On-chip Isotachophorese für Separierung von Ionen und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Bioengineering
 

Summary

Isotachophorese (ITP) ist eine robuste elektrokinetischen Trennung und Anreicherungstechnik mit Anwendungen, die von Toxinnachweis zu Probenvorbereitung. Wir prüfen die physikalischen Grundlagen der ITP und die Methodik der Anwendung dieser Technik auf zwei konkrete Anwendungsbeispiele: Trennung und Detektion von kleinen Molekülen und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Zellkultur-Lysat.

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Garcia-Schwarz, G., Rogacs, A., Bahga, S. S., Santiago, J. G. On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (61), e3890, doi:10.3791/3890 (2012).

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Abstract

Elektrokinetischen Techniken sind ein Grundnahrungsmittel der mikro-Anwendungen aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit, eine Vielzahl von fluidischen und elektrophoretische Prozesse in einfache, kompakte Systeme ohne bewegliche Teile durchführen. Isotachophorese (ITP) ist eine einfache und sehr robust elektrokinetische Technik, die Millionen-fache Anreicherung 1,2 und effiziente Trennung und Extraktion auf Ionenbeweglichkeit Basis erreichen können. 3 Zum Beispiel haben wir die Anwendung der ITP zu Trennung und sensitiven Nachweis von unmarkiertem demonstriert ionischen Molekülen (z. B. Toxine, DNA, rRNA, miRNA) mit wenig oder gar keine Probenaufbereitung und 08.04 bis Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus komplexen Matrices einschließlich der Zellkultur, Urin und Blut. 9-12

ITP erzielt Fokussierung und Trennung unter Verwendung eines angelegten elektrischen Feldes und zwei Puffer innerhalb eines fluidischen Kanal-System. Für anionische Analyten, ist der führende Elektrolyten (LE) Puffer gewählt such, dass die Anionen höhere effektive elektrophoretische Mobilität als die Anionen des hinteren Elektrolyten (TE)-Puffer (Effektive Mobilität beschreibt die beobachtbaren Driftgeschwindigkeit eines Ions und berücksichtigt die Ionisierung Zustand des Ions, wie ausführlich von Persat et al haben . 13). Nach Einrichtung einer Schnittstelle zwischen dem TE und LE, wird ein elektrisches Feld angelegt, so dass LE Ionen weg von der Region von TE-Ionen besetzt. Probenionen der mittleren effektiven Mobilität Rennen vor TE-Ionen, aber nicht überholen können LE-Ionen, so daß sie an der LE-TE-Schnittstelle (im Folgenden als "ITP-Schnittstelle") zu fokussieren. Ferner wird der TE und LE Form von Regionen bzw. niedriger und hoher Leitfähigkeit, die einen steilen Gradienten des elektrischen Feldes an der ITP-Schnittstelle zu etablieren. Diese Feldgradienten Vorkonzentrate Probe Spezies, wie sie zu konzentrieren. Die richtige Wahl der TE und LE führt zu konzentrieren und Reinigung von Zielarten aus anderen Nicht-fokussierte Arten und schließlich die Trennung eind Trennung der Probenspezies.

Wir überprüfen hier die physikalischen Grundlagen ITP und diskutieren zwei Standard-Betriebsarten: "Peak" und "Plateau"-Modi. Im Peak-Modus, relativ verdünnte Proben-Ionen konzentrieren gemeinsam innerhalb überlappenden schmalen Peaks bei der ITP-Schnittstelle. In Plateau-Modus, erreichen häufiger Probeionen eine stationäre Konzentration und trennen in angrenzende Plateau-Zonen, die durch ihre effektive Mobilität bestellt. Peak-und Plateau-Modi ergeben sich aus den gleichen zugrunde liegenden Physik, sondern stellen verschiedene Regimes durch die anfängliche Analytkonzentration und / oder der Höhe der Zeit für die Probe zugeteilt Akkumulation unterschieden.

