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Summary

维护和线虫传播的难易

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Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J. Vis. Exp. (64), e4019, doi:10.3791/4019 (2012).

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Abstract

线虫的分子和发育生物学的研究,在七十年代初开始,由悉尼·布雷,它已被广泛用来作为模式生物1。C。线虫具有关键属性,如简单,透明和生命周期短,都使得它一个合适的2多年的基本生物学研究的实验系统。这种线虫的发现具有广泛的影响,因为许多细胞和分子过程控制动物发展进化保守。

通过胚胎阶段和四个幼虫进入前动物达到成年线虫的生命周期。发展可以采取2至4天,根据温度。在每一个阶段,可以观察到几个特征性状。其完整的细胞谱系知识4,5与深annotat的共同其基因组的离子变成一个领域模型这种线虫老化7,8神经生物学,干细胞生物学9和生殖细胞生物学10多元。

一个额外的功能,使三线虫一个有吸引力的工作模式是获得人口在一个特定的阶段同步蠕虫通过一个相对简单的协议的可能性。易于维护和传播这种线虫添加到同步的可能性提供一个功能强大的工具来获得大量的蠕虫病毒,它可以RNAi屏幕,芯片,大规模测序,如小或高通量实验的各种使用,免疫或原位杂交,等等。

由于其透明度,C。线虫结构可以区分使用微分干涉对比显微镜显微镜下,也Nomarski显微镜复制。利用DNA荧光的DAPI(4',6-diamidino-2-苯基)粘结剂,例如,可能会导致个别细胞的识别和定位,以及与他们相关的亚细胞结构/缺陷。

Protocol

1。议定书:11漂白培养蠕虫

C.人口众多线虫可以得到培养他们无论是在液体介质或固体介质中板。它们通常生长在固体NGM的(线虫的生长介质)和美联储与E.大肠杆菌的细菌,它被添加到的板块无论是活着还是死了(由紫外线12死亡,13热或冷14)。最常见的程序使用现场OP50 E。大肠杆菌 ,这是在尿嘧啶合成缺陷,并不能长满成厚厚的一层掩盖蠕虫。

  1. 混合3克盐,17克和琼脂,蛋白胨2.5Ğ加975毫升H 2 O高压灭菌50分钟。
  2. 烧瓶冷却至55°C
  3. 新增的1 M 氯化钙 ,1毫升1毫升5毫克/毫升乙醇胆固醇,1毫升的1 M 硫酸镁 25毫升的1 M KPO 4缓冲(所有的人,但胆固醇以前autoclavED)。
  4. 使用无菌程序免除成Petri板NGM的解决方案;板填补了其体积的2/3。
  5. 一旦干燥,最好是离开板在室温下2-3天前使用污染物检测。准备OP50 连胜从甘 ​​油股票大肠杆菌 (OP50可以从线虫遗传学中心获得)。
  6. 挑单菌落在LB隔夜增长在37°C,搅拌。
  7. 让多余的水分蒸发板层流中删除盖子,并用无菌巴斯德吸管OP50板块的中心。
  8. 允许OP50 E。大肠杆菌草坪增长8小时,在室温或在37°C过夜。
  9. 加入所需数量的蠕虫板(如果在37°C孵育应在使用前在室温下冷却板)。

提示:

  • 浇注相同数量的媒体确保在用吸管或泵分配器板相同体积的琼脂板,并有利于板块的转移而不需要重新调整的体视显微镜。
  • 几个星期后,准备在容器中存放在室温或4°C时,可用于板(去籽,与细菌的非种子选手)
  • 避免电镀板边缘的细菌。如果草坪延伸到的板块边缘的蠕虫可能会爬上两侧,干死。
  • 蠕虫活得更长,如果种子的盘子上的细菌是已经死了15。

2。协议B:治疗用碱性次氯酸钠溶液(“漂白”)11

漂白技术用于同步C。线虫幼虫在第一阶段的文化(第一级)。该方法的原理在于蛋壳保护E的事实蠕虫敏感漂白IT mbryos从。用碱性次氯酸钠溶液处理后,胚胎培养在液体培养基中没有食物,使孵化,但防止进一步发展。

