对芯片等速电泳离子的分离和纯化核酸

Bioengineering
 

Summary

等速电泳(ITP)是一个强大的电动分离和富集技术的应用范围从毒素检测样品制备。我们回顾ITP的物理原理和两个具体的例子应用,应用这种技术的方法:小分子和细胞培养裂解核酸纯化分离和检测。

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Garcia-Schwarz, G., Rogacs, A., Bahga, S. S., Santiago, J. G. On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (61), e3890, doi:10.3791/3890 (2012).

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Abstract

电动技术是一个微型应用程序,因为其独特的能力,执行各种流体和电泳过程简单,无运动部件的紧凑型系统的主食。等速电泳(ITP)是一个简单的和非常强大的电动技术,可以实现基于离子迁移的百万倍的富集1,2和高效的分离和提取,例如,我们已经证明未标记的分离和敏感的检测ITP的应用。离子分子(如毒素,DNA,rRNA基因的miRNA),很少或根本没有样品制备4-8从复杂基质中的核酸,包括细胞培养,尿液和血液的提取和纯化。9-12

ITP的实现重点和分离使用外加电场和两个缓冲区内的流体通道系统。阴离子分析物,领先的电解液(LE)的缓冲区选择小号UCH,其阴离子具有更高的有效比尾随电解质(TE)的缓冲区(有效的流动性描述观察到的离子漂移速度,并考虑到离子的电离状态,在详细介绍由Persat 等人的阴离子电泳迁移13)。建立TE和LE之间的接口后,施加电场,LE的离子移动由TE离子占据该地区。样品离子中间有效的流动性比赛提前TE的离子,但不能超越的LE离子,使他们集中在LE-TE的接口(以下简称“ITP接口”)。此外,TE和LE的形式分别低和高导电性,这建立在ITP接口的一个陡峭的电场梯度地区。这一领域的的梯度preconcentrates样本的物种,因为他们注重。正确选择的重点目标物种的净化和其他非重点物种的TE和LE结果,并最终分离ð样本物种隔离。

在这里,我们审查的物理原理基础性ITP和讨论两个标准的操作模式:“高峰期”和“高原”的模式。在繁忙的模式,相对稀释样品离子集中在窄峰重叠在ITP接口。在高原模式,更丰富的样品离子达到稳态浓度,并分隔成高原毗连区的有效流动有序。峰和高原模式出现了相同的基本物理,但分化的初步分析物的浓度和/或样本积累分配的时间代表不同的制度。

我们首先详细描述模型峰值模式实验,然后表现出对大肠杆菌核酸提取的峰值模式分析大肠杆菌细胞的培养。我们的结论提出高原模式分析,我们使用非聚焦示踪剂(NFT)的物种,以可视化的分离和每形成氨基酸的定量分析。

Protocol

1。 ITP的物理

ITP形成一个像电荷的离子之间的尖锐的移动边界。该技术可与阴离子或阳离子的样品,但我们裁缝介绍阴离子性ITP和注意的原则同样适用于阳离子性ITP。我们选择LE和TE缓冲乐离子等有较高幅度的有效电泳迁移。有效的电泳迁移率,μ= U / E的 ,是电场电子和离子的漂移速度 u之间的比例常数。我们建立一个弥漫接口之间的LE和TE和应用直接从高电场电导率乐区的低导TE区。该系统迅速建立在强电场梯度在ITP接口,由于非均匀电导率剖面。按照它的名称(从希腊语“ISOS”的意思是“平等”,“takhos”意味着“速度”)的同时,统一的VE,TE和LE的离子旅游locity,作为一个非均匀的电场和电流保护的结果(这是所谓的“ITP的条件”, 见图1)。

ITP接口的自锐性,扩散到TE区的经验,强大的恢复通量和返回的领先区(TE在LE区离子反之亦然)的LE离子。样品离子集中在这个接口,如果他们在TE区的有效流动性大于TE合作离子,如果他们在LE区的有效流动性是比LE共同离子( 见图1)少。自锐化和重点ITP的性能,有助于这一技术的鲁棒性ITP的接口(例如,由于压力驱动流或几何形状的变化,如收缩,扩张,曲折)的干扰比较敏感。