Wir erstmals im Detail ein Modell Peak-Modus Experiment beschreiben und dann zeigen, Peak-Modus-Assay für die Extraktion von Nukleinsäuren aus E. coli Zellkultur. Wir schließen daraus, durch die Vorlage eines Plateau-Modus-Test, wo wir eine Nicht-Fokussierung Tracer (NFT) Arten, die Trennung zu visualisieren und nutzen probilden Quantifizierung von Aminosäuren.

Protocol

1. Physik der ITP

ITP bildet eine scharfe Grenze zwischen sich bewegenden Ionen gleicher Ladung. Die Technik kann mit anionischen oder kationischen Proben durchgeführt werden, aber wir passen diese Einführung in anionischen ITP und beachten Sie die gleichen Grundsätze gelten für kationische ITP. Wir wählen LE und TE-Puffer, so dass LE-Ionen höherer Größenordnung effektive elektrophoretische Mobilität haben. Die effektive elektrophoretische Mobilität, μ = U / E, ist die Proportionalitätskonstante zwischen angelegten elektrischen Feldes, E und Ionendriftgeschwindigkeit U. Wir 13 eine diffuse Schnittstelle zwischen dem LE und TE zu etablieren und ein elektrisches Feld aus dem High-Regie Leitfähigkeit LE Zone der geringen Leitfähigkeit TE Zone. Das System schnell für einen starken Gradienten im elektrischen Feld an der ITP-Schnittstelle, durch die nicht-einheitliche Leitfähigkeit Profil. Gemäß ihrem Namen (aus dem Griechischen, "isos" bedeutet "gleich", "takhos" bedeutet "Geschwindigkeit"), TE und LE-Ionen wandern zur gleichen, einheitlichen velocity, als Folge der nicht-einheitliches elektrisches Feld und die Erhaltung der aktuellen (dies ist die sogenannte "ITP Zustand" ist, siehe 1).

Die ITP-Schnittstelle wird selbstschärfende: LE-Ionen, dass in die TE-Zone diffundieren Erfahrung eine starke Wiederherstellung Fluss und kehren Sie zum führenden Zone (und umgekehrt für die TE-Ionen in der LE-Zone). Probenionen an dieser Schnittstelle zu konzentrieren, wenn die effektive Mobilität in der TE-Zone größer als die der TE Co-Ionen, und wenn die effektive Mobilität im LE-Zone geringer ist als die der LE Co-Ionen (siehe 1). Die Selbst-Schärfen und Fokussierung Eigenschaften von ITP tragen zur Robustheit dieser Technik machen und ITP relativ unempfindlich gegen Störungen des Interfaces (zB aufgrund von Druck-driven flow oder Veränderungen in der Geometrie, wie Kontraktionen, Erweiterungen und Wendungen).

Im Peak-Modus ITP (siehe Abbildung 2a und Videos 1-2), sind Probe Ionenkonzentrationenzu jeder Zeit deutlich niedriger als LE und TE-Ionen-Konzentrationen und daher vernachlässigbar zur lokalen Leitfähigkeit. Die Verteilung der Probenionen durch die selbstschärfend Schnittstelle zwischen benachbarten Zonen (hier die TE und LE) und dem Wert der Probe wirksamen Beweglichkeit relativ zu diesen Zonen bestimmt. 14 Mehrere Probenionen innerhalb der gleichen schmalen ITP-Schnittstelle Region konzentrieren als weitgehend überlappenden Peaks. Die Schnittstellen-und Peak-Breiten, sowie die damit verbundene Anreicherung Faktor, Maßstab invers mit dem angelegten Strom (siehe Experimente in Abbildung 2b). 14