  1. 允许蠕虫生长,直到成年阶段。
  2. 洗涤板与M9的缓冲区,恢复在15毫升管妊娠成人。
  3. 离心2分钟在400xg在室温(〜1500标准表离心机的转速)和弃上清丸蠕虫。
  4. 执行1-3洗涤,直到缓冲区出现明确的细菌。
  5. 添加所需的漂白液( 见表一 ),并鼓动一些分钟(成人组织的破坏,应在解剖显微镜下监测和反应停止时,成人的痕迹仍清晰可见,这通常需要3至9分钟,取决于几个问题,如蠕虫病毒颗粒的体积在讨论中提到,)( 图3)。
  6. 停止反应,加入M9的buffer来填补管。
  7. 快速离心1分钟(因为治疗可能仍处于活动状态),在400 XG,弃上清。
  8. M9的缓冲区填充管清洗颗粒三次。
  9. 加入1毫升的M9缓冲沉淀,或以非种子选手NGM的板放置鸡蛋,孵化所需的温度轻轻摇动。应提供适当的通风( 图4)。

提示:

  • 有不同的漂白解决方案,选择一个工作在你的手中( 表1,图1)。
  • 可以回收报废一块的X光片,如软质材料的琼脂表面板已经产卵。
  • 成年动物太多的遗体,可能会损害同步,因为它们构成了一个刚孵化的幼虫的食物供应。
  • 较高的温度略有加快发展,这是不方便,我f任何蠕虫跳过同步在较高的温度,因为在发展中的同步和不同步的蠕虫之间的差异将更大。
  • 漂白液必须在使用前进行。此外,漂白剂失去效力后,一直开放的同时,部分原因是由于其光敏性。我们建议每个新瓶分装成小的琥珀色瓶,以防止这种损失和尽量减少暴露在光线下。

3。协议的C:蠕虫电镀

  1. 等待12至24小时内(完成胚胎发育的时间取决于温度)进行漂白后恢复离心400 XG(2分钟)的蠕虫病毒。
  2. 弃上清,所需的板种蠕虫,让剩余的液体干。
  3. 在所需的温度下放置板。

提示:

  • L1 M9的缓冲区幼虫可保持在15°C间摇摆至少一个星期的Wi大地明显改变。
  • 要小心计算时将种子的蠕虫可能会耗尽,因为太多的食物比预期更快地,毁了你的实验。约500 L1可以达到55毫米板成年食品不运行。

4。协议ð:C。线虫观察

D.1中Nomarski观察

微分干涉对比显微镜是光学显微镜的照明技术,用于提高在未染色透明标本的对比。 Nomarski这个词是指棱镜后,他的发明者的名字命名的。通过观察动物活着,我们能够从固定的唯一改变动物的生理研究。此外,因为没有添加固定液,荧光标记物,可在体内观察。这一事实,并融合到一个感兴趣的基因的荧光标记物的可能性是可行的,按照进程在W更富研究蛋白质可能参与。通过此协议中所描述的技术,可以观察到,不仅活虫,但它们也可以被再次回收,镀。

琼脂垫准备(使用前):

  1. 准备2%琼脂糖水和融化。保持融化在65°C。
  2. 将两个幻灯片,与他们一块在第三,清洁的幻灯片双方的磁带。
  3. 使用巴斯德吸管的地方,干净的表面上的琼脂下降。
  4. 琼脂覆盖与垂直的三个幻灯片上放置另一块干净的幻灯片。
  5. 轻轻按下,使琼脂下降磁带垫片的厚度被夷为平地。
  6. 琼脂凝固后,轻轻地拉出录音幻灯片和一个相对滑动的其他分开的两个其余幻灯片。

安装活体动物

  1. 地方1滴(10微升),左旋咪唑1MM或钠叠10-30毫米到ţ他的垫中心。
  2. 转移到动物使用蠕虫采撷下降的。
  3. 轻轻地放置在动物盖玻片和修复双方在一些指甲油或硅。

提示:

  • 2%琼脂糖保持在4°C等分
  • 融化的琼脂糖凝胶可保持在65°C,至少一天。
  • 注:左旋咪唑是一种尼古丁受体激动剂引起痉挛肌麻痹16。
  • 谨慎,叠氮化钠是剧毒!

