और सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक में प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शोधन Saccharomyces cerevisiae

Published 3/10/2012
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Biology
 

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में सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) को व्यक्त करने का प्रयास

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O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (61), e3860, doi:10.3791/3860 (2012).

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Abstract

Protocol

1. मीडिया और buffers की तैयारी

  1. YNB: एक लीटर के लिए, एमिनो एसिड और 0.77 ग्राम पूरा पूरक मिश्रण के बिना 1 एल पानी में uracil के बिना 6.9 ग्राम खमीर नाइट्रोजन आधार निलंबित. आटोक्लेव. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  2. YNBA: 400 मिलीलीटर के लिए, एमिनो एसिड के बिना 2.76 छ खमीर नाइट्रोजन आधार निलंबित करने के लिए, 0.38 ग्राम और 350 मिलीलीटर पानी में 8g जीवाणु अगर uracil के बिना पूर्ण पूरक मिश्रण. आटोक्लेव. 50 मिलीलीटर पानी और गर्मी के साथ जी 8 ग्लूकोज धीरे मिश्रण जब तक भंग. 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से Sterilise और YNBA करने के लिए जोड़ने whilst के अगर पिघला हुआ है. स्टोर कमरे के तापमान पर.
  3. 20% ग्लूकोज मध्यम: 500 मिलीग्राम, 500 मिलीग्राम YNB और गर्मी के साथ 100 ग्राम ग्लूकोज धीरे मिश्रण जब तक भंग. एक बाँझ Duran बोतल में 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं. स्टोर कमरे के तापमान पर.
  4. 20% galactose मध्यम: 2 लीटर के लिए 2l YNB और गर्मी के साथ 400 ग्राम galactose धीरे मिश्रण जब तक भंग. एक बाँझ Duran बोतल में 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं. कमरे गुस्सा पर स्टोरature.
  5. Protease अवरोध करनेवाला स्टॉक: CFTR अत्यधिक 4 proteolysis के लिए अतिसंवेदनशील है. लेखकों का पालन inhibitors proteolysis सीमित करने में प्रभावी हो सकता है, हालांकि पाठकों को इस सूची दर्जी के लिए बधाई देने के लिए अपनी आवश्यकताओं को पूरा कर सकते हैं पाया. -20 डिग्री सेल्सियस से कम 100 μl aliquots में स्टोर करने के लिए फ्रीज पिघलना समस्याओं को कम कर सकते हैं. सभी inhibitors शेयर समाधान से नीचे के रूप में काम कर एकाग्रता के लिए पतला होना चाहिए:
अवरोध करनेवाला स्टॉक एकाग्रता स्टॉक तैयार कार्य एकाग्रता
AEBSF 200 मिमी 1ml आसुत पानी में 48mg भंग 0.2 मिमी
Benzamidine 300 मिमी 1ml आसुत पानी में 36mg भंग 0.3 मिमी
Chymostatin 4 मिमी 1ml शुष्क डीएम में 2.5mg भंगअतः 4 माइक्रोन
E-64 7 मिमी 1ml आसुत पानी में 2.5mg भंग 7 माइक्रोन
Leupeptin 20 मिमी 1ml आसुत पानी में 10mg भंग 20 माइक्रोन
एक pepstatin 15 मिमी 1ml DMSO के शुष्क में 10mg भंग 15 माइक्रोन
PMSF एम 1 1ml DMSO के शुष्क में 174mg भंग 1 मिमी
  1. डीटीटी (एम 1): 154 मिलीग्राम dithiothreitol 1ml आसुत पानी में भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर Buffers में 1:1000 कमजोर पड़ने पर प्रयोग करने के लिए संकेत दिया.
  2. EDTA (0.5 एम): 100 मिली लीटर पानी के साथ मिक्स 29.22 छ ethylenediaminetetraacetic एसिड. 10 N NaOH dropwise तक EDTA के सभी भंग कर दिया है पीएच 8 तक पहुँचता है. पानी के साथ 200 मिलीलीटर अप करें और 0.2 माइक्रोन एक बाँझ Duran बोतल में फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं. स्टोर कमरे के तापमान पर.
  3. CRB (300 मिमी Tris - एचसीएल,350 मिलीलीटर पानी में पीएच 7.4, 0.56 sorbitol एम, 1 मिमी EDTA): 18.17 ग्राम Tris आधार भंग और 7.4 के अलावा एचसीएल द्वारा पीएच को समायोजित. 51.35 sorbitol जी जोड़ें और मात्रा 500 मिलीलीटर पानी के साथ श्रृंगार. आटोक्लेव. 1 मिलीग्राम EDTA स्टॉक समाधान और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस जोड़ें
  4. CFTR बफर (50 मिमी Tris, 8.0 पीएच, 10% ग्लिसरॉल v / v): 500 मिलीलीटर पानी में भंग 6.06 छ Tris आधार. 8 से एचसीएल के साथ पीएच को समायोजित करने के लिए, 100 मिलीलीटर ग्लिसरॉल जोड़ने और पानी के साथ 1 एल मेकअप. और सेल्सियस 4 में आटोक्लेव दुकान
  5. 50 मिमी (7.6 पीएच) Tris - एचसीएल, 5% ग्लिसरॉल, 5 मिमी (8.0 पीएच) EDTA, 0.02% bromophenol नीले, 4% एसडीएस, 0.05 एम डीटीटी: लोड डाई 2x. 10 मिलीलीटर, और -20 डिग्री सेल्सियस पर अशेष भाजक की दुकान