Für ausreichend hohe Konzentrationen Erstmuster und ausreichende Anhäufung Zeit erreichen Probeionen eine Schwellenkonzentration Wert. Für vollständig ionisierte Spezies, wird dieser Wert durch den Kohlrausch regulierende Funktion (KRF) bestimmt. 15. Für schwache Elektrolyte, es von den Alberty und Jovin Funktionen bestimmt wird. 16,17 in PlateauModus, wie in Abbildung 3 und Video 3, Proben-Ionen zu trennen und in Zonen von lokal gleichmäßige und konstante Konzentration in einer Reihenfolge durch ihre effektive Mobilität bestimmt reinigen dargestellt. Sehr verdünnte Ionen können immer noch in Peak-Modus zwischen Plateau Zonen konzentrieren. In ITP, kann Proben-Ionen in einer endlichen Injektion zwischen dem TE und LE (siehe Abbildung 3) eingeführt werden oder alternativ zusammen mit dem TE und / oder LE (siehe Abbildung 2) gemischt. Wir beziehen sich auf das Mischen in der TE-Zone als "semi-infinite" Injektion verwendet werden, um die Analyt-Ionen kontinuierlich sammeln kann. Continuous Sample Akkumulation erhöht die Empfindlichkeit sowohl in Peak-und Plateau-Modus Assays. Allerdings sind endlich Injektionen häufiger in Plateau-Modus. Dies ist wahrscheinlich, weil hohe Anfangsinvestitionen Analytkonzentrationen in semi-infiniten Injektion erheblich steigern können TE Leitfähigkeit und niedriger Schwerpunkt Raten. Außerdem ist voll Reinigung nicht in semi-infiniten Injektion möglich (da es remaIns eine endliche Konzentration in TE).

2. Geräte-Reinigung und Vorbereitung

Für die Tests in diesem Protokoll vorgestellt verwenden wir isotrop nassgeätzt (etwa D-förmigen Querschnitt) Glas-Mikrofluidik-Chips mit einem Cross-Channel-Design (siehe Abbildung 1). Die folgende Reinigung und Herstellung Protokoll für die Mäntel und Quarzglas Kanäle optimiert, kann aber auch mit Glas / PDMS-Chips verwendet werden. Führen Sie diesen Reinigungsvorgang vor Experimenten zu laufen-to-run Wiederholbarkeit und erfolgreiche Anwendung von dynamischen Beschichtungen benötigt, um elektroosmotischen Fluss (EOF) zu unterdrücken, zu gewährleisten. Das Weglassen dieses Protokoll kann in starken Streuung der ITP-Schnittstelle führen. 14

  1. Um den Kanal zu dekontaminieren, füllen Sie den Norden, Osten, Süden und Reservoirs mit 10-20 ul von 10% Bleichmittel und gelten Vakuum an der West-Reservoir für 2 min. Wenn über einen Standard-Chip Caliper Wechselrahmen, kann Vakuum effektiv, indem Sie einfach attachin angewendet werdeng das breite Ende einer 200 ul (ungefilterten) Pipettenspitze mit dem Chip Reservoir und Verbinden der Vakuumleitung an einer 2 mm Innendurchmesser Rohr.
  2. Leeren Sie den Behälter und spülen Sie den Kanal (wie in Schritt 1) ​​mit 1 M Natronlauge für 2 min. Dieser sanft ätzt die Kanalwände, was eine saubere Oberfläche zu helfen, Borosilicatglas einheitliche Oberflächeneigenschaften.
  3. Leeren Sie den Behälter und sauber und mit deionisiertem Wasser (DI), dann spülen Sie den Kanal mit LE für ~ 2 min. Während dieser Zeit Oberflächeneigenschaften und dynamischen Beschichtungen innerhalb des Kanals ins Gleichgewicht.

3. Fluorophor Schwerpunkt im Peak-Modus ITP

  1. Planen 1 ml LE, bestehend aus 100 mM HCl, 200 mM Tris und 1% PVP.
  2. Planen 1 ml TE, bestehend aus 100 mM HEPES und 200 mM Tris. Kombinieren Sie 90 ul TE mit 10 ul 1 pM Alexa Fluor 488 (AF488).
  3. Nach dem Spülen mit LE wie beschrieben in Teil 2, leeren Sie den West-Reservoir und reinigen Sie ein paar Mal mit DI in oderder zu verdünnen jede LE noch im Reservoir. Füllen Sie dieses Reservoir mit 20 ul TE mit AF488.
  4. Legen Sie die positive Elektrode im Osten Reservoir und den Boden (negativen) Elektrode in der West-Reservoir und 2 gelten uA (Konstantstrom). Die Probe wird Peak bei einer konstanten Geschwindigkeit von Westen nach Osten Reservoir Reservoir (siehe Abbildung 1) und die Spannung zwischen dieser Lagerstätten erhöhen, da der geringere Leitfähigkeit TE füllt den Kanal zu migrieren.

4. Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus kultivierten E. coli

Die Fähigkeit zur selektiven Fokus Ionenarten macht ITP eine ideale Technik für biologische Probenaufbereitung. Wir Aufreinigung von Nukleinsäuren aus unbehandelten Zell-Lysat durch die ein hinteres Anion mit einer effektiven Mobilität Größenordnung niedriger als der Ziel-Nukleinsäure, aber höher als Co-ionischen PCR-Inhibitoren (zB anionische Detergenzien, Proteinen und organischen Lösungsmitteln, auch wenn in HalloGH-Konzentration). Kationische PCR-Inhibitoren (zB Alkalimetalle und kationische Proteine ​​und Detergenzien) in die entgegengesetzte Richtung wandern und sind somit ebenfalls zurückgelassen. ITP extrahiert und konzentriert sich Zielnukleinsäuren aus dem Probenbehälter, wobei aber langsamer PCR-inhibierenden Spezies hinter (siehe Abbildung 4).

  1. Besorgen Sie sich eine Probe der Kultur oder E. coli-Zellen auf eine Dichte größer als 10 8 CFU / ml.
  2. 1 ml Zellkultur in einen Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhrchen und Pellet durch Zentrifugation bei 4000g für 6 min.
  3. Resuspendieren Sie das Pellet in 80 ul RNase-freies Wasser und fügen Sie 10 uL Lysemittels bestehend aus 10 mM Tricin, 10 mM Bis-Tris, 2 mM EDTA, 0,1% Triton-X, und 5 mg / ml Lysozym. Vorsichtig mischen und inkubieren Sie für 5 Minuten. bei Raumtemperatur (Lysieren Protokoll von Bercovici et al ausgebildet. 11).
  4. Fügen Sie 10 ul 1 M Natronlauge auf pH-Wert des Lysats auf ~ 12,5 zu erhöhen. Vorsichtig betätigen Sie die Pipette auf und ab, bisdie Lösung klar wird, wobei an diesem Punkt Lyse abgeschlossen ist.
  5. Kombinieren Sie 10 ul Lysat mit 90 ul 50 mM Tricin und 100 mM Bis-Tris. Diese Lösung kann nun als TE verwendet werden.
  6. Planen 1 ml LE, bestehend aus 500 mM bis-Tris, 250 mM HCl, 1% PVP und 1X SYBR Green II. Füllen Sie den Mikrofluidik-Chip mit LE wie in Teil 3 beschrieben.
  7. Um die gereinigte Nukleinsäure für Off-Chip-Analyse zu extrahieren nach ITP, ersetzt den Inhalt des Reservoirs Osten mit einem PCR-kompatiblen LE, enthaltend 50 mM Bis-Tris, 25 mM HCl und 0,1% PVP. Bewerben 1000 V zwischen Ost und West Brunnen, um das Experiment zu beginnen. Der Strom zwischen diesen Lagerstätten nimmt ab.
  8. Am Ende des Experiments die Probe eluiert in das Reservoir LE. Gleichzeitig mit dieser Elution, die derzeitige Abhängigkeit von der Zeit für dieses System in der Regel erreicht ein Plateau-Wert (da jetzt Widerstand wird durch TE-Ionen gleichmäßig im Kanal verteilt dominiert). Vorsichtig mischen das ReservoirInhalt durch wiederholtes Pipettieren und extrahieren Sie eine 5-ul-Volumen für die Analyse durch quantitative RT-PCR.