D.2乙醇固定和DAPI染色

这里描述的协议表示用DAPI染色蠕虫的快速路,但是因为一些蠕虫dissecation结构可能会出现一些改变。还有其他一些方法来解决以前的蠕虫,如卡诺,更好地保存完整的蠕虫17的溶液或甲醛固定DAPI染色。

乙醇固定(18日修改)

  1. 地方〜10μLM9的缓冲区,在显微镜幻灯片(或水)。
  2. 使用蠕虫挑仔细将下降10-25蠕虫。
  3. 如果不使用滤纸或微吸管去除尽可能多M9尽可能缓冲,消除蠕虫,或让他们干。
  4. 加入10μL〜90%的乙醇,并让它干。
  5. 重复步骤4一次或两次。

4',6-diamidino-2-苯基吲哚(DAPI)的染色

  1. 所需的安装媒体的终浓度2 ng /μl的混合的DAPI。
  2. 一旦乙醇已完全蒸发,增加7μL的DAPI:混合安装媒体。
  3. 放置盖玻片和修复双方在一些指甲油或硅。幻灯片将是观察约5分钟后的DAPI除了准备。

提示:

  • 安装MEDIA包含甘油,所以少量就足以覆盖整个筹备。
  • 存在着各种各样的商业安装媒体(Fluoromount或延长,例如),其质量和价格取决于多久你想储存您的样本。
  • 要小心的DAPI是一个已知的诱变剂,它结合丰富的地区,在DNA强烈。

食谱

线虫的生长介质(NGM的)

琼脂1.7%(W / V)
50 mM氯化钠
0.25%(W / V)蛋白胨
1毫米氯化钙2
5微克/毫升胆固醇
25毫米KPO 4
1毫米硫酸镁4

M9的缓冲区

22MM锦2 PO 4计
42毫米的Na 2 HPO 4
86毫米氯化钠
1毫米硫酸镁4

漂白的解决方案测试

配方#1 配方#2 配方#3 配方#4 配方#5
水(毫升) 2.75 3.5 0.5 0.5 1.5
氢氧化钠(毫升) 1.25(1M) 0.5(5M) 2.5(1M) 2.5(2M) 2.5(1M)
次氯酸钠300 4%(毫升) 1 1 1 2 1
总计(毫升) 5 5 4 5 5

本文的表一,不同的漂白液配方进行测试。食谱#3和#4的2倍,并应增加M9相同体积。 #1,#2和#5的食谱此前已报道2,11,19。最终浓度:0.25M 1氢氧化钠,次氯酸钠~~ 0.8% #2的NaOH,0.5M,次氯酸钠〜0.8%,0.625M氢氧化钠,次氯酸钠〜1%氢氧化钠1,#4男,次氯酸钠〜1.6%,#5氢氧化钠0.5M,次氯酸钠〜0.8%。

5。代表结果

图1
图1。比较五种不同的漂白解决方案,在两个不同的孵育时间。与M9的两次冲氮气蠕虫被分成5 15包含每个漂白液的毫升锥形管。管大力动摇和1毫升转移到新管与M9在指定的时间后停止反应。经过漂白程序,蠕虫病毒在20°C孵育24小时,用1毫升的M9。在每一种情况下,较低的图片刚刚经过漂白,上图,24小时后采取的。

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图2。漂白液的温度会影响治疗效果。相同体积的N2蠕虫与先前冷藏冰20分钟,同时保持在25°C的解决方案相同的漂白漂白。两列左侧显示图片刚过漂白。经过治疗蠕虫在20°C孵育15毫升锥形管24小时,1毫升的M9。 24小时后列右侧显示​​图片。

图3
图3。比蠕虫病毒颗粒:碱性次氯酸钠培养时间,影响治疗效果,蠕虫颗粒50,100,250和500μL孵育2毫升漂白3,第6和第9分钟的解决方案#3。 2,孵化后在20°C孵化的L1,死胚胎和成人碎片遗骸进行量化 M9的缓冲区与1毫升15毫升锥形管4个小时。约三融合55毫米,成虫板需要获得100μl的蠕虫病毒颗粒。