2. स्क्रीनिंग Transformants

यह प्रोटोकॉल मानता है कि खमीर GAL1 galactose प्रमोटर (Fig.1) प्लाज्मिड अनुप्रवाह में और है कि CFTR GFP-8His संलयन जीन डाला गया है प्लाज्मिड FGY217 कोशिकाओं, एक Pep4 10 S.cerevisiae के उत्परिवर्ती विलोपन में तब्दील हो गया एट अल. 10 (2008) में विस्तार से वर्णित हैं.

  1. एक परिवर्तन थाली से 5-10 अच्छी तरह से अलग कालोनियों उठाओ. एक अलग बाँझ 50 मिलीलीटर फाल्कन 9 मिलीलीटर YNB और 20% ग्लूकोज मध्यम की 1ml युक्त ट्यूब प्रत्येक कॉलोनी स्थानांतरण. इस कदम के लिए, यह महत्वपूर्ण है संस्कृति में 2% ग्लूकोज (w / v) की अंतिम एकाग्रता सेल के विकास को बनाए रखने की है. 16 घंटे के लिए रात भर rpm के 250 में 30 ° C एक कक्षीय मिलाते इनक्यूबेटर में विकसित.
  2. बनाओ जांच कालोनियों में से प्रत्येक के लिए ग्लिसरॉल स्टॉक. Aseptically लेबल पेंच शीर्ष शीशियों में 0.2 मिलीग्राम बाँझ ग्लिसरॉल, भंवर और संक्षिप्त -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस के लिए रातोंरात संस्कृतियों के 0.8 मिलीलीटर जोड़ें
  3. YNB में शेष 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए रातोंरात संस्कृतियों के 250 20% ग्लूकोज मध्यम μl सहित, पतला.इस कदम के लिए, यह संस्कृति में लगभग 0.1% (w / w) ग्लूकोज एकाग्रता को कमजोर करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि उच्च ग्लूकोज GAL1 10 प्रमोटर को दबाने कर सकते हैं. लेबल 250 मिलीलीटर Erlenmeyer में संस्कृतियों आगे बढ़ें rpm के 250, 30 ° C एक कक्षीय मिलाते इनक्यूबेटर में 0.7-0.8 की एक आयुध डिपो 600 बोतल चकित.
  4. संस्कृतियों के अलावा 5 मिलीग्राम 20% galactose प्रत्येक फ्लास्क को मध्यम से प्रेरित और 16 घंटे के लिए पर हो जाना.
  5. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग CFTR की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें. संस्कृति की 100 μl लो और 100 μl ग्लिसरॉल जोड़ने के समाधान में सेल गतिशीलता सीमा. विश्लेषण डेल्टा विजन RT बहाली खुर्दबीन (या समान) पर कोशिकाओं, FITC फिल्टर (490 एनएम और 528-538 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य) के तहत एक नीला लेजर का उपयोग. संलयन CFTR GFP प्रोटीन की सकारात्मक अभिव्यक्ति खमीर कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में प्रतिदीप्ति की एक अंगूठी के रूप में दिखाई जानी चाहिए. Untransformed खमीर कोशिकाओं को एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  6. स्थानांतरण50ml फाल्कन ट्यूबों में संस्कृतियों. Centrifugation द्वारा कोशिकाओं को एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए 3500 XG, डिग्री सेल्सियस 4 में फसल. अपकेंद्रित्र चल रहा है जबकि, पेंच बर्फ पर लगभग 500 μl एसिड धोया ग्लास मनकों और जगह से युक्त सबसे ऊपर के साथ 2 मिलीलीटर microfuge के ट्यूबों तैयार. त्यागें supernatants और 500-800 μl बहुत ठंडा CRB में प्रत्येक गोली resuspend है साथ protease inhibitors के. Microfuge मोती युक्त ट्यूबों के लिए निलंबन स्थानांतरण और बर्फ पर रख.
  7. कोशिकाओं Lyse सख्ती को मिलाते / प्रत्येक microfuge ट्यूब vortexing के 10 30 सेकंड की अवधि के लिए, समय के बीच में बर्फ पर आराम. एक beadbeater एक विकल्प के रूप में नियोजित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए BioSpec मिनी 3 मिनट के लिए संचालित beadbeater.
  8. एक benchtop microfuge और अपकेंद्रित्र में ट्यूब 5 मिनट के लिए 3500 XG, डिग्री सेल्सियस 4 पर रखें. कच्चे झिल्ली आबादी वाले बर्फ पर microfuge ट्यूबों और जगह को साफ supernatants स्थानांतरण. 500 μl ताजा बर्फ सह जोड़ेंld की CRB प्रत्येक ट्यूब protease inhibitors के साथ और इस प्रक्रिया को दोहराने के लिए झिल्ली जमा.
  9. 2 घंटे के लिए एक benchtop microfuge के में अधिकतम गति, 4 डिग्री सेल्सियस पर कताई द्वारा कच्चे तेल की झिल्ली लीजिए. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 50 μl बर्फ ठंड CFTR बफर में प्रत्येक गोली resuspend है.
  10. स्वच्छ microfuge ट्यूबों में 15 μl 2x लोड डाई के साथ pipetting और नीचे प्रत्येक निलंबन के 15 μl मिश्रण. एक 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. फोड़ा, नहीं नमूने के रूप में इस CFTR और अन्य झिल्ली प्रोटीन का कारण के के एसडीएस अघुलनशील समुच्चय के रूप में और भी GFP टैग denature जाएगा.
  11. प्लस एक 4-20% Tris / ग्लाइसिन ढाल जेल (NuSep) है पर PageRuler prestained प्रोटीन मानकों (Fermentas) के साथ नमूने लोड और चलाने के 40 मिनट के लिए 150 वी पर या जब तक सामने डाई जेल के नीचे है.
  12. जेल में प्रतिदीप्ति के द्वारा उच्चतम व्यक्त कोशिकाओं को पहचानें. जगह आंधी स्कैनर के रूप में एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली में. जेल यू स्कैन488 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में नीले रंग की लेजर और 526 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन गाना. CFTR - GFP संलयन लगभग 220 केडीए पर दिखाई जानी चाहिए. वहाँ भी एक कमजोर फ्लोरोसेंट जो शायद एक आंतरिक खमीर धुनी झिल्ली प्रोटीन युक्त 11,12 (जैसे succinate डिहाइड्रोजनेज सबयूनिट एक के रूप में) है के बारे में 70 केडीए में दिखाई बैंड होगा.
  13. Coomassie साथ जेल दाग, destain और प्रतिदीप्ति स्कैन करने के लिए एक सुविधाजनक छवि को देखने सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग तुलना के लिए जेल स्कैन. जेल Coomassie से सना हुआ कुल प्रोटीन की मात्रा जेल के प्रत्येक ट्रैक पर लोड के लिए अलग प्रतिरूप लाइनों में CFTR GFP अभिव्यक्ति के स्तर के रिश्तेदार का सामान्यीकरण के बाद मूल्यांकन करने की अनुमति देता है.
  14. उच्चतम व्यक्त इसकी ग्लिसरॉल स्टॉक (2.2) से सेल लाइन के बाहर एक ताजा YNBA के पर लकीर थाली और 2-3 दिनों के लिए सेते हैं 30 ° C पर. यह थाली तो के लिए भंडारित किया जा सकता है 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह के लिए