5. Trennung von Aminosäuren mit kationischen Plateau-Modus ITP und nicht fokussierenden Tracer (NFT) zur Visualisierung

ITP kann verwendet werden, zu trennen und zu konzentrieren kleinen Ionen in angrenzende und nachweisbar Plateaus zwischen dem TE und LE werden. Dies ermöglicht die Erkennung und Identifizierung auf der Basis physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie z. B. lokale Leitfähigkeit, UV-Absorption, Temperaturerfassung oder Brechungsindex. Hier zeigen wir eine nicht fokussierenden Tracer (NFT) Assay, wobei eine fluoreszierende, Co-ionischen Spezies der LE zugegeben wird. Das fluoreszierende Spezies nicht konzentrieren, sondern seine Konzentration passt zu einem lokalen elektrischen Feldes und damit ermöglicht die Visualisierung von gereinigtem Plateau Zonen (siehe Abbildung 5).

  1. Bereiten Sie 1 mL LE, bestehend aus 100 mM Ethanolamin, 200 mM Tricin, und 1% PVP und 100 uM des kationischen Fluorophor Rhodamin 6G.
  2. <li> Prepare 1 ml TE bestehend aus 20 mM Tris, 40 mM Tricin. Bereiten Probe durch Mischen von 90 ul TE mit 10 ul jeder der 50 mM Arginin und 50 mM Lysin.
  3. Dispense 20 uL LE in der West-und Nord Stauseen und Probe in der Ost-Reservoir. Bewerben Vakuum bei Süd Reservoir für 1 min.
  4. Spülen Sie den Osten gut mit DI und ersetzen mit TE (TE ohne Probe).
  5. Bewerben 500 V zwischen Ost und West Stauseen.

6. Repräsentative Ergebnisse

Wir zeigen isotachopherograms Peak-Modus von Experimenten in der 2b und Nukleinsäure-Extraktion Experimente in Abbildung 4. Im Peak-Modus Experimenten mit einem fluoreszierenden Reporter (zB AF488, SYBR Green II), den gesamten Fluoreszenzintensität integriert und gegen eine Kalibrationskurve, quantitative Informationen zu erhalten Konzentration verglichen werden. 12, die zusätzlich in Nukleinsäureextraktion Experimenten wird die Probe erlaubt, zu eluieren in ter LE Reservoir extrahiert und mit einer Pipette zur Analyse durch quantitative RT-PCR. 10,12 Wir zeigen, Plateau-Modus isotachopherograms für Aminosäure Trennung in Abbildung 5. Fluoreszenz-Intensität (bezogen auf LE oder TE Zone Intensität) kann für die Zone Identifikation verwendet werden, während Zonenbreiten ermöglichen Quantifizierung.

Abbildung 1.
Abbildung 1. Isotachophorese (ITP) ist eine elektrokinetische Technik in mikrofluidischen Anwendungen für die sensitive Detektion und Separation von Ionen verwendet. ITP bietet Trennung, selektive Fokussierung, und Anreicherung Fähigkeiten. Darüber hinaus ist es äußerst robust und unempfindlich gegen physische Störungen wegen seiner selbstschärfend Natur. Beispiel Ionen selektiv zwischen einem vorderen (LE) und die hintere Elektrolyten (TE) und wandern durch den Mikrokanal mit einer konstanten Geschwindigkeit von der Geschwindigkeit der Ionen in der führenden Zone bestimmt LE konzentrieren. Probeionenkonzentrieren, wenn ihre effektive elektrophoretische Mobilität durch die effektive Mobilität der LE und TE-Ionen geklammert wird. Das Schema zeigt ein Modell ITP Experiment, bei dem Probe fokussiert kontinuierlich zwischen der LE und TE-Zonen.

Abbildung 2.
Abbildung 2. Verdünnen Probeionen Fokus in "Peak-Modus" ITP. a) Zwei verschiedene verdünnte (c << Probe c LE)-Spezies Schwerpunkt Peak-Modus an der Grenzfläche zwischen dem LE und TE Zonen gebildet. Lediglich die LE und TE bestimmen das elektrische Feld, wie Probenspezies nicht wesentlich zur aktuellen beitragen. Probenionen sind, gemischt mit TE (in einem semi-infiniten Injektion) und sich gemeinsam in einer etwa Gauß-Peak bei der ITP-Schnittstelle. Die Fokussierung Kriterium (dargestellt als Ungleichheiten) gilt für stark ionisierten Spezies. b) Die Experimente zeigen, Alexa Fluor 488 (AF488) im Peak-Modus für eine Reihe von angelegten Ströme fokussiert (siehe auch Video 1). Beispiel Peakbreite ist umgekehrt proportional zum Strom (für vernachlässigbar advektiven Dispersion aufgrund des elektroosmotischen Flusses). 14 Die Selbst-Schleifen-Schnittstelle ist beständig gegen Dispersion durch Druck-Grundwasserströmung (siehe Video 2).

Abbildung 3.
Abbildung 3. Probeionen bei einer ausreichend hohen Konzentration im Fokus "Plateau-Modus" und regieren lokale Leitfähigkeit. Wir stellen in der Regel Proben-Ionen in einer endlichen Injektion zwischen dem TE und LE. In dieser Modalität, Proben-Ionen getrennt und damit entsprechend ihrer effektiven elektrophoretischen Mobilität (siehe Video 3). Bei stark ionisierten Arten sind die TE-und Plateau-Zone Konzentrationen durch den Kohlrausch regulierende Funktion (KRF, eine invariante Menge zunächst von der LE-Zone) ermittelt. Verdünnten Ionen weiterhin in Peak-Modus zwischen Plateau Zonen Bracketing ihre effektive Mobilität konzentrieren. Die Konzentration criterion (dargestellt als Ungleichheiten) gilt für stark ionisierten Spezies.

Abbildung 4.
Abbildung 4. Lysatpräparat und Nukleinsäure-Extraktion mit Peak-Modus ITP. Nucleinsäure ist aus E. extrahiert coli-Zellkultur mit Lysozym-unterstützte alkalische Lyse und gereinigt durch selektive elektrophoretische Fokussierung über ITP. TE mit Lysat gemischt (braun) enthält Zielnukleinsäure (grün), Proteine ​​und mögliche PCR-inhibierende Chemikalien. Durch geeignete Wahl der hinteren und vorderen Ionen ermöglicht selektives Fokussieren von Zielnukleinsäure während verlassen PCR-Inhibitoren zurück. Insgesamt Nukleinsäure ITP Gipfel dauert oft auf einer nicht-idealen Form, wie hier im Einsatz-Bild gezeigt. Zur Demonstration dieses Assays haben wir gesamten Nukleinsäure extrahiert aus gram-negativen Bakterien, gesammelt Escherichia coli (lysiert mit Natronlauge allein), gereinigt aus dem Lysat mit NA ITP,das genetische Material extrahiert und durchgeführt qRT-PCR-Analysen für eine erfolgreiche Aufreinigung von 16S-rRNA (rot) und 16S rDNA (grün) aus Bakterienkultur zu überprüfen. Negative Kontrolle Schwelle Zyklen für 16S rRNA (blau) und 16S rDNA (gelb) wurden jeweils über 30 Zyklen. Wir führten qRT-PCR mit SYBR Green Power-RNA-to-C T 1-Step Kit von Applied Biosystems mit 150 nM forward (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) und reverse (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) Primer, bei den empfohlenen Bedingungen Temperaturzyklen.

Abbildung 5.
Bild 5. Nicht-konzentrieren Tracer (NFT) Assay für Trennung und Detektion von unmarkiertem Aminosäuren. a) Schematische Darstellung der NFT-Assay. Eine endliche Injektion von Proben-Ionen wird in den Ost-Kanal eingeführt. Wir mischen die LE mit einem Tracer kationische Fluorophor mit einer effektiven Mobilität niedriger als die TE-Ionen (μ-TracerTE). Der Fluorophorsoll als "Unterbeschleunigung Tracer" zu handeln. Als das Fluorophor electromigrates dem LE in Zonen nun Probe Plateaus und TE besetzt, erfährt es einen höheren elektrischen Feld und somit die Konzentration zunimmt. Diese Änderung in der Konzentration erzeugt Schritte in der isotachopherogram. b) Trennung von zwei Aminosäuren Arginin und Lysin, mit der NFT-Assay mit Rhodamin 6G als Unterbeschleunigung fluoreszierender Tracer. Die leichte Spitze zwischen TE und Arginin ist in ITP häufig, ist nicht gut verstanden, und hier nicht mit Nachweisen oder Quantifizieren des Plateaus stören.

