet virus. We zijn erin geslaagd om een ​​consistente niveaus van infectie te bereiken zonder verticuteren het geëxplanteerde hoornvliezen. Dit is waarschijnlijk vanwege de afwezigheid van de traanfilm en knipperen die snel het virus te elimineren van het hoornvlies in een levend dier.

Mogelijke wijzigingen van de ex vivo herpes keratitis model niet onderzocht in deze video artikel:

  • Genetische modificatie van de corneale epitheelcellen voor HSV-1 infectie met DNA verzendwijzen gebruikt in celkweek en in gentherapie, zoals transfectie, virale aflevering en gen schieten 6.
  • Gebruik van GFP-expressie HSV-1 7-8 of FITC-geconjugeerd anti-HSV-antilichamen 9-10 visueel beoordelen in hoeverre infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

De steun van de Lions Eye Bank van Delaware Valley was van onschatbare waarde voor dit werk. Primaire muis monoklonaal antilichaam tegen ICP8 was een vriendelijke gift van Dr David Knipe (Harvard Medical School). We danken ook dr. Stephen Jennings (Drexel University College of Medicine) en dr. Peter Laibson (Wills Eye Institute) voor nuttige discussies en expertise.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium (MEM) Mediatech, Inc. 10-010-CV
Non-Essential Amino Acids (100x solution) Mediatech, Inc. 25-025-CI
L-Glutamine Mediatech, Inc. 25-005-CI
Penicillin G Sodium Salt Sigma-Aldrich P3032
Streptomycin Sulfate Salt Sigma-Aldrich S9137
Agarose Invitrogen 15510-027
Phosphate Buffered Saline (PBS) Prepared in Lab N/A
Trypsin EDTA (1x) Mediatech, Inc. 25-053-CI
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Laemmli Buffer Prepared in Lab N/A
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound Tissue-Tek 4583
Whole Rabbit Eyes (Young) Pel-Freez Biologicals 41211-2
Human Corneas and Whole Eyes Local Supplier N/A
12 Well Porcelain Spot Plate Avogadro’s Lab Supply 1877
35 mm Tissue Culture Dish Falcon BD 353001
6 Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One 657160
Cryomold Intermediate Tissue-Tek 4566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaye, S., Choudhary, A. Herpes simplex keratitis. Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).
  2. Holmberg, B. J. Enucleation of exotic pets. Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).
  3. Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
  4. Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
  5. Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
  6. Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. Corneal gene therapy. J. Control Release. 124, 107-133 (2007).
  7. Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
  8. Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
  9. Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
  10. Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats