Genotyping av planter og dyr prøver uten Prior DNA Rensing

Biology
 

Summary

Direct PCR tilnærming som presenteres her letter PCR forsterkning direkte fra små mengder urenset planter og dyr vev.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chum, P. Y., Haimes, J. D., André, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification. J. Vis. Exp. (67), e3844, doi:10.3791/3844 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Direct PCR tilnærming gjør PCR forsterkning direkte fra små mengder av urenset prøver, og er vist her for flere anlegg og animalsk vev (figur 1). Direkte PCR er basert på spesielt konstruert Thermo Scientific Phusion og Phire DNA polymerase, som inkluderer en dobbel-strandet DNA bindende domene som gir dem unike egenskaper som høy toleranse for hemmere.

PCR-basert mål-DNA påvisning har en rekke bruksområder i planteforskning, inkludert plante genotype analyse og verifisering av transgener. PCR fra plantemateriale innebærer tradisjonelt en innledende DNA isolert trinn, som kan kreve dyre eller giftige reagenser. Prosessen er tidkrevende og øker risiko for krysskontaminering 1, 2. Omvendt, ved hjelp av Thermo Scientific Phire Plant direkte PCR Kit målet DNA kan lett oppdages, uten forutgående DNA-ekstraksjon. I modellen demonstrert her, eneksempel på avledet kløyvde forsterket polymorf sekvensanalyse (dCAPS) 3,4 utføres direkte fra Arabidopsis plante blader. dCAPS genotyping analyser kan benyttes for å identifisere enkelt-nukleotid polymorfismer (SNPs) av SNP allel-spesifikk restriksjonsendonuklease fordøyelsen 3.

Noen plante prøvene tendens til å være mer utfordrende når bruker Direct PCR metoder som de inneholder komponenter som forstyrrer PCR, som fenoliske forbindelser. I disse tilfellene er et ekstra trinn for å fjerne forbindelser tradisjonelt kreves 2,5. Her, er dette problemet løst ved å bruke en rask og enkel fortynning protokoll etterfulgt av direkte PCR amplifikasjon (Figur 1). Femten år gamle eikeløv brukes som en modell for utfordrende planter som prøven inneholder store mengder fenolforbindelser inkludert tanniner.

Genoverføring i mus er bredt brukt til å studere rollene av gener i utviklingslandpment, fysiologi og sykdom hos mennesker. Bruken av disse dyrene trenger screenet for tilstedeværelse av transgenet, vanligvis med PCR. Tradisjonelt, innebærer dette en tidkrevende DNA isolering trinn, der DNA for PCR-analyse renses fra øret, hale eller tå vev 6,7. Men med Thermo Scientific Phire animalsk vev Direkte PCR Kit transgene mus bli genotyping uten forutgående DNA rensing. I denne protokoll transgen mus genotyping oppnås direkte fra mus øret vev, som demonstrert her for en utfordrende eksempel hvor bare én primer sett brukes for amplifikasjon av to fragmenter ulik sterkt i størrelse.

Protocol

1. Genotyping av Arabidopsis Plant Personer med Direct Protocol

  1. For å begynne dCAPS genotyping analysen direkte på Arabidopsis planteblad, første formulere 20 eller 50 pl PCR-reaksjoner ved hjelp av Phire Plant Direct PCR Kit som beskrevet i Tabell 1.
  2. Deretter skjærer en 0,50 mm hull fra en Arabidopsis planteblad med Harris Uni-Core og Harris Cutting Mat. Holder puncher fast, trykker du på cutting edge inn i vevet og roter puncher frem og tilbake.
  3. Trykk stempelet for å løse ut punsj plate i en PCR reaksjonsblandingen. Sørge for at prøven faller inn i PCR-løsning og klistrer seg ikke til rørveggene.
  4. Rengjør forkant av puncher mellom hver prøve for å unngå krysskontaminering ved å dyppe den i 2% NaClO løsning. Trykk stempelet opp og ned et par ganger og tørk i forkant med et rent tørkepapir. Skjærebrettet bør også væreskylles mellom prøvene.
  5. Deretter ansette en Thermo Scientific Piko 24-brønners termosykler og Thermo Scientific Piko PCR Plate til å utføre PCR reaksjoner med sykling forholdene beskrevet i Tabell 2. PCR reaksjoner kan også utføres i konvensjonelle PCR termiske cyclers.
  6. Etter PCR, spinne ned plantematerialet. Overfør 5 pl av supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør. Tilsett 4 pl vann og 1 pl av restriksjonsenzym, SSPI. Bland forsiktig og spinne ned lett for å samle innholdet i bunnen av røret. Inkuber reaksjonsblandingen i en time ved 37 ° C. Inaktivere restriksjonsenzymet ved inkubering ved 65 ° C i 20 min.
  7. Når forsterke DNA direkte fra plantemateriale, PCR produktene inkluderer anlegg og PCR-derived komponenter som kan forstyrre begrensning fordøyelsen enzymet. Derfor kan det være nødvendig å enten fortynnet (f.eks 1:2 eller 1:03 i vann) eller rense PCR produktet før than senere fordøyelse, for eksempel ved å bruke en egnet kommersielle kit som Thermo Scientific GeneJET PCR Rensing Kit.
  8. Etter restriksjonsenzym fordøyelsen, analysere de resulterende fragmenter på en agarose gel. Legg 2,5 pl 5x lasting buffer til reaksjonsblandingen og utføre agarosegelelektroforese med 10 pl av den resulterende blanding.

2. Forsterke spesifikke DNA fragmenter fra 15-åringen Oak Leaves bruker Fortynning Protocol

  1. Til å begynne, kuttet en 2 mm dor av eik blad.
  2. Plasser prøven i 20 ul Fortynningsbuffer leveres med Phire Plant direkte PCR Kit. Rengjør forkant av puncher og kutte matte som før.
  3. Knus blad prøven med en 100 ul pipettespiss ved å trykke det kort mot rørveggen. Avhengig plantemateriale, fungerer fortynning protokollen noen ganger bedre uten å knuse prøven.
  4. Spinne prøvene kort i en mikrosentrifuge inntil than reaksjoner er i bunnen av rørene.
  5. Supernatanten kan bli brukt direkte i PCR, eller det kan fortynnes 1:10 eller 1:100 i sterilt vann, avhengig prøvetype. Bruk 0,5 ul til 1 pl av supernatanten eller fortynning som en mal for en 20 pl PCR-reaksjon. Klargjør reaksjon som beskrevet i tabell 1..
  6. Når reaksjonene er forberedt, ansette en Thermo Scientific Piko 24-brønners termosykler og Thermo Scientific Piko PCR Plate til å utføre PCR reaksjoner med sykling forholdene beskrevet i Tabell 2. PCR reaksjoner kan også utføres i konvensjonelle PCR termiske cyclers.
  7. Etter PCR, tilsett 5 pl 5x lasting buffer til reaksjonsblandingen og utføre agarosegelelektroforese med 15 pl av den resulterende blanding.

3. Genotyping av transgene mus ved hjelp av Fortynning Protocol

  1. Begynn fortynning protokollen på transgene mus ved å plassere en 2 mm dor av mouse øre i 20 ul Fortynningsbuffer inneholder 0,5 pl DNARelease Additive leveres med Phire Animal Tissue direkte PCR Kit.
  2. Inkuber prøvene ved romtemperatur i 2 min, fulgt av 2 min inkubering ved 98 ° C.
  3. Spinne prøvene kort i en mikrosentrifuge inntil reaksjonene er i bunnen av rørene.
  4. Bruk 1 ul supernatant som mal for en 20 pl PCR reaksjon, fremstilt som beskrevet i Tabell 3. Hvilkensomhelst supernatanten som ikke å bli brukt med en gang kan bli overført til et nytt rør og lagret ved -20 ° C.
  5. Deretter ansette en Thermo Scientific Piko 24-brønners termosykler og Thermo Scientific Piko PCR Plate til å utføre PCR reaksjoner med sykling forholdene beskrevet i Tabell 4. Igjen, kan PCR-reaksjoner også utføres i konvensjonelle PCR cyclers.
  6. Etter PCR, tilsett 5 pl 5x lasting buffer til reaksjonsblandingen og utføre agarosegelelektroforese wITH 15 pl av den resulterende blanding.