3. बड़े पैमाने पर किण्वक पंथउरे

  1. किण्वक के लिए पूर्व संस्कृतियों की तैयारी. YNBA से नखरेखा कक्षों की एक 1cm 2 क्षेत्र प्लेट (2.13) एक बाँझ पाश का उपयोग और 45 मिलीलीटर YNB और 5 मिलीग्राम 20% ग्लूकोज मध्यम करने के लिए जोड़ने के लिए, जैसे कि 600 आयुध डिपो लगभग 0.1 है. Rpm के 250, 30 डिग्री सेल्सियस पर 250 मिलीलीटर Erlenmeyer चकित बोतल में एक कक्षीय मिलाते इनक्यूबेटर में आयुध डिपो 600 तक 1 तक पहुँच जाता है आगे बढ़ें.
  2. दो 2 एल चकित Erlenmeyer के बीच संस्कृति विभाजित प्रत्येक युक्त 450 मिलीलीटर YNB और 25 मिलीलीटर की 20% ग्लूकोज मध्यम बोतल. पर 250 rpm के, 30 ° C एक कक्षीय मिलाते इनक्यूबेटर में जब तक 600 आयुध डिपो 1.2 तक पहुँच जाता है पर इन आगे बढ़ें.
  3. के रूप में इन पूर्व संस्कृतियों बढ़ रहे हैं, किण्वक सेट. YNB की 11.2l 1.1 में वर्णित है, लेकिन एक अतिरिक्त 8.28 छ YNB और 0.95 पूरक बाहर जी ड्रॉप करने के लिए प्रेरण पर ग्लिसरॉल के अलावा के लिए क्षतिपूर्ति भंग. Aseptically एक बाँझ 20L किण्वक पोत 11.2 एल YNB और 75 मिलीग्राम 20% ग्लूकोज मध्यम और चल तापमान को समायोजित करने के लिए30 डिग्री सेल्सियस
  4. Aseptically किण्वक precultures जोड़ने और क्रियाशीलता गति सेट लगभग 800 rpm के लिए और 30 में तापमान बनाए रखने डिग्री सेल्सियस संपीड़ित हवा के लगभग 15 3 डीएम -1 मिनट में aseptically 1.5 एल YNB 20% galactose समाधान और 1.2 एल ग्लिसरॉल जोड़कर एक बार किण्वक संस्कृति 1.2 के एक आयुध डिपो 600 तक पहुँच जाता है, प्रेरित प्रवाह चाहिए. 25 डिग्री सेल्सियस तापमान कम करने और 16 घंटे के लिए संस्कृति बढ़ने.
  5. ठंडा बर्फ पर एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर 1l अपकेंद्रित्र बर्तन में किण्वक सामग्री हस्तांतरण. Centrifugation द्वारा कोशिकाओं को एक बड़ी क्षमता रोटर (6 जैसे लीटर) में 30 मिनट के लिए 3500 XG, डिग्री सेल्सियस 4 में फसल. Protease inhibitors के साथ 150 मिलीलीटर बर्फ ठंड CRB में कोशिकाओं Resuspend के. यहाँ से 4 डिग्री सेल्सियस पर, सब काम बाहर किया जाना चाहिए
  6. 25, 30, 32, और 35 kPa 4 पास में लगातार सिस्टम सेल disrupter के माध्यम से गुजर रहा है, प्रत्येक मामले में बर्फ पर lysate संग्रह कोशिकाओं Lyse. वैकल्पिक रूप से, एक मनका Beate का उपयोग करेंएसिड धोया 0.5 मिमी ग्लास मनकों के एक बराबर मात्रा के साथ (Biospec) r और पूर्ण शक्ति पर 3 मिनट के लिए आंदोलन. 50ml फाल्कन ट्यूबों और सेल मलबे गोली centrifugation द्वारा 3500 XG, 4 ° एक benchtop अपकेंद्रित्र में 15 मिनट के लिए सी में lysate स्थानांतरण.
  7. सतह पर तैरनेवाला ठंडा अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए स्थानांतरण. हटाने के अपकेंद्रित्र को mitochondria में 30 मिनट के लिए १४००० XG, 4 ° सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र.
  8. ठंडा ultracentrifuge ट्यूब की सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. अपकेंद्रित्र एक microsomes इकट्ठा ultracentrifuge में 90 मिनट के लिए 200.000 XG, डिग्री सेल्सियस 4.
  9. ध्यान से छानना और सतह पर तैरनेवाला त्यागने और protease inhibitors के और 1mm डीटीटी के साथ प्रत्येक ट्यूब 2ml बर्फ ठंड CFTR बफर जोड़ने. धीरे प्रत्येक ट्यूब ऊपर CFTR बफर और मिश्रण एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर के साथ एक तूलिका, शीर्ष का उपयोग छर्रों resuspend.
  10. 200.000 XG, 4 ° सेल्सियस पर ultracentrifuge एक में 60 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र, 2 मिलीलीटर बर्फ ठंड CFTR बफर w में सतह पर तैरनेवाला और resuspend छर्रों त्यागेंith protease inhibitors (कोई डीटीटी) एक तूलिका का उपयोग कर.
  11. पूल resuspended microsomes, CFTR बफर के साथ 50 मिलीलीटर अंतिम मात्रा को समायोजित करने के लिए और मिश्रण अच्छी तरह से. रिजर्व एसडीएस पृष्ठ जेल के विश्लेषण के लिए एक 1 मिलीग्राम अशेष भाजक के रूप में 2.9 में वर्णित - 2.11. microsomes अब हो सकता है और तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ़्लैश फिर -80 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस तक की जरूरत है.
  12. लिथियम perfluorooctonoate (LiPFO) एसिड, tetradecanoly lyso - phosphatidylglycerol (LPG14), n-dodecyl β-डी maltoside (DDM): CFTR को निम्न डिटर्जेंट का उपयोग microsomes से निकाला जा सकता है. CFTR बफर, protease inhibitors के और 5% डिटर्जेंट (w / w) के साथ microsomes मिश्रण. यदि DDM प्रयोग किया जाता है, भी 300 बफर करने के लिए NaCl मिमी जोड़ें. एक ट्यूब अंग को घुमानेवाली पेशी पर 15 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 4 पर उत्तेजित करना.
  13. 100,000 XG, डिग्री सेल्सियस 4 ultracentrifuge एक में 1 घंटे के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला बनाए रखने और एसडीएस पृष्ठ जेल के विश्लेषण के लिए एक छोटे से अशेष भाजक ले. CFTR अब स्थिर धातु द्वारा solublised सामग्री से शुद्ध किया जा सकता हैआत्मीयता क्रोमैटोग्राफी आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा किया.