在峰值模式ITP( 见图2a和视频1-2),样品的离子浓度在任何时候都显着低于LE和TE离子的浓度,因此可以忽略不计,以促进当地电导率。样品离子的分布取决于相邻区域的自锐性接口(TE和LE)和样品的有效流动性的价值相对于这些区域14多个样品离子作为主要集中在这个狭小的ITP接口地区。叠嶂。接口和峰宽度,以及相关富集的因素,规模与 ​​电流成反比(见实验2b)14。

样品离子初始样本足够高的浓度和足够的时间积累,达到阈值浓度值。完全电离的物种,这个值决定由Kohlrausch调节功能(KRF)15弱电解质,Alberty和Jovin功能决定的。高原16,17模式,在图3视频3,样品离子的分离和净化局部均匀和恒定浓度区的有效流动确定的顺序描绘。很稀离子仍可能集中在高原区之间的峰值模式。在ITP,样品离子可以引入有限之间的TE和LE( 见图3)注射或交替TE和/或LE( 见图2)混合在一起。我们是指在TE区“半无限”注射液,可用于不断积累分析离子混合。连续采样积累增加在这两个高峰,高原模式检测的灵敏度。然而,有限的注射是较为常见的高原模式。这是可能的,因为半无限注射的初步分析物浓度高,可大大增加TE的导电性和较低的集中率。此外,全面净化没有可能在半无限注射(因为仍留插件在TE有限的浓度)。

2。设备清洗和准备

对于在本议定书提出的分析,我们使用各向同性湿式蚀刻(约D形截面)玻璃微流控芯片与跨通道的设计( 见图1)。以下的清洗和准备协议进行了优化,高硼硅和石英渠道,但也可用于玻璃/ PDMS芯片。实验之前执行此清洁程序,以确保运行运行的重复性和成功应用的需要动态涂层抑制电渗流(EOF)。此协议的遗漏可能导致在强色散ITP接口14。

  1. 为了净化渠道,填补10-20μL10%漂白的北,东,南水库,并申请在2分钟西水库的真空。如果使用标准的钳芯片球童,真空可以有效​​地应用于简单attachinĞ200μL,广角端(未筛选)枪头芯片水库和2毫米内径管的真空连接线。
  2. 清空水库和冲洗2分钟用1 M氢氧化钠的通道(如步骤1)。这轻轻的蚀刻通道的墙壁,产生一个干净的硼硅表面,以帮助建立统一的表面特性。
  3. 空水库和清洁与去离子水(DI),然后用清水冲洗通道LE〜2分钟。在此期间,表面特性和动态涂层平衡通道内。

3。在峰值模式ITP的荧光聚焦

  1. 准备1毫升LE 100毫米,200毫米TRIS盐酸,1%的PVP组成。
  2. 准备1毫升TE 100毫米肝素钠组成和200毫米TRIS。 90μLTE的结合与10μL1 mM的Alexa Fluor 488(AF488)。
  3. 与Le冲洗后第2部分中所述,空西水库和清理与DI几次或为了淡化任何勒留在水库。 20微升TE含有AF488填补这个水库。
  4. 在东水库将正极和地面(负)​​在西藏的电极和申请2μA(恒流)。样本高峰将在一个恒定的速度从西藏东水库(见图1)和低电导率的TE填补了通道,这些水库之间的电压会增加迁移。

4。从培养大肠杆菌核酸提取和纯化大肠杆菌

能够有选择性地集中离子物种ITP理想的生物样品制备技术。我们来自未经处理的细胞裂解物的核酸,通过选择有效调动幅度低于目标核酸,但高于合作离子PCR抑制剂(如阴离子洗涤剂,蛋白质,有机溶剂,即使在HI后负离子净化GH浓度)。阳离子PCR抑制剂(如碱金属和阳离子蛋白和洗涤剂)在相反的方向迁移,所以也留下。 ITP的提取样品水库和重点目标核酸,而离开较慢的PCR抑制物种的背后( 见图4)。