4. Representant Resultater

I dCAPS teknikken restriksjonssete innenfor SNP av interesse enten innført eller ødelagt ved hjelp av en PCR-primer med en eller flere mistilpasninger til mål-DNA. Genotyping av Arabidopsis plante individer ble utført med dCAPS teknikken direkte fra blad slag. De amplifiserte produkter ble fordøyd og de ​​resulterende fragmenter avdekker genotypen til hvert individ ble analysert ved gel elektroforese (figur 2).

I dette eksempel ble de 160 bp PCR-produkter som inneholder SNP område av interesse (G eller A allel) i Arabidopsis genomet amplifisert fra planteblad slag med Phire Plant Direct PCR Kit. Den fremre primer inneholdt en mismatch i 3 'enden, og skaper en SSPI-spesifikk restriksjonssete i target DNA, som omfattet SNP interessante (A allel), men ikkei den annen allelet av SNP (figur 2B).

Fortynning protokoller er nødvendig for utfordrende plantemateriale, som eik blad, på grunn av sin høye konsentrasjon av fenolforbindelser. Bruke fortynning protokollen beskrevet her, ble det 297 bp fragment av chloroplastic DNA amplifisert ved hjelp av 3-trinns-protokollen. Oak Leaf prøvene med forskjellige fortynninger er vist i figur 3, i tillegg til de positive og negative kontroller.

Den Phire animalsk vev direkte PCR Kit ble ansatt med en utfordrende protokoll hvor bare én primer sett ble brukt for amplifikasjon av to fragmenter med en stor størrelse forskjell, som resulterer i rikelig utbytter av begge fullstendig størrelse produkter på 1.500 bp for transgene mus og 200 bp for villtype mus (figur 4). Den svakere øvre båndet med heterozygote mus skyldes konkurransen av begge maler (alleler) for samme primer par; imidlertid genotypsammenligner resultatene er entydige.

Stabiliteten av prøvene fremstilt ved hjelp av fortynning protokollen ble også testet. Resultatene viser at fortynning prøvene kan oppbevares ved -20 ° C i minst ett år. Videre gjorde gjentatte fryse / tine sykluser ikke påvirke reaksjonen (Figur 5). Også vist er den robuste forsterkning fra mus øret vevsprøver hjelp Phire DNA-polymerase og det direkte PCR-metode sammenlignet varmstart Taq polymerase og renset DNA (figur 6).

Komponenter 20 pl reaksjon 50 ul reaksjon Endelig Kons.
H 2 O legge til 20 ul legge til 50 ul
2x Phire Plant PCR-buffer 10 pl 25 pl 1x
primer A X ul X ul 0,5 pM
primer B X ul X ul 0,5 pM
Phire Hot Start II DNA Polymerase 0,4 pl 1 ul
Sample / direkte protokollen 0,50 mm dor
Sample / fortynning protokollen 0,5 til 1 pl

Tabell 1. Reaksjonsbetingelsene for Plant PCR brukt i denne protokollen.

Cycle Step Temp. Tid Sykluser
Initial denaturering 98 ° C 5 min 1
Denaturering
Annealing *
Extension
98 ° C
X ° C
72 ° C
5 sek
5 sek
20 sek
40
Endelig Extension 72 ° C
4 ° C
1 min
hold
1

Tabell 2. Sykling vilkår for Plant PCR brukt i denne protokollen.