4. प्रतिनिधि परिणाम

खमीर के परिवर्तन CFTR युक्त प्लाज्मिड के साथ 100% कुशल नहीं है. परिवर्तन प्रयोग से चयनित कालोनियों में एक प्रतिनिधि लघु CFTR अभिव्यक्ति की स्क्रीन के बारे में 1 4 प्रोटीन व्यक्त कालोनियों में निकलेगा. 5 एक थाली में से चुना कालोनियों के एक स्क्रीन से एक ठेठ परिणाम छवि का एक पैनल में दिखाया गया है. 3. कालोनियों के CFTR - GFP संलयन प्रोटीन है जो आम तौर पर 250 केडीए और 130 केडीए मार्करों के बीच चलाता है, के रूप में दिखाया गया है की अभिव्यक्ति की एक मजबूत स्तर से पता चलता है. CFTR - GFP प्रतिदीप्ति स्तर काफी प्रयोगों के बीच छवि में 4 कॉलोनी के साथ अलग अलग होंगे. कम से कम 3 दिखा 70kDa के बारे में आंतरिक फ्लोरोसेंट बैंड से 10x अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति. अगर CFTR GFP की अभिव्यक्ति के स्तर को 70 केडीए बैंड से कम प्रतिदीप्ति दे दिखाई देते हैं, तो यह शायद फिर से बदलने और एक कॉलोनी को चुनने लायकCFTR GFP अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के साथ. के रूप में चित्र में दिखाया गया है. 3A, यह संभावना नहीं है,, CFTR - GFP की उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के साथ भी, कि CFTR - GFP बैंड Coomassie धुंधला द्वारा सेल निकालने में से discernable होगा.