  1. 获取的样品或文化E.密度大于10 8 CFU / mL的大肠杆菌细胞。
  2. 转移到一个安全锁的离心管和沉淀,离心4000克6分钟1毫升细胞培养。
  3. 重悬沉淀在80μL无RNase的水,并添加10μL甘氨酸10毫米,10毫米之二 - 三,2毫米EDTA,0.1%的Triton-X的,5毫克/毫升溶菌酶溶解剂组成。轻轻混匀,静置5分钟。在室温(裂解协议适应Bercovici 。11)。
  4. 加入10μL1 M氢氧化钠提高裂解液的pH值〜12.5。轻轻开动移液器上下,直到解决方案变得清晰,在这一点溶藻是完整的。
  5. 结合10μL裂解液90μL的50 mM的甘氨酸和100毫米之二 - 三。该解决方案现在可以被用来作为TE。
  6. 准备1毫升勒BIS-TRIS,500毫米250毫米盐酸,1%的PVP和1X的SYBR Green II组成。填写与LE微流控芯片在第3部分所述。
  7. 以片分析中提取纯化核酸的ITP患者后,取代了PCR兼容勒东水库的内容,含有50MM之二 - 三,25毫米盐酸,0.1%PVP。申请V至1000之间的东,西井开始实验。这些水库之间的电流将减少。
  8. 在实验结束后的样品洗脱进入LE水库。与此洗脱重合,此系统的电流随时间通常到达高原值(因为阻力现在TE的离子通道内均匀分布为主)。轻轻混匀水库由内容重复移液和提取定量RT-PCR进行分析5μL的体积。

5。氨基酸分离与的阳离子高原模式ITP和非重点示踪剂(NFT)的可视化

ITP的可用于分离和集中到毗邻和检测之间的TE和LE高原小离子。这可以根据当地的导电性,紫外吸收,温度传感,折射率,理化性质,如检测和鉴定。在这里,我们展示一个非重点示踪法(NFT)的荧光,合作离子物种被添加到了LE。这种荧光物种不集中,但其浓度适应当地的电场,从而使可视化纯化的高原区( 见图5)。

  1. 准备1毫升LE组成的100毫米乙醇胺,甘氨酸200毫米,1%PVP,阳离子荧光罗丹明6G 100微米。
  2. <李>准备1毫升TE TRIS 20毫米,40毫米甘氨酸组成。准备通过混合90μL的TE 10μL50 mM的精氨酸,赖氨酸和50毫米的样本。
  3. 免除20μL在西方LE和北东水库的水库和样品。申请在南水库1分钟的真空。
  4. 冲洗东DI和TE(无样品TE)的更换。
  5. 申请500之间的东,西水库至五。

6。代表结果

我们在图2b图4中的核酸提取实验显示isotachopherograms峰值模式实验。荧光记者(如AF488的SYBR Green II)峰值模式实验中,整体的荧光强度可以集成和比对校准曲线获得定量的浓度信息。12此外,核酸提取实验中,样品被允许以洗脱到T他乐水库和提取与分析移液器定量RT-PCR。10,12,我们发现在图5中的氨基酸分离高原模式isotachopherograms。荧光强度(LE或TE区强度相对),可用于区域识别,同时区的宽度,使定量。

图1。
图1。等速电泳(ITP)是一种用于微流体应用离子敏感的检测和分离技术在电动。 ITP患者提供了分离,选择性聚焦和富集能力。此外,它是非常强大,因为其自锐性,物理干扰不敏感。样品离子选择性集中之间的领先(LE)和尾随电解质(TE)和通过微旅行恒定速度在LE区的领先离子的速度决定。样品离子集中被包围的LE和TE离子的有效流动,如果其有效电泳迁移。原理图描绘了一个模型ITP的实验样品重点不断之间的LE和TE区。

图2。
图2。在“高峰模式”ITP的稀释样品离子的焦点。一)两种截然不同的稀(C 样品 << C LE)的物种在繁忙的LE和TE区之间形成的界面模式的重点。仅LE和TE确定的电场,样品物种不显着贡献当前。样品离子与TE(半无限注射)混合,并集中在大致高斯峰在ITP接口。注重标准(不平等所示)适用于强电离物种的。 B)应用电流范围为重点的实验显示的Alexa Fluor 488(AF488)(也见至五峰值模式IDEO 1)。样品峰宽成反比,电流(由于电渗流可以忽略不计的对流弥散)14自锐的界面是耐压力驱动流( 视频2)由于色散。

