基因分型的植物和动物样品,恕不另行DNA的纯化

Biology
 

Summary

这里提出的直接PCR方法便于直接从少量的未精制的植物和动物组织的PCR扩增。

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Chum, P. Y., Haimes, J. D., André, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification. J. Vis. Exp. (67), e3844, doi:10.3791/3844 (2012).

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Abstract

的直接PCR方法有利于PCR扩增直接从少量未纯化的样品,这里用于表明几种植物和动物组织( 图1)。直接PCR的基础上特别设计的赛默飞世尔科技Phusion Phire DNA聚合酶,其中包括双链DNA结合结构域,使他们独特的性能,如高耐受性抑制剂。

PCR为基础的目标DNA检测在植物研究中有许多应用,包括转基因植株基因型分析和验证。传统的PCR方法从植物组织中涉及的初始DNA分离步骤,这可能需要昂贵的或有毒的试剂。该过程是耗时的,并增加1,2的交叉污染的风险。相反,通过使用Thermo Scientific的Phire植物直接PCR试剂盒目标DNA可以被容易地检测到,没有现有的DNA提取。在该模型中表现出在这里,例如来自裂解的扩增多态性序列分析(dCAPS特异性)3,4进行直接从拟南芥的植物的叶子。可以使用dCAPS特异性基因分型分析,以确定由SNP等位基因特异的限制性核酸内切酶消化3的单核苷酸多态性(SNP)。

某些植物样品往往是更具挑战性的,当使用直接PCR方法,因为它们含有干扰PCR的组件,如酚类化合物。在这些情况下,需要一个额外的步骤,以除去该化合物是传统2,5。在这里,此问题被克服,通过使用一个快速和容易的稀释随后通过直接PCR扩增( 图1)的协议。作为一个具有挑战性的植物模型的样本含有大量的酚类物质,包括单宁酸,十五年的老橡树叶。

进行基因转移到小鼠中被广泛用于在开发与研究的作用的基因pment,生理与人类疾病。这些动物的使用需要筛选的转基因的存在,通常用PCR。传统上,这涉及一个耗时的DNA分离步骤中,在此期间,用于PCR分析的DNA纯化从耳,尾或脚趾组织6,7。然而,赛默飞世尔科技Phire动物组织直接PCR试剂盒的转基因小鼠进行基因分型,恕不另行DNA纯化。实现此协议中的转基因小鼠的基因分型的直接从小鼠耳组织,如这里用于显示其中只有一个引物组,用于扩增两个片段的大小差别很大的一个挑战性例子。

Protocol

1。 拟南芥植物个体基因分型与直接议定书

  1. 要开始dCAPS特异性的基因分型检测,直接在拟南芥的植物叶,首先制订20或50μl的PCR反应使用的Phire的植物直接PCR试 ​​剂盒如表1中描述的。
  2. 其次,从拟南芥叶以Harris Uni-CORE核心和哈里斯切割垫削减了0.50毫米打孔。牢牢握住冲床,按切削刃的组织和穿孔机来回旋转。
  3. 按柱塞喷射冲头的PCR反应混合物的光盘插入。确保样本落入PCR溶液,不会粘到管壁。
  4. 清洁的前沿之间的冲床,每个样品到2%次氯酸钠溶液浸渍,以防止交叉污染。按柱塞上下几次,用干净的纸巾擦拭的最前沿。切割垫也应该样品之间的冲洗。
  5. 其次,采用了Thermo Scientific的PIKO的24孔热循环仪和赛默飞世尔科技PIKO PCR板进行PCR反应,使用表2中描述的循环条件。也可以在传统的PCR热循环仪进行PCR反应。
  6. PCR后,自旋向下的植物材料。 5微升上层清液转移到新的微量离心管中。加入4μl的水和1微升限制性内切酶,引入SspI。轻轻混匀后短暂离心管的底部收集内容。孵育一小时将反应混合物在37℃下的限制性内切酶失活,在65℃下孵育20分钟。
  7. 当扩增的DNA直接从植物组织中,将PCR产物包括厂房及PCR衍生的组成部分,可能会干扰用限制性消化酶。因此,它可能是必要的,以稀释( 例如,在水中的1:2或1:3),或纯化的PCR产物之前吨他随后的消化,例如,通过使用一个合适的商业化试剂盒如Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit纯化。
  8. 限制性内切酶消化后,得到的片段在琼脂糖凝胶上进行分析。 2.5微升5×加样缓冲液加入到反应,并进行琼脂糖凝胶电泳所得到的混合物与10μl。