एक बार चयनित कालोनियों बड़े पैमाने पर प्रयोग में हो गए हैं, और microsomes अलग CFTR - GFP microsomes भीतर की उपस्थिति की आवश्यकता होगी करने के लिए मूल्यांकन किया जाना है, के रूप में छवि में दिखाया गया है. 3B. इस प्रयोग के परिणाम महत्वपूर्ण है, नहीं करने के लिए अभिव्यक्ति के शामिल होने की दक्षता का आकलन केवल, लेकिन यह भी जाँच करने के लिए कर रहे हैं कि microsomes ध्यान से तैयार किया है और कि proteolysis कम से कम किया गया है. परिणाम चित्र में दिखाया गया है. 3B का मतलब है कि इस प्रयोग में अभिव्यक्ति CFTR GFP कुछ लघु पैनल ए में दिखाया प्रयोग में (के रूप में न्याय को आंतरिक 70kDa बैंड के सापेक्ष) की तुलना में कम है लेकिन यह धारणा इस प्रतिदीप्ति डिटेक्टर overexposure द्वारा पक्षपाती है माप. यह था क्योंकि प्रयोगकर्ता के checki थाCFTR निर्माण के proteolytic टुकड़े की उपस्थिति के लिए एनजी. 130 केडीए और 100 केडीए मार्करों के बीच कुछ फ्लोरोसेंट proteolytic टुकड़े के लिए इस प्रयोग में कुछ सबूत है, लेकिन इन पूर्ण लंबाई CFTR - GFP बैंड की तुलना में बहुत कमजोर हैं. Protease inhibitors के यहाँ वर्णित है, हम सेल टूटना के बाद CFTR की proteolytic गिरावट के लिए कुछ सबूत मिल जाए. यदि महत्वपूर्ण proteolysis मनाया जाता है, तो हम ताजा protease अवरोध करनेवाला स्टॉक समाधान करने की सलाह देते हैं. हम यह भी पाया गया है कि वाणिज्यिक protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल गोलियों के रूप में इस प्रणाली के लिए प्रभावी नहीं हैं. कोशिकाओं के 16 से परे विकास घंटा (बाद प्रेरण) कम CFTR अभिव्यक्ति को जन्म देने के रूप में चित्रा 4 में दिखाया जाएगा. यह शायद इस प्रोटीन का कारोबार, शायद खमीर प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण 6-9,13 मशीनरी की upregulation के कारण के कारण है. इसलिए यह उचित CFTR अभिव्यक्ति के स्तर की निगरानी, ​​galactose साथ अधिष्ठापन के बाद यदि संभव हो तो, के रूप में इष्टतम समय कोशिकाओं मा फसलवाई एक प्रयोगशाला से दूसरे भिन्न है.

चित्रा 1
आकृति 1. CFTR निर्माण युक्त प्लाज्मिड खमीर. CFTR GFP-8His के संलयन 2μ p424GAL1 अभिव्यक्ति वेक्टर में डाला जाता है, galactose प्रमोटर (GAL1) के नियंत्रण के अधीन. वेक्टर भी uracil चयन मार्कर (ura) और एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन (एएमपी) शामिल हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक कल्पना प्रोटोकॉल सारांश प्रवाह संचित्र.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिनिधि CFTR अभिव्यक्ति और शुद्धि की एसडीएस पृष्ठ जैल. पैनल से पता चलता है एक पाँच बेतरतीब ढंग से transformant कालोनियों (1-5 गलियों) है कि CFTR अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई उठाया पैनल बी microsomes दिखाता है कि एक 15l ferm से अलग थे.संस्कृति में प्रवेश पैनल सी से पता चलता है murine दो चरण आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के बाद का उपयोग कर शुद्धि के बाद प्राप्त CFTR शुद्ध. सभी जैल रोशनी शर्तों GFP डोमेन (बाएं) से और Coomassie के बाद रोमांचक प्रतिदीप्ति दाग (दाएं) के अंतर्गत दिखाए जाते हैं. आणविक भार मानकों के रिश्तेदार स्थानों बाएँ (केडीए) पर सूचीबद्ध हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4. खमीर में CFTR की अभिव्यक्ति के लिए प्रतिनिधि डेटा. पैनल galactose के साथ शामिल होने के बाद CFTR अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम को दर्शाता है. सेल अर्क एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया, और GFP प्रतिदीप्ति प्रोटीन CFTR GFP बैंड के लिए एकीकृत किया गया पैनल बी कोशिकाओं को 16 घंटे के बाद प्रेरण GFP-व्यक्त की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए विशिष्ट परिणाम से पता चलता है. आमतौर पर, केवल कोशिकाओं के एक अंश के उच्च स्तरों पर CFTR व्यक्त.