* Den Tm kalkulator påoscientific.com / pcrwebtools "target =" _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools anbefales ved fastsettelse av Tm for primere som skal brukes med Phire Hot Start II DNA Polymerase. Anbefalt annealing temperaturen for primere ≤ 20 nt er lik nedre Tm gitt av webtool. For primere> 20 nt, bruk en annealing temperatur 3 ° C høyere enn den nedre Tm gitt av webtool.

Komponenter 20 pl reaksjon Endelig Kons.
H 2 O legge til 20 ul
2x Phire Animal Tissue PCR-buffer 10 pl 1x
primer A X ul 0,5 pM
primer B X ul 0,5 pM
Phire Hot Start II DNA Polymerase 0,4 pl
Sample / fortynning protokollen 1 ul

Tabell 3. Reaksjonsbetingelser for Animal Tissue PCR brukt i denne protokollen.

Cycle Step Temp. Tid Sykluser
Initial denaturering 98 ° C 5 min 1
Denaturering
Annealing *
Extension
98 ° C
X ° C
72 ° C
5 sek
5 sek
20 sek ≤ 1 kb
20 sek / kb> 1 kb
40
Endelig Extension 72 ° C
4 ° C
1 min
Hold
1

Tabell 4. Sykling vilkår for Animal Tissue PCR brukes i denne protokollen.

* Den Tm kalkulator på www.thermoscientific.com / pcrwebtools anbefales ved fastsettelse av Tm for primere som skal brukes med Phire Hot Start II DNA Polymerase. Den anbefalte temperatur for annealing primere ≤ 20 nt er lik lavere Tm gitt av webtool. For primere> 20 nt, bruk en annealing temperatur 3 ° C høyere enn den nedre Tm gitt av webtool.

Figur 1
Figur 1. Direkte PCR arbeidsflyt. Direkte PCR kan utføres ved hjelp av to alternative protokoller. I den direkte protokollen en liten mengde av prøven tilsettes direkte til PCR reaksjon. Fortynningen protokollen benytter en kort Preinkubasjon trinn før PCR å frigjøre DNA fra prøvematerialet.

Figur 2
Figur 2. Genotyping av Arabidopsis plante personer med dCAPS teknikk direkte fra blad slag. A) Figur 2A viser prinsipp dCAPS assay utført. Den restriksjonssete innenfor SNP av interesse enten innført eller fjernet ved hjelp av en PCR primer med en eller flere mistilpasninger til mål-DNA. PCR produktene er fordøyd og de ​​resulterende fragmenter avsløre genotypen til hvert individ når de analyseres ved elektroforese. B) 0,50 mm slag fra plante blader ble plassert direkte i 50 ul PCR-reaksjoner. De 160 bp PCR-produkter som inneholder SNP nettsted (G eller A allel) ble amplifisert med primere innføre en unik SSPI nettsted til A-allel. De urenset PCR produktene var digested med SSPI restriksjonsenzym. Resulterende fragmenter ble analysert på en 3% agarosegel. Lane M er størrelse markør; feltene A og G tilsvarer SNP alleler av hver prøve. De oppnådde resultatene ble bekreftet ved konvensjonell analyse av DNA-ekstraksjon etterfulgt av PCR og begrensning fordøyelse (data ikke vist). Den negative kontrollen reaksjoner uten mal DNA ble inkludert i test satt opp og kjøre på en egen agarosegel parallelt med de faktiske PCR reaksjoner før du utfører digestions (data ikke vist).

Figur 3
Figur 3. Fortynning protokollen med Oak Leaf prøvene. Fortynningen protokollen ble brukt til å forsterke 297 bp fragmentet av chloroplastic DNA i Oak Leaf prøver (3-stegs protokollen, annealing ved 62 ° C) ved ulike fortynninger (1:100, 1:10, 1 : 1 og 2:1) og positive og negative conTrols [C +: positiv kontroll fra renset DNA (Arabidopsis), C-: negativ kontroll med ingen templat DNA]. Utvalget nomenklatur representerer prøvetaking området (byene i Finland) og prøven nummerering.