图4
图4。 C 孵化和生存所需的适当的曝气线虫的胚胎。100μl的颗粒N2的蠕虫漂白6分钟,1,5年或10毫升,15毫升锥形管培养指定M9的24小时,在20°C。图的上半部分显示文化的图片,24小时后,其中箭头表示并没有孵化的蛋。在底部,有一个图,描绘幼虫(浅灰色)和死胚(深灰色)48小时后,在规定条件漂白。

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图5。 C 生命周期线虫 。一个 。蠕虫在不同阶段的大致时间。小时要求达到根据每个阶段的温度(20修正)。Nomarski(上)和DAPI(下)在指定的发育阶段,不同的蠕虫图片。在每个阶段的最显着的特点是放大的L1:箭头指示体性腺及生殖系的前体早期L4:黑色箭头(Nomarski)表示开发外阴白色箭头表示(DAPI)的两个性腺武器的半山晚L4:箭头表示在所谓的圣诞树阶段的发展外阴青年:黑色箭头表示子宫内的胚胎,箭头点到精囊,白色箭头指示卵妊娠成人:箭头(DAPI)的指出受精胚胎。精囊的DAPI图像中的箭头表示。

图6
图6。外阴形态,在L3,L4和成人阶段。在L3阶段,只有一小管腔形成外阴可以观察到。在L4,这管腔扩大,形成所谓的“圣诞树”。在成人外阴已经关闭。黄线表示在这三个阶段的外阴位置。

图7
图7。 DAPI染色,在L3,L4年初,在L3 L4和成人阶段。,胚芽线被拉长。在L4,性腺武器目前U形形态。在后期的L4阶段精子可以被观察到在性腺远端部分。青壮年提出的卵母细胞。成人生殖系卵母细胞和胚胎。黄线在日delimitate胚芽线é不同规定的阶段。

图8
8。C。线虫在15和25°C氮气蠕虫的发展进行了漂白,隔夜培养在M9和搅拌在15°C间,转移到板和指定的时间,在规定的温度下生长。

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Discussion

线虫同步

几个漂白解决方案已被描述。我们尝试不同的食谱( 见表一 ),在我们的手中,他们没有表现出显着性差异在蠕虫人口同步( 图1)。然而,我们的实验也表明,参数,如温度( 图2),比漂白液:虫量( 图3)和M9的体积与胚胎培养孵化( 图4)做影响蠕虫的生存与文化的适当通风。在我们的晃动的条件,而在一管15毫升1毫升的量,允许所有的蠕虫病毒的生存,5毫升的体积已经是太多了,让适当的卵孵化和可比到最大音量的15毫升(未显示) 。

线虫发展

在发展过程中, 图5)成人阶段之前。胚芽行是一个很好的指标C.发展阶段线虫 。最简单的功能的C. Nomarski光学下,可以观察线虫的发展是外阴的发展,在L4早期阶段开始形成。起初,只有一小管腔观察,后来扩大到所谓的“圣诞树”形状,L4月中下旬。最后,通过对L4年底的外阴关闭( 图6)。另一方面,DAPI染色可以观察性腺的发展。从四个单元在L1,L2和L3的细胞分裂和伸长性腺。在L3远端根尖细胞可以观察到,开始迁移背侧。减数分裂也开始由三级年底。在L4远端根尖细胞,达到他们的确切位置和生殖细胞分化成精子。结束最终由L4生产精子和卵母细胞开始生产。在adulţ蠕虫胚胎可以观察到子宫内( 图7)。

发展和温度

C. elegans的发展在不同的速度取决于温度,而需要从鸡蛋奠定时刻约90小时,直到新的蠕虫病毒开始奠定自己的卵子在15℃,45小时有足够的时长大于25° ℃( 图6)。设立条件和进行实验,研究在不同温度下的发展速度差,导致相对的灵活性。此外,它提供的可能性,不仅要监测一个特别的待遇或变更(例如温度敏感等位基因)的影响,而且还建立在开展一项特别实验的最佳条件。

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Disclosures

我们什么都没有透露。

Acknowledgments

作者想承认,AGAUR(博士奖学金到劳拉Fontrodona),MICINN(PTA项目配套蒙特塞拉特肝门德拉·里瓦),研究所的Salud的卡洛斯三世(米格尔Servet计划支持朱利安Cerón),玛丽·居里表意文字,ISCIII和IDIBELL融资实验室。

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