Discussion

इस कागज खमीर कोशिकाओं में murine CFTR प्रोटीन है, जो सिस्टिक फाइब्रोसिस पर अनुसंधान की सुविधा चाहिए की अभिव्यक्ति के लिए एक तरीका प्रदान करता है. उद्देश्य इस पत्र के murine CFTR डीएनए का निर्माण, जो सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (के माध्यम से उपलब्ध हो जाएगा की रिहाई के साथ लिंक है http://www.cff.org/research/CFFT/ ). अन्य orthologs बाद में उपलब्ध हो जाना चाहिए. खमीर कोशिकाओं के परिवर्तन CFTR युक्त वेक्टर साथ सीधा है, लेकिन यह कालोनियों CFTR के उच्च स्तर को व्यक्त करने के लिए स्क्रीन के लिए महत्वपूर्ण है. चर अभिव्यक्ति के स्तर को कई कारकों से उत्पन्न हो सकता है, लेकिन प्लाज्मिड प्रति सेल की प्रतियों की संख्या शायद बदलाव का एक महत्वपूर्ण डिग्री के लिए खातों. क्रिटिकल यहाँ वर्णित चरणों CFTR व्यक्त खमीर कोशिकाओं और झिल्ली माइक्रोसोमल CFTR युक्त के उत्पादन की अनुमति चाहिए. एक बार परिवर्तन, विकास, कटाई, और खमीर कोशिकाओं के सेल में महारत हासिल किया गया है, purifप्रोटीन का ication संभव होना चाहिए, और चित्रा 3 में हम पवित्रता है कि इस मामले में एक उपयोगी बेंचमार्क के रूप में प्राप्त होना चाहिए का एक उदाहरण दिया है. यह हमारा इरादा इस पांडुलिपि में प्रोटीन की शुद्धि के लिए विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान नहीं है. हालांकि, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण अनुप्रवाह शुद्धि कदम कि सेल और microsome शुद्धि जैसे S.cerevisae अभिव्यक्ति प्रणाली, के लिए विशिष्ट हैं, और इन के इस पांडुलिपि में विस्तार में शामिल किया गया है. यह उल्लेख किया जाना चाहिए, तथापि, कि दो तरीकों का इस्तेमाल किया है हम से अलग, वैकल्पिक खमीर सेल विघटन तरीकों एक फ्रेंच दबाव सेल के उपयोग के रूप में हो सकता है, नियोजित कर सकते हैं. पुनः संयोजक प्रोटीन TEV - cleavable GFP सी टर्मिनल डोमेन है कि प्रोटीन प्रेरण के बाद ट्रैक करने के लिए छवि (4) की अनुमति देता है. खमीर एक आंतरिक 70kDa (शायद 12 डिहाइड्रोजनेज succinate) प्रोटीन है कि एक ही 11 की स्थिति, और इस के तहत fluoresces एक उपयोगी अंतर प्रदान कर सकते हैंपूरे सेल अर्क या microsomes के के में CFTR के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर के लिए अंतिम अंशांकन मानक छवि (3). चित्रा 4 में दिखाया गया कि galactose के साथ शामिल होने के बाद सेल कटाई के समय महत्वपूर्ण है डेटा से स्पष्ट है. CFTR बूंद के पैदावार precipitously प्रेरण के बारे में 16 घंटे के बाद, तो है कि वहाँ मुश्किल से खमीर कोशिकाओं में शामिल के 24 घंटे के बाद किसी भी detectable CFTR है.