Figur 4
Figur 4. Genotyping av transgene mus med en primer par med fortynning protokollen. Ear vev av ni individuelle mus (baner 1-9) ble anbrakt i 20 pl Fortynningsbuffer inkludert DNARelease Additive. Etter inkubasjoner ved romtemperatur og 98 ° C ble 1 ul supernatant brukt som en mal i 20 pl PCR-reaksjon. Fragment størrelser: 1500 bp (transgene) og 200 bp (wildtype).

Figur 5
Figur 5. Prøver fremstilt i henhold til protokollen fortynning er stabile for langtidslagring. Prøver av mus øret vev var inc ubated i 20fil Fortynningsbuffer inkludert DNARelease Additive og utsatt for gjentatt frysing / tining (kolonne 1), lagret ved -20 ° C i ett år (søyle 2), eller brukes umiddelbart for PCR (felt 3). De forsterkede fragment størrelsene var 900 bp, 1500 bp og 3200 bp.

Figur 6
Figur 6. Phire Animal Tissue direkte PCR Kit utkonkurrerer en kommersiell DNA rensing system kombinert med en varm start Taq DNA polymerase. Fire amplikonene (0,5 til 1,5 kb) ble forsterket fra mus øret vev ved hjelp av fortynning protokollen Phire Animal Tissue direkte PCR Kit. Til sammenligning ble DNA første renset ved hjelp av en kommersiell DNA-ekstraksjon kit og samme fragmenter ble forsterket ved hjelp av en varm start Taq DNA polymerase i henhold til produsentens anbefalinger. Bare med Phire Animal Tissue direkte PCR Kit var alle fire amplikonene vellykket forsterket.

t "> Figur 7
Figur 7. Universell sammenligning av arbeidsflyten med estimering av tider / forbrukes reagenser. Thermo Scientific Direct PCR tilnærming blir sammenlignet med DNA isolering tilnærming, Utvinning buffer tilnærming, og PCR buffer tilnærming. Beregnet tid for hver tilnærming før PCR trinnet er oppført i rød tekst. Thermo Scientific Direct PCR tilnærming tar bare 0-4 min for prøveopparbeidelse før PCR. Under hver metode, er forbrukes reagenser oppført. Thermo Scientific Direct PCR tilnærming bruker minst av reagenser i forhold til de andre metodene. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Direct PCR tilnærming demonstrert her tillater PCR forsterkning direkte fra små mengder urenset prøver, noe som reduserer tiden det og forenkle arbeidsflyten for planter og dyr genotyping (figur 7). Demonstrerte også her er bruken av fortynningen protokollen i kombinasjon med Direct PCR tilnærming (figur 3). Fortynning protokollen anbefales med vanskelige prøver (f.eks alderen plante blader, plantearter som inneholder forstyrrende forbindelser) eller med lange (eller GC-rike) amplikonene. Denne protokollen er spesielt nyttig når starter en ny direkte PCR eksperimentet, noe som åpner for optimalisering av reaksjonen. Protokollen kan tjene som et verktøy for å håndtere sporadiske problemer som lave produktpriser gir grunn av forskjeller i vev materiale og / eller primere brukes. Videre, når kjører flere reaksjoner fra samme prøve, bruk av fortynningen protokoll sikrer hele prøven er ikke forbrukes i enreaksjon.

For å rense DNA fra planter for PCR, var konvensjonen til å utføre cellelyse etterfulgt av DNA isolert ved hjelp av ulike komponenter som potensielt kan forstyrre PCR-analyse 8. For spesielt utfordrende planter med høyt fenoliske innhold, tillegg av polyvinylpyrrolidon ble tradisjonelt brukt til å fjerne forbindelser som binder seg til DNA etter cellelyse 2,5. Som fremgår her, kan disse kompliserte, tidkrevende trinn unngås ved bruk av Phire Plant Direkte PCR Kit for å detektere mål-DNA. Cellelyse og DNA isolering trinn kan utelates ved hjelp de følsomme dCAPS teknikker direkte fra Arabidopsis plante blader (figur 2). Som demonstrert her, administrerer fortynning protokollen effektivt tilstedeværelsen av problematiske komponenter som kan forstyrre PCR (figur 3).