2。从15岁的老橡树叶扩增特定DNA片段用稀释协议

  1. 开始的橡树叶,切成2毫米的打孔。
  2. 将样品的的Phire电厂直接PCR试剂盒提供的稀释液为20μL。清洁尖端的冲床和切割垫和以前一样。
  3. 叶样品粉碎,用100微升移液器吸头按它简单地对管壁。根据不同的植物材料,稀释协议有时效果更好而不破碎的样本。
  4. 短暂地旋转样品中微量直到t他的反应是在管的底部。
  5. 将上清液可以直接使用,在PCR中,或者它可以稀释在无菌水中1:10或1:100取决于关于样品类型。使用0.5μl到1微升上清液或稀释作为一个20微升的PCR反应的模板。准备如表1中所述的反应。
  6. 一旦反应的准备,采用了Thermo Scientific的PIKO的24孔热循环仪和赛默飞世尔科技PIKO PCR板进行PCR反应,使用表2中描述的循环条件。也可以在传统的PCR热循环仪进行PCR反应。
  7. 在PCR后,对反应中添加5μl的5×加样缓冲液,并用15μl的所得到的混合物进行琼脂糖凝胶电泳。

3。使用稀释协议的转基因小鼠的基因分型

  1. 转基因小鼠放置一个2毫米的打孔的M开始稀释的协议乌斯含0.5μL的DNARelease添加剂提供,与Phire动物组织直接PCR试剂盒的稀释液在20μl的耳朵。
  2. 样品在室温下孵育2分钟,然后在98℃下孵育2分钟
  3. 在微量短暂旋转样品,直到反应是在管的底部。
  4. 使用1μl的上清液为20微升的PCR反应中,作为模板,如表3中所述的方法制备。任何上清液是不被马上使用,可以被转移到新的试管中,并储存于-20℃下
  5. 其次,采用了Thermo Scientific的PIKO的24孔热循环仪和赛默飞世尔科技PIKO PCR板进行PCR反应,使用表4中所述的循环条件。同样,也可以进行PCR反应,在传统的PCR循环仪。
  6. 进行PCR,对反应中添加5μl的5×加样缓冲液,并进行琼脂糖凝胶电泳瓦特第i个15微升所得的混合物。

4。代表性的成果

在dCAPS特异性技术的限制性位点内的SNP的利益要么是使用与一个或多个错配的靶DNA的PCR引物引入或销毁。直接从叶拳dCAPS特异性技术的拟南芥植物个体进行基因分型。的扩增产物进行消化,并揭示每个个体的基因型产生的碎片,用凝胶电泳分析( 图2)。

的160 bp的PCR产物在拟南芥基因组中含有景点的SNP位点(G或A等位基因)在这个例子中,从植物叶冲头与Phire电厂直接PCR试 ​​剂盒进行扩增。的正向引物在3'端包含一个不匹配,创建一个SspI特定的限制位点中的目标DNA,其中包括的利益的SNP(A等位基因),但不在其他等位基因的SNP( 图2B)。

稀释协议是必要的具有挑战性的植物材料,如橡树叶,由于其高浓度的酚类化合物。用这里描述的稀释协议,297 bp的叶绿体的DNA片段的扩增使用3步骤的协议。橡树叶标本与不同稀释度的图3中所示,除了对阳性和阴性对照。

Phire动物组织直接PCR试剂盒采用一个具有挑战性的协议,其中只有一个引物组扩增两个片段被用于具有大尺寸的差异,导致在丰富的产量为1,500 bp的转基因小鼠和200 bp的正确尺寸的产品野生型小鼠( 图4)。杂合子小鼠较弱的上部带是由于这两个模板(等位基因)的相同的引物对的竞争,但是,genotypING的结果是明确的。

使用稀释协议制备的样品的稳定性进行了测试。结果表明,稀释样品,可以存储在-20℃下为至少一年。此外,反复冷冻/解冻循环没有显着影响的反应( 图5)。还示出的是稳健的扩增使用Phire DNA聚合酶和热启动 Taq聚合酶和纯化的DNA( 图6)相比的直接PCR法从小鼠耳组织样本。

组件 20μl反应 50μl反应体系 终浓度。
H 2 O 加至20微升添加到50微升
2个Phire植物PCR缓冲液 10微升 25微升 1个
引物A 所述微升所述微升 0.5μM
引物B 所述微升所述微升 0.5μM
Phire热启动II DNA聚合酶 0.4μL 1微升
采样/直接协议 0.50 mm打孔
采样/稀释协议 0.5-1微升

表1中。在本协议中使用的植物PCR反应条件。

循环步骤 温度。 时间 循环
初始变性 98°C 5分钟 1
变性
退火*
延期
98°C
X°C
72°C
5秒
5秒
20秒
40
最后延伸 72°C
4°C
1分钟
持有
1