图3。
图3:在足够高浓度的重点,在“高原模式”的样品离子和支配当地的导电性。我们通常在有限注射TE和LE之间引入样品离子。在这种方式中,样品离子分开,以便根据其有效的电泳迁移率(见视频3)。对于强烈电离物种,TE和高原区浓度确定由Kohlrausch调节功能(KRF,最初由LE区不变集)。稀离子继续集中在峰值模式之间的高原地带包围的有效流动。重点Çriterion(不平等所示)适用于强电离物种。

图4。
图4。裂解物具有峰值模式ITP的编制和核酸提取。从大肠杆菌中提取核酸大肠杆菌细胞培养使用溶菌酶辅助碱溶藻和选择性电泳纯化, 通过 ITP的重点。与裂解液混合的TE(棕色)包含目标(绿色)核酸,蛋白质,和潜在的PCR抑制化学。适当的选择,使落后和领先的离子选择性靶核酸的重点,同时离开落后PCR抑制剂。总核酸ITP的高峰,往往需要在一个非理想的形状,显示在这里的插图形象。由于此法的示范,我们总核酸提取革兰氏阴性菌, 大肠杆菌 (单独用氢氧化钠溶液溶解),纯化从裂解NA使用ITP的,收集提取的遗传物质,并进行定量RT-PCR分析,以验证成功纯化的16S rRNA(红色),并从细菌培养的16S rDNA(绿色)。阴性对照周期为16S rRNA基因(蓝色)和16S rDNA(黄色)的阈值以上,每30个循环。我们进行了定量RT-PCR使用电力的SYBR Green的RNA-C T 1步套件从150纳米(5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG)和反向(5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC的)引物,在推荐的热循环条件下,应用生物系统公司。

图5。
图5。非重点示踪剂(NFT)的检测,未标记的氨基酸的分离和检测。 NFT的检​​测示意图)。有限的样品离子注入引入的东通道。混合阳离子荧光示踪,有效的流动性比TE离子(μ 示踪的TE)的LE。的荧光是说作为示踪underspeeding“。作为荧光团的LE electromigrates到样品高原和TE现在占领的区域,它经历了一个更高的电场,从而其浓度的增加。这种浓度的变化创建的isotachopherogram的步骤。 B)分离两种氨基酸,精氨酸和赖氨酸,使用罗丹明6G的荧光示踪underspeeding NFT的检​​测。在ITP轻微高峰之间的TE和精氨酸是常见的,还不是很清楚,这里不干扰检测或量化的高原。

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Discussion

ITP的方法介绍,在这里能够快速,灵敏,可靠的检测和处理的离子分子。在使用ITP的主要挑战是LE和TE缓冲液的正确选择。在阴离子ITP的,我们通常选择为主导的阴离子氯化物,因为它是一个具有绝对的流动性非常高的强酸,因而具有非常可预测的性能。因此,选择适当的TE和反离子缓冲阴离子ITP的选择通常是减少。选择性重点实验,TE的选择是至关重要的污染离子的排除。 TE的有效流动性较低的应用中是不存在的地方污染物,导致更快的对焦速度。我们建议使用以下,相对乖巧TE的阴离子离子:制造执行系统,公开资讯观测站,肝素钠,甘氨酸。反离子的选择影响体系的pH值和TE的有效流动。共同反三(PKA 8.1)和二,三(PKA 6.4)。对于要求较低或较高的pH值的检测,我们建议吡啶(PKA 5.25)和乙醇胺(PKA 9.5),分别。 表1表2,阴离子和阳离子ITP的分别,我们总结了几个有用的缓冲区的例子。我们以阴离子LE阳离子LE离子钠离子和盐酸,我们假设100毫米离子强度的LE缓冲区。

读者会注意到,在我们的协议缓冲液的离子强度( 表1-2)总是大于或等于10毫米。虽然在ITP的物理学理论应用于离子强度低于10毫米,近1毫米级的天然污染物(如碳酸之间的水和大气中二氧化碳含量的反应),往往限制在低离子强度缓冲的实际使用。