शुद्ध प्रोटीन की उपज 1-2mg 15 लीटर किण्वक संस्कृति के प्रति CFTR प्रोटीन के बारे में है. वसूली कुल CFTR GFP microsome चरण के लिए ऊपर प्रोटीन के बारे में 70% के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है, और शुद्ध प्रोटीन के बारे में 25% वसूली. एस के विशिष्ट वर्णन cerevisiae-व्यक्त CFTR चल रही है. के रूप में छवि में देखा. 4, सेल में प्रोटीन के स्थान प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती है. हालांकि प्रतिदीप्ति बहुत उम्मीद 10 के रूप में सेल की परिधि के आसपास पाया जाता है, प्रोटीन के कुछ कबरा स्थानीयकरण प्रदर्शित करता है या तो में, याबस जो एक देर से 14 / Golgi endosomal मार्ग या शायद ईआर से 4 परिवहन vesicles की नवोदित के एक डिब्बे के बहाव के माध्यम से रीसाइक्लिंग CFTR के कारण हो सकता है प्लाज्मा झिल्ली के अंदर. उपचार के साथ, एक एंजाइम है कि प्रोटीन deglycosylates PNGaseF, एसडीएस पृष्ठ पर CFTR प्रोटीन बैंड के प्रवास में मामूली बदलाव से पता चला जिसका अर्थ कि यह unglycosylated है, या कम से कम ग्लाइकोसिलेशन 15 है. प्रोटीन की phosphorylation राज्य पर प्रयोग चल रहे हैं. अब तक परीक्षण किया डिटर्जेंट के कुछ में, शुद्ध प्रोटीन कि पहले 2,15 प्रकाशित उन लोगों के लिए समान दर पर ATPase गतिविधि प्रदर्शित करता है (कि CFTR विशेष 16 अवरोध करनेवाला से हिचकते हैं). CFTR चैनल गतिविधि की माप शुद्ध प्रोटीन है, जो एक साबुन में एक अंतिम शोधन कदम है कि एक अपेक्षाकृत उच्च महत्वपूर्ण micelle (सीएमसी) एकाग्रता 17 मतलब होगा के पुनर्गठन की आवश्यकता होगी. खमीर containin microsomesजी CFTR कई आमतौर पर कार्यरत 18 में dodecyl maltoside 2, जो आम तौर पर 'हल्के' माना जाता है जैसे डिटर्जेंट सहित डिटर्जेंट, के साथ solublised जा सकता है. हालांकि सबसे उच्च सीएमसी डिटर्जेंट solubilsation के लिए अक्षम हो सिद्ध कर दिया है, अब तक, सुझाव है कि इन डिटर्जेंट में विनिमय किसी भी शुद्धि योजना में देर से मंच पर विचार किया जाना चाहिए.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हम अपने CFTR 3D संरचना कंसोर्टियम (अनुदान FORD08XX0 संख्या) के माध्यम से इस काम के वित्तपोषण के लिए सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (CFF) धन्यवाद. हम यह काम करने के लिए कंसोर्टियम भीतर CFTR जीनों के डिजाइन में विशेष रूप से हमारे सभी सहयोगियों का बड़ा योगदान को स्वीकार करते हैं. हम भी डीआरएस का अमूल्य योगदान को स्वीकार करते हैं. Birtley जेम्स (NCSR Demokritos, ग्रीस), मार्क (कार्डिफ विश्वविद्यालय, ब्रिटेन) युवा और काम की प्रारंभिक अवस्था में डेविड (इंपीरियल कॉलेज, लंदन, ब्रिटेन) आकर्षित किया. हम विशेष रूप से पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धन्यवाद में डा. Ina Urbatsch (टेक्सास टेक विश्वविद्यालय, Lubbock).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0410
Complete supplement mixture without uracil Formedium DCS0169
Bacteriological agar Sigma-Aldrich A5306
D-galactose Fisher BP656-500
D-glucose Fisher D16-500
Pepstatin A Sigma-Aldrich P4265
Leupeptin Merck 108975
Chymostatin Sigma-Aldrich C7268
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) Sigma-Aldrich E3132
Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) Sigma-Aldrich A8456
Benzamidine hydrochloride Sigma-Aldrich 434760
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP120500
Tris-base Formedium TRIS01
Tris-HCl Fisher P631
D-sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Glycerol Fisher 065017
NaCl Sigma-Aldrich S6191
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside Affymetrix D310S
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
PageRuler Plus prestained protein standards Fermentas SM1811
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels NuSep NB10-420
Instant Blue Coomassie Stain Novexin ISB1L
Glass beads, acid washed Sigma G8772
50ml Sterile Falcon Tubes Sarstedt 62.547.254
2ml Sterile screw-top vials Sarstedt 72.694.005
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks BD Biosciences 355119
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks BD Biosciences 355131
2ml microfuge tubes Sarstedt 72.695
0.2μM syringe filter Sartorius FC121
ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355618
centrifuge tubes Beckman Coulter 357000
1l centrifuge pots Beckman Coulter 969329
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific
Deltavision RT restoration microscope Applied Vision
Benchtop centrifuge HERMLE Z300
Benchtop microfuge Fisher 13-100-511
Vortex mixer Star Labs
Typhoon Trio Scanner GE Healthcare 63-0055-87
LAS3000 imaging system Fuji
20l fermenter vessel and control unit Applikon
Constant systems cell disrupter Constant systems
Beadbeater cell disrupter BioSpec 1107900
Mini-beadbeater-16 BioSpec 607
JA-17 rotor Beckman Coulter 369691
Optima L-100 Ultracentrifuge Beckman Coulter 392050
50.2Ti rotor Beckman Coulter 337901

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References

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