表2。植物PCR循环条件中使用此协议。

* TM计算器oscientific.com机构/ pcrwebtools“目标=”_blank“> www.thermoscientific.com / pcrwebtools的建议当确定要使用Phire热启动II DNA聚合酶的引物的Tm。推荐的引物的退火温度≤20 nt是等于较低的Tm给出由webtool。对于引物> 20 nt的,使用的退火温度3℃高于较低的Tm由webtool给出。

组件 20μl反应 终浓度。
H 2 O 加至20微升
2个Phire动物组织PCR缓冲液 10微升 1个
引物A 所述微升 0.5μM
引物B 所述微升 0.5μM
pH值愤怒热启动II DNA聚合酶 0.4μL
采样/稀释协议 1微升

表3。在本协议中使用的动物组织的PCR反应条件。

循环步骤 温度。 时间 循环
初始变性 98°C 5分钟 1
变性
退火*
延期
98°C
X°C
72°C
5秒
5秒
20秒≤1 KB
20秒/ KB 1 KB
40
最后延伸72°C
4°C
1分钟
持有
1

表4。在本协议中使用的动物组织PCR循环条件。

*的Tm计算器时,建议在www.thermoscientific.com / pcrwebtools的决定使用Phire热启动II DNA聚合酶的引物的Tm。推荐的≤20核苷酸的引物的退火温度是等于较低的Tm由webtool给出。对于引物> 20 nt的,使用的退火温度3℃,高于给定的较低的Tm由webtool。

图1
图1。直接PCR的工作流程。,直接PCR可以进行使用两个替代协议。在直接协议中一个微小的量的样品直接添加到PCŕ反应。稀释协议采用简短的预孵育PCR步骤之前从样品材料释放DNA。

图2
图2。 拟南芥植物个体的基因分型与dCAPS特异性技术直接从叶冲头。 A)图2A示出的原则进行的dCAPS特异性检测。内SNP的利益被引入的限制性位点,通过PCR使用的引物与一个或多个的目标DNA的错配或移除。对PCR产物进行消化,所得片段揭示每个个体的基因型时,通过电泳分析。B)从植物叶片0.50毫米冲头被直接放置在50μl的PCR反应。引入一个独特的SspI位点的A等位基因的引物进行扩增的160 bp的PCR产物含有的SNP位点(G或A等位基因)。未纯化的PCR产物酶切特德用SspI,限制性内切酶。所得片段用3%的琼脂糖凝胶电泳分析。泳道M是大小标记物,泳道A和G对应于每个样品的SNP等位基因。提取DNA,然后通过PCR和酶切(数据未示出)通过常规的分析,将所得的结果证实。无模板DNA的阴性对照反应,包括在测试设置,并运行一个单独的琼脂糖凝胶上进行消化(数据未示出)之前,与实际的PCR反应平行。

图3
图3。用橡树叶样品稀释协议。稀释协议被用来扩增的297 bp的DNA片段,叶绿体DNA在橡树叶样品(3步协议,退火温度为62°C),不同的稀释液(1:100,1:10, :1和2:1),阳性和阴性对照操纵,[C +:阳性对照纯化的DNA( 拟南芥 ),C-:没有模板DNA的阴性对照。代表样品的采集样品命名网站在芬兰(镇)和样品编号。

图4
图4。基因分型的转基因小鼠的一个引物对使用的稀释协议。九个个别小鼠耳组织中(泳道1-9)被放置入20μl的稀释缓冲液包括DNARelease添加剂。经过温育在室温下和98℃,1微升上清液用作20微升的PCR反应中的模板。片段的大小:1,500基点(转基因)和200bp(野生型)。

图5
图5。制备的样品的稀释协议是稳定的,长期贮存。小鼠耳组织样品公司在20μl的稀释缓冲液包括DNARelease添加剂ubated进行反复冷冻/解冻(泳道1),在-20℃下存储一年(泳道2),或立即用于PCR(泳道3)。扩增片段大小为900 bp的,1500 bp和3200 bp的。

图6
图6。 Phire动物组织直接PCR试 ​​剂盒优于热启动Taq DNA聚合酶结合的商业DNA纯化系统。小鼠耳组织,用稀释协议Phire动物组织直接PCR试 ​​剂盒扩增,扩增子(0.5-1.5)。为了进行比较,DNA首先被使用的是商业的DNA提取试剂盒纯化和相同的片段,根据制造商的建议使用一个热启动Taq DNA聚合酶扩增。只有,与Phire动物组织直接PCR试剂盒均全部扩增子成功地扩增。