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Discussion

Die ITP hier vorgestellten Methoden ermöglichen eine schnelle, empfindliche und robuste Erkennung und Behandlung von ionischen Molekülen. Die größte Herausforderung im Umgang mit ITP ist die richtige Wahl des LE und TE-Puffer. In anionischen ITP, wählen wir in der Regel Chlorid als führende Anion, weil es eine starke Säure mit einer sehr hohen absoluten Mobilität ist und somit sehr vorhersagbaren Eigenschaften. Daher wird in Puffer Wahl anionischen ITP in der Regel um die Wahl eines geeigneten TE und Gegenion reduziert. Für die selektive Fokussierung Experimente, ist entscheidend für die Wahl TE Ausschluss von verunreinigenden Ionen. In Anwendungen, bei denen Verunreinigungen sind nicht vorhanden, führt unteren TE effektive Mobilität auf schnellere Fokussierung. Wir empfehlen die Verwendung der folgenden, relativ brav anionische TE-Ionen: MES, MOPS, HEPES, Tricin. Wahl des Gegenions beeinflusst sowohl die System-und pH-TE effektive Mobilität. Gemeinsame Gegenionen sind Tris (pKa 8.1) und Bis-Tris-(pKa 6.4). Für Tests, die einen niedrigen oder höheren pH-Wert, empfehlen wir Pyridin (pKa 5,25) undEthanolamin (pKa 9,5), jeweils. In den Tabellen 1 und 2, für anionische und kationische ITP, jeweils fassen wir einige nützliche Beispiele Puffer. Wir nehmen HCl als anionische LE Ionen und Natrium als kationische LE-Ion, und wir nehmen an 100 mM Ionenstärke der LE-Puffer.

Der Leser wird bemerken, dass Puffer Ionenstärke in unserer Protokolle (und in den Tabellen 1-2) immer größer als oder gleich 10 mM. Während in der Theorie die Physik der ITP gilt bei Ionenstärke kleiner als 10 mm, natur Verunreinigungen (z. B. Kohlensäure aus Reaktion zwischen Wasser und atmosphärischem Kohlendioxid) in der Nähe der 1 mM Ebene beschränken oft den praktischen Einsatz von Puffern niedriger Ionenstärke.

Man beachte, daß Signaltransduktionsmechanismus nicht auf die Assays in diesem Protokoll vorgestellt beschränkt. Wie bereits kurz in Teil 5, in Plateau-Modus gereinigt Zonen diskutiert über Änderungen in der lokalen Leitfähigkeit, UV-absor erkannt werdenBance, der Temperatur oder des Brechungsindex. In unserer eigenen Gruppe, haben wir eine Methode, die fluoreszierende Trägerampholyten nutzt für empfindliche Detektion und Identifizierung von unbekannten Analyten entwickelt. 5 Im Peak-Modus Experimente, spezifischen Sonden verwendet werden, um konzentriert Analyten zu markieren. In einem Beispiel verwenden wir Molecular Beacons - Oligonukleotid-Sonden, die bei Hybridisierung fluoreszieren, um ihre Ziel-Sequenz - auf Ziel-DNA-oder RNA-Moleküle mit hoher Spezifität erkennen 11,18.