我们注意到,信号转导机制并不仅限于在本协议中的检测。作为第5部分,在高原纯净区模式,简要讨论,可以通过在当地电导率的变化,紫外线absor检测bance,温度,或折射率。在我们自己的小组中,我们已经开发出一种方法,利用荧光载体两性电解质敏感的检测和鉴定未知的待测。5在峰值模式试验,特异性探针,可以用来标记重点分析物。举一个例子,我们使用分子信标-寡核苷酸探针-荧光他们的目标序列杂交后的检测具有高度特异性的靶DNA或RNA分子11,18。

虽然ITP是相对强劲的分散造成的压力驱动流和EOF,EOF的过度可导致ITP接口,平均EOF速度成为ITP的速度等于停滞。14这种强烈的EOF发生,尤其是在高pH值条件和低离子强度。出于这个原因,我们建议使用100毫米的订单,如果方便的缓冲区pH值8或更低和离子强度。根据我们的经验,PVP是最有效的抑制硼硅芯片的EOF的涂层。然而,由于其筛分性能,PVP的可能不适合的一些应用,如基因组DNA对焦。在实验中,我们观察到,PVP的加入可以大大减少基因组DNA的绝对移动(点不集中)。醇基涂料在这些情况下,如在表面活性剂(如海卫X-100)一起选择Sigmacote还可以有效地减少的EOF 10。

TE的阴离子(PKA -1)
缓冲反离子(PKA +1) MES(6.10) 公开资讯观测站(7.20) 肝素钠(7.50) 甘氨酸(8.15)
乙醇胺(9.50) 21.41 20.40 17.38 22.85
三(8.08) 21.00 19.23 </ TD> 15.84 17.56
BIS-TRIS(6.40) 18.22 10.41 7.30 5.23
吡啶(5.18) 1.01 3.72 2.42 1.48

表1。有效的移动幅度调整中阴离子ITP纯待测区LE是100毫米盐酸和200毫米的缓冲反离子(×10-92 / V / S)。

TE的阳离子(PKA +1)
缓冲反离子(PKA -1) 乙醇胺(9.50) 三(8.08) BIS-TRIS(6.40) 吡啶(5.18)
MES(6.10) 35.57 21.96 16.39 10.45
莫PS(7.20) 35.47 20.92 9.76 3.93
肝素钠(7.50) 35.35 19.97 7.77 2.88
甘氨酸(8.15) 34.77 16.72 4.50 1.44

表2。有效的移动幅度调整阳离子ITP纯分析物区(×10-92 / V / S)的LE是钠100毫米和200毫米的缓冲反离子。

Disclosures

我们什么都没有透露。

Acknowledgments

我们衷心感谢DARPA赞助的微/纳米射流基础焦点(MF3)根据合同编号N66001-10-1-4003,中心的资金和从DARPA的批N660001-09-C-2082。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 10977 RNase/DNase free
Clorox Ultra Clorox 02489CT
sodium hydroxide (NaOH) Mallinckrodt Baker Inc. 7708
hydrochloric acid (HCl) EMD Millipore HX0603-4
Trizma base (tris) Sigma-Aldrich T6066
polyvinylpyrrolidone (PVP) Polysciences, Inc. 06067 MW 1,000,000
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Alexa Fluor 488 carboxylic acid Invitrogen A20000
tricine Sigma-Aldrich T-9784
bis-tris Sigma-Aldrich B4429
EDTA GIBCO, by Life Technologies AM9260G
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
SYBR Green II Invitrogen S7564
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000
Rhodamine 6G Acros Organics CAS 989-38-8
L-Amino Acids Sigma-Aldrich LAA21
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit Applied Biosystems 4389986
PCR primers Integrated DNA Technologies
Borosilicate microfluidic chip Caliper Life Sciences NS12A Supplied with or without plastic caddy
Vacuum pump Gast Manufacturing, Inc. DOA-P104-AA
Sourcemeter Keithley 2410 Constant current and constant voltage operation modes
Inverted epifluorescent microscope Olympus Corporation IX70 Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination
Filter cube Omega Engineering, Inc. XF115-2 Excitation/emission: blue/green
Safe-lock microcentrifuge tubes Eppendorf 022363204 1.5mL capacity
Centrifuge Eppendorf 5417C
Table 3. Specific reagents and equipment.

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References

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