T“> 图7
图7。通用的工作流程比较估计次/消耗的试剂。Thermo Scientific的直接PCR方法相比,DNA的提取方法,提取缓冲液的方法,PCR缓冲方法。每种方法之前,PCR步骤中列出的红色文字的估计时间。 Thermo Scientific能够直接PCR方法之前PCR样品制备只需要0-4分钟。下面的每一种方法中,所消耗的试剂被列出。 Thermo Scientific能够直接PCR方法中的其它方法相比,使用最少的试剂。 点击此处查看大图

Discussion

这里展示的直接PCR方法允许直接从少量未纯化的样品进行PCR扩增,减少所需要的时间,并简化为植物和动物的基因分型( 图7)的工作流程。此处也表现出与直接PCR的方法( 图3)是使用的稀释组合协议。困难的样品( 老化植物的叶子,植物,含有干扰物质)或长(或富含GC),扩增产物稀释协议。时,开始一个新的直接PCR实验中,允许反应优化的,该协议是特别有用的。该协议可以作为一种工具来解决偶尔的困难,例如低的产品产率,由于在组织材料和/或使用的引物的差异。此外,运行多个反应时,从相同的样品,使用的稀释协议确保将整个样品在一个没有被消耗反应。

为了净化从植物中用于PCR的DNA,该公约来进行细胞裂解,然后由DNA分离使用各种部件,有可能会干扰PCR分析8。对于特别具有挑战性的植物与酚含量高,另外聚乙烯吡咯烷酮,传统上被用于删除与DNA结合的化合物,细胞裂解后的2,5。这里可以明显看出,这些复杂的,时间密集的步骤,可避免通过使用的Phire植物直接PCR试剂盒来检测目标DNA。使用的敏感dCAPS特异性技术直接从拟南芥的植物的叶子( 图2)的细胞裂解和DNA分离步骤可以省略。这里表明,稀释协议有效地管理问题的组件,可以干扰用聚合酶链反应( 图3)的存在下。

传统上,动物基因分型的先决条件是isolati通过一种有毒的,耗费时间的过程,其特征在于由一个漫长的孵化用蛋白酶K消化皮肤和结缔组织,其次通过有机溶剂提取,乙醇沉淀,并离心步骤6,9,10从动物组织中的基因组DNA上。这里表明,通过使用的Phire动物组织直接PCR试 ​​剂盒来实现这个过程的简化,允许转基因小鼠进行基因分型,恕不另行DNA纯化( 图4)。在本文中演示的例子是特别具有挑战性,因为采用了大尺寸的差异,只有一个用于两个片段的扩增引物组。尽管协议的先天困难,使用直接PCR议定书简单稀释导致的两个PCR产物( 图4)的高收率的方法配合使用。

PCR为基础的目标DNA检测,有很多的应用研究,包括基因型分析,以确定发展,生理和疾病基因的角色。由于专门的DNA聚合酶抑制剂的耐受性,该协议可以在最短的时间,恕不另行DNA纯化完成。

Disclosures

生产和免费使用这篇文章是由赛默飞世尔科技公司

Acknowledgments

拟南芥的样品和有关PCR引物,我们感谢的JaakkoKangasjärvi教授和他的研究小组,的植物逆境集团,植物分子生物学,生物科学系,赫尔辛基大学。与传统方法的实验进行了夫人爱里Lamminmäki。

转基因小鼠提供样品,生物医学/生物化学研究所,赫尔辛基大学的博士JAANA Vesterinen。

哈里斯Uni-CORE核心和哈里斯切割垫的Shunderson通信公司的商标,所有其他商标的财产的Thermo Fisher Scientific公司及其附属公司的商标或注册商标。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phire Plant Direct PCR Kit Thermo Fisher Scientific F-130 200 reactions (50 μl each)
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit Thermo Fisher Scientific F-140 200 reations (50 μl each)
Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) Thermo Fisher Scientific F-180S/L Qty: 5/25
Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) Thermo Fisher Scientific F-185S/L Qty: 5/25
Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm Thermo Fisher Scientific F-190 Qty: 5
SspI Thermo Fisher Scientific ER0771 100 μl (100 reactions)
Piko 24-Well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific TCP0024
24-Well Piko PCR Plates Thermo Fisher Scientific SLP0241
GeneJET PCR
Purification Kit
Thermo Fisher Scientific K0701
K0702
50 preps
250 preps

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References

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Comments

1 Comment

  1. Good afternoon, may I have the complete article for this kit? I would like to promote it to the customers in Indonesia.


    Regards,
    Neny

    Reply
    Posted by: Neny S.
    March 14, 2013 - 12:40 AM

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