Während ITP ist relativ robust gegenüber Dispersion durch Druck-gesteuerte Strömungs-und EOF verursachten übermäßigen EOF zu einer Stagnation des ITP-Schnittstelle, wo die mittlere Geschwindigkeit EOF gleich der ITP Geschwindigkeit führen. Solche starken EOF 14 tritt vor allem bei hohem pH-Wert und niedriger Ionenstärke. Aus diesem Grund empfehlen wir die Verwendung von Puffern mit pH 8 oder niedriger und mit Ionenstärke in der Größenordnung von 100 mm, wenn praktisch. Nach unserer Erfahrung ist das PVPeffektivste Beschichtung für EOF-Unterdrückung in Borosilikat-Chips. Da jedoch der Siebeigenschaften kann PVP nicht für alle Anwendungen geeignet, wie die Fokussierung genomische DNA ist. In Experimenten beobachten wir, dass die Zugabe von PVP stark herabsetzen kann genomische DNA absolute Mobilität (bis zu dem Punkt, wo es nicht konzentrieren muss). In diesen Fällen ein Silanol Beschichtung wie Sigmacote in Verbindung mit einem Tensid (z. B. Triton X-100) kann auch wirksam bei der Verringerung EOF. 10

TE-Anion (pKa -1)
Pufferung Gegenion (pKa +1) MES (6,10) MOPS (7.20) HEPES (7,50) Tricin (8,15)
Ethanolamin (9.50) 21,41 20,40 17,38 22,85
Tris (8,08) 21,00 19,23 </ Td> 15,84 17,56
Bis-Tris-(6,40) 18,22 10,41 7,30 5,23
Pyridin (5,18) 1,01 3,72 2,42 1,48

Tabelle 1. Effektive Mobilität Größenordnung (× 10 -9 m 2 / V / s) des bereinigten reinen Analyten in anionischen ITP Zone, wo die LE ist 100 mM HCl und 200 mM Puffern Gegenion.

TE-Kation (pKa +1)
Pufferung Gegenion (pKa -1) Ethanolamin (9.50) Tris (8,08) Bis-Tris-(6,40) Pyridin (5,18)
MES (6,10) 35,57 21,96 16,39 10,45
MOPS (7.20) 35,47 20,92 9,76 3,93
HEPES (7,50) 35,35 19,97 7,77 2,88
Tricin (8,15) 34,77 16,72 4,50 1,44

Tabelle 2. Wirksame Mobilität Größe (× 10 -9 m 2 / V / s) des bereinigten reinen Analyten Zone in kationische ITP wobei das LE 100 mM Natriumphosphat und 200 mM Puffer Gegenion.

Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Wir bedanken uns für die Finanzierung von DARPA geförderte Mikro / Nano Fluidics Grundlagen Focus (MF3) Center unter Vertrag Zahl N66001-10-1 bis 4003, und von DARPA Zuschuss N660001-09-C-2082.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 10977 RNase/DNase free
Clorox Ultra Clorox 02489CT
sodium hydroxide (NaOH) Mallinckrodt Baker Inc. 7708
hydrochloric acid (HCl) EMD Millipore HX0603-4
Trizma base (tris) Sigma-Aldrich T6066
polyvinylpyrrolidone (PVP) Polysciences, Inc. 06067 MW 1,000,000
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Alexa Fluor 488 carboxylic acid Invitrogen A20000
tricine Sigma-Aldrich T-9784
bis-tris Sigma-Aldrich B4429
EDTA GIBCO, by Life Technologies AM9260G
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
SYBR Green II Invitrogen S7564
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000
Rhodamine 6G Acros Organics CAS 989-38-8
L-Amino Acids Sigma-Aldrich LAA21
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit Applied Biosystems 4389986
PCR primers Integrated DNA Technologies
Borosilicate microfluidic chip Caliper Life Sciences NS12A Supplied with or without plastic caddy
Vacuum pump Gast Manufacturing, Inc. DOA-P104-AA
Sourcemeter Keithley 2410 Constant current and constant voltage operation modes
Inverted epifluorescent microscope Olympus Corporation IX70 Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination
Filter cube Omega Engineering, Inc. XF115-2 Excitation/emission: blue/green
Safe-lock microcentrifuge tubes Eppendorf 022363204 1.5mL capacity
Centrifuge Eppendorf 5417C
Table 3. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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