Tradisjonelt, var en forutsetning for dyrs genotyping isolasjonseffekterpå av genomisk DNA fra animalsk vev gjennom en giftig, tidkrevende prosess karakterisert ved en lang inkubasjon med proteinase K å fordøye hud og bindevev, etterfulgt av organisk løsemiddelekstraksjon, alkohol nedbør og sentrifugeringstider trinn 6,9,10. Som demonstrert her, er forenkling av denne prosessen oppnås ved bruk av den Phire animalsk vev direkte PCR Kit, slik transgene mus skal genotyping uten forutgående DNA rensing (figur 4). Eksempelet vist i denne artikkelen er spesielt utfordrende som bare en primer sett ble brukt for amplifikasjon av to fragmenter med en stor størrelse forskjell. Tross protokollens medfødte vanskeligheter, bruk av Direct PCR tilnærmingen i forbindelse med enkel fortynning protokollen ga høye utbytter av de to PCR-produkter (Figur 4).

PCR-basert mål-DNA påvisning har mange bruksområder innen forskning, inkludert genotype analyse for å identifisererollene av gener i utvikling, fysiologi og sykdom. Grunnet inhibitor toleranse av de spesialiserte DNA polymeraser kan protokollene være ferdig i minimal tid uten forutgående DNA rensing.

Disclosures

Produksjon og fri tilgang til denne artikkelen er sponset av Thermo Fisher Scientific, Inc.

Acknowledgments

For de Arabidopsis prøver og de ​​berørte PCR primere takker vi professor Jaakko Kangasjärvi og hans gruppe, The Plant Stress Group, Plant biologi, Institutt for biovitenskap, Universitetet i Helsinki. Forsøkene med den tradisjonelle metoden ble utført av Mrs. Airi Lamminmäki.

Transgene mus prøvene ble levert av Dr. Jaana Vesterinen, Institutt for biomedisin / biokjemi, Universitetet i Helsinki.

Harris Uni-Core og Harris Cutting Mat er varemerker for Shunderson Communications Inc. Alle andre varemerker tilhører Thermo Fisher Scientific Inc. og dets datterselskaper.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phire Plant Direct PCR Kit Thermo Fisher Scientific F-130 200 reactions (50 μl each)
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit Thermo Fisher Scientific F-140 200 reations (50 μl each)
Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) Thermo Fisher Scientific F-180S/L Qty: 5/25
Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) Thermo Fisher Scientific F-185S/L Qty: 5/25
Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm Thermo Fisher Scientific F-190 Qty: 5
SspI Thermo Fisher Scientific ER0771 100 μl (100 reactions)
Piko 24-Well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific TCP0024
24-Well Piko PCR Plates Thermo Fisher Scientific SLP0241
GeneJET PCR
Purification Kit
Thermo Fisher Scientific K0701
K0702
50 preps
250 preps

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).
  2. Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP. Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).
  3. Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).
  4. Michaels, S. D., Amasino, R. M. A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR. The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).
  5. John, M. E. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics. Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).
  6. Wang, Z., Storm, D. R. Extraction of DNA from mouse tails. BioTechniques. 41, 410-412 (2006).
  7. Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice. BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).
  8. Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).
  9. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory. 2nd ed, CSH Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  10. Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR. Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).

Comments

1 Comment

  1. Good afternoon, may I have the complete article for this kit? I would like to promote it to the customers in Indonesia.


    Regards,
    Neny

    Reply
    Posted by: Neny S.
    March 14, 2013 - 12:40 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics