成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

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Summary

我々は、マウスの前脳におけるニューロン移動のリアルタイムvideoimagingためのプロトコルを記述します。ウイルス標識又はグラフト神経前駆細胞の遊走は、固定と移動相の持続時間と速度を含む細胞遊走のさまざまなフェーズを、勉強するのは比較的急速な取得間隔と広視野蛍光イメージングを用いた急性スライスのライブで録音された移行。

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Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061, doi:10.3791/4061 (2012).

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Abstract

新しい機能性ニューロンが恒常的に成体哺乳類の脳の制限区域内の神経幹細胞の内因性のプールから生成されていることを示す証拠の実質的なボディがあります。脳室下帯(SVZ)から新生児神経芽細胞は、嗅球(OB)が1で、最終的な宛先に吻側渡り鳥ストリーム(RMS)に沿って移行します。 RMSで、神経芽細胞は、構造的な支持と移行4,5に必要な分子因子の供給源としての血管を使用して星状膠細胞の突起2,3によってensheathedチェーンで接線方向に移行します。 OBで、神経芽細胞はチェーンから切り離し、それらは介在ニューロンに分化し、既存のネットワーク1、6に統合異なる球層に放射状に移行します。

本稿では、我々は齧歯類の脳の急性スライスにおける細胞移動を監視するための手順を説明します。急性スライスの使用はassessmを許可密接にインビボ条件および in vivoイメージングアクセスが困難な脳領域でに似ているという微小環境における細胞移動のENT。さらに、それは最終的に細胞の遊走特性を変化させることができる器官および細胞培養の場合のように、長い培養状態を回避できます。急性スライスにおける神経前駆細胞は、DIC光学または蛍光タンパク質を用いて可視化することができます。野生型マウスのSVZにレポーターマウスから神経芽細胞を移植し、神経芽細胞に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いてSVZにおける神経前駆細胞のウイルスラベリングは、神経芽細胞を可視化し、それらの移動を追跡するためのすべての適当な方法である。後者の方法は、しかし、個々の細胞が原因で標識された細胞の高密度の長時間追跡することはできません。我々は、比較的急速な取得間隔(1つのIMAを達成するためにCCDカメラを搭載した広視野の蛍光正立顕微鏡を使用確実に静止して渡り鳥のフェーズを識別するために、GEごとに15または30秒)。静止および移動相の持続時間の正確な同定結果の明確な解釈のために重要である。我々はまた、3Dでの神経芽細胞の移行を監視するために複数のzステップの買収を行いました。広視野の蛍光イメージングは、ニューロンの移動7-10を視覚化するために広く使用されています。ここで、我々は、神経芽細胞を標識成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の遊走をリアルタイムにビデオ撮影を行うと、細胞遊走を分析するための詳細なプロトコルを記述します。説明されたプロトコルは成人RMSでの神経芽細胞の遊走を例示したが、それは、胚や初期生後脳における細胞移動を追跡するために使用することができます。

Protocol

1。神経前駆細胞のラベリング

神経芽細胞は、 すなわち (定位SVZまたはRMSに蛍光タンパク質をコードするウイルス粒子を注入することによって、またはレポーターマウス由来の神経前駆細胞を移植することによって、選択的に神経芽細胞における蛍光タンパク質( すなわち 、DCX-GFP、GAD67-GFP)を発現するトランスジェニックマウスを用いて可視化することができます、野生型マウスのSVZにDCX-GFP、GAD67-GFP)。私たちは、移植と神経前駆細胞のウイルス標識のための手順を説明します。

レポーターマウスのSVZから神経芽細胞の解離

  1. 次のソリューションは、神経芽細胞の解離に必要です。

40Xソリューション

10ミリリットルペン/ストレプト(ストックペン10,000 U / mlと/ストレプト千μg/ mlの)

10mlのグルコース(ストック200 mg / ml)を

20ミリリットルピルビン酸ナトリウム(在庫100 mM)を

ove_content "> 10 mlのH 2 O

1mlのアリコートを準備

解剖溶液(100ml)

HBSS 1X - 97.4ミリリットル

HEPES(1M) - 0.1ミリリットル

40Xソリューション - 2.5ミリリットル

のDNase溶液(20K単位/ ml)

DNaseI、ウシ膵臓由来typeIV

15万台は、7.5 mlのH 2 Oに溶解

フィルタリングさ0.22μmの

1mlのアリコートを準備

トリプシン-DNaseI溶液(10ml)

HBSS - 8.6ミリリットル

DNaseI(20K単位/ ml) - 0.15ミリリットル

トリプシン-EDTA(0.5%) - 1ミリリットル

40Xソリューション - 0.25ミリリットル

摩溶液(50ml)

ntent "> Neurobasal培地 - 47.5ミリリットル

BSA(300 mg / ml)を - 332.5μL

40Xソリューション - 1.25ミリリットル

DNaseI(20K単位/ ml) - 0.66ミリリットル

  1. 麻酔は2〜ケタミン/キシラジン(10ミリグラム/体重10グラムあたり1mg)100μlの腹腔内注射で神経芽細胞で蛍光タンパク質を発現する3ヶ月齢の成体マウス、次に首をはねる。我々は、GAD67-GFPマウス11を使用しています 。メスを用いて、側脳室のレベルでの冠状脳をスライスし、氷冷解剖媒体におけるSVZを解剖する。トリプシン-DNase溶液500μlのマイクロ遠心チューブにSVZを置き、20分間氷上で保存する。
  2. 37℃で予め温めた(37℃)、トリプシン-DNase溶液でインキュベートの5ミリリットル℃で30分間、5%CO 2中のCを含有する15mlのコニカルチューブにSVZを転送します。
  3. tritの15ミリリットルを入れた50mlコニカルチューブに内容全体を転送1分間、1,000×gでurationソリューション遠心する。 、上清を吸引摩溶液10mlを加え、新しい15 mlコニカルチューブに細胞を移し、1分間1000×gで遠心分離してください。
  4. 摩媒体と先端サイズとコートを減らすためにパスツールピペットを火磨く。遠心分離後の上清を可能な限りできるだけ多くを削除し、コニカルチューブに新鮮摩溶液2 mlを加える。摩液(パスツールピペットで上下に約50倍)で細胞をひいて粉にする。よく解離された細胞を含む上清の上半分を取ると、摩溶液10mlを含む新しい15 mlコニカルチューブに移す。
  5. ファイヤーポリッシュさらにチップサイズを縮小するためにパスツールピペット。残りの解離していない細胞を含むチューブに摩液の別の1 mlを加え、摩(おおよそ10回上下)を継続し、15 mlコニカルチューブcontaininに全体の内容を転送グラム以前に解離された細胞。 7分間1,000×gで遠心分離します。上清を捨て、Neurobasal培地、カウンティングチャンバーへの負荷の50 mlにペレット化した細胞を再懸濁すると、細胞をカウントします。

以下で説明する手順を使用して、SVZに移植細胞数を任意の数に。

解離された細胞のウイルスと移植の定位注入

  1. 手術を開始する前に、ビーズ滅菌器を使用して、すべての器具を滅菌する。
  2. 定位注射は、脳の損傷を最小限にするために非常に薄いのヒント(1-2ミクロン)でガラスマイクロピペットを使用しています。ピペットを作るために、ピペットプラー付きガラスキャピラリーを引く。埋め戻しは、ハーフ、フルまでパラフィン油とピペット、ピペットの未処理の終わりにナノリッターインジェクタ(ワールド·精密機器)のプランジャーを挿入します。
  3. ナノリッターインジェクタコントローラを使用して、小さなDROまでプランジャを有する油を下に強制的にパラフィンオイルのpが薄い先端から押し出す。ウイルス粒子(1×10 6×10 8 TU / ml)または解離SVZ細胞のいずれかを含有する溶液を0.5から1μlの滅菌容器にピペットを下げます。望ましい解決策でピペットを埋めるためにナノリッターインジェクタのwithdraw関数を使用します。ピペット内部に気泡がないことを確認します。
  4. 麻酔ケタミン/キシラジンの腹腔内注射で2〜3カ月齢の成体C57BL / 6マウス。頭の上に手術部位を剃る電気かみそりを使用しています。どんな接着毛を除去するためにぬれたガーゼでよく清掃してください。
  5. 定位フレームの上にマウスを置き、頭を固定してください。消毒石鹸(Hibitane)し、70%アルコール(ガーゼやスプレー)を使用して髪のない注射部位を洗浄してください。 Proviodine(ガーゼやスプレー)を使用してサイトを消毒し、手術野で動物​​をカバーしています。
  6. マウスの滅菌皮膚に小さな切開を行い、慎重に公開するために皮膚を広げる基礎頭蓋骨。頭蓋骨の表面を乾燥させます。それぞれanterio - 後(AP)とメディオ - 横(ML)の定位座標を設定するためにゼロ座標としてブレグマと正中線を使用しています。
  7. 適切な座標における各半球上頭蓋骨に小さな穴をあけます。基礎となる脳組織の損傷を防ぐ。骨のみが破られるまで、慎重にドリルダウンします。穴をきれいにし、脳の表面上の背腹(DV)の定位座標のゼロ座標を設定します。 APは2.55、0.82、MLおよびDV:;:SVZ用:RMS用のAP 0.70、1.20、MLおよびDV 1.90我々は成人のSVZまたはRMS(22-24 g)のC57BL / 6マウスに注射するため、以下の座標(mm)を使用3.15。
  8. ゆっくりガイドとして適切なDVの座標を用いて脳内にガラスマイクロピペットの先端を挿入し、ゆっくり少量(私たちは5 NL /秒で100から500 nlを注入)の細胞懸濁液を(レポーターマウスのSVZから解離)を注入またはウイルス粒子を含む溶液。我々は通常使用レンチウイルスまたはレトロウイルス粒子1×10 6×10 8 TU / mlであった。
  9. ゆっくり、ガラスマイクロピペットを撤回頭蓋骨の上の皮膚を縫合し、迅速な復旧のための加熱パッドの上にマウスを置きます。マウスは、手術後に目を覚ましたとき、(ketaprofen 10 mg / kgのSC、3日術後間に1日1注射)鎮痛剤を投与する。

2。急性スライスの準備

  1. 次の解決策は、急性スライスを準備するために必要されています。)人工脳脊髄液(ACSF)はNaClをスライス標本手順の間に増加した神経細胞の興奮性を抑制するためにショ糖で置き換えられるソリューションを切断と呼ぶスクロースベースのソリューションを、、、及びb)NaClを含むACSFは、スライスが撮像されるまで転送され、維持されているに水浴で32℃に温めた。
  2. 切削液:210.3スクロース、3 KCl、1.3 MgCI 2 x6H 2 O、2 CACI 2つのソリューションは、以下の(mm)を含む2 O 26のNaHCO 3、1.25のNaH 2 PO 4、20グルコース; ACSF:125のNaCl、3 KCl、1.3 MgCI 2 x6H 2 O、2 CACI 2 x2H 2 O、26のNaHCO 3、1.25のNaH 2 PO 4、 20グルコース。 7.3から7.4のpHでのソリューションを維持し、95%O 2/5%CO 2下でそれらをバブリングすることにより継続的に酸素を送り込む。
  3. ケタミン/キシラジンの腹腔内投与でマウスを麻酔。液体窒素を用いてゼリー状の外観で氷のように冷たい切削溶液を調製します。 20-ccシリンジを使用して、この溶液をintracardiacalyマウスを灌流する。
  4. この手順は、溶液20mlで1〜2分で、通常、迅速に行われるべきである。血管がラベルを付ける必要がある場合は、代わりに、切削液で灌流することにより、心臓の左心室にtranscardiacallyデキストランテキサスレッド(10 mg / ml)を200μlを注入し、マウスをdecapitating前に2〜3分待ってください。
  5. メートルの首をウーズ、急速に氷冷切削液中に頭を浸す。頭皮を削除し、小脳からOBに半ば矢状縫合に沿って前方軸の後方から頭蓋骨をカットするはさみを使用しています。そっとピンセットを用いて頭蓋フラップを取り外してください。
  6. 物品メスを用いて脳の尾の部分。 intrahemispheric割れ目に沿って脳を切り、各半球の最も外側部( 図1A)上の2つの矢状のカットを作る。穏やかにへらを使って脳を削除し、氷冷切削液に入れてください。
  7. ビブラトームのプラットフォームには、2つの半球で4%の寒天に触れる背側を持つブロック、グルーブロックの上に別々に二つの半球を置きます。プラットフォームへの糊半球の横切断面を、内側には( 図1B)を上向きに保つ。ビブラトームのチャンバ内にプラットフォームを置き、ソリューションをカットでそれを埋める。 SLIを通して酸素化ソリューションを保つ95%O 2/5%CO 2でそれをバブリングによるCE準備。
  8. ビブラトームを用いて250μmの厚さの切片を作製します。我々はマイクロM HM 650 Vビブラトーム(サーモサイエンティフィック)を使用し、100 Hzと1ミリメートル/秒の速度の周波数でスライスを切った。低切削速度と高周波ブレードの振動を高品質のセクションを取得するために使用されるべきである。できるだけ早くスライスがブレードから解放されるように、優しく切削液から取り出し、32℃で水浴( 図1C)で維持酸素ACSFでいっぱいインキュベーションチャンバー内に配置します。

この手順は、最高品質のスライスを確保するため、可能な限り迅速に行うべきである。

3。神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

移行神経芽細胞のイメージングは​​、スライスの準備の6-8時間と神経芽細胞の標識後3-10日以内に実施されるべきである。移行パラメータの変化を避けるために、なぜなら、脳の損傷を最小限にし、注射部位(実効以下、 すなわちイメージから遠位領域におけるイメージングを実行するために脳の損傷およびグリアの活性化使用薄いひっくり返されたガラス微小電極を(1-2μm)を誘発するかもしれない定位注射SVZにまたはRMSへの注入後に嗅球のRMS内注射)。イメージングは​​、SVZにレンチウイルス粒子の注射後21日までに行うことができますが、それは視野当たりより多くの細胞を可視化し、追跡を可能にするため、我々は、より短いポスト噴射間隔(3-10日)をお勧めします。

我々は、CCDカメラ(CoolSnapHQ2、Photometrics)および0.8開口数(オリンパス)と40X水浸対物レンズを搭載した広視野の蛍光電動BX61WI顕微鏡(オリンパス)を用いた。高NAとの目標は、より良い解像度の画像を提供します。標識された神経芽細胞は、(レポータードナーマウスのいずれかからグラフトまたはウイルスラベル)興奮していたラムダDG-4でz買収当たり30から100ミリ秒のために175 Wキセノンランプ(サッター·インスツルメンツ)を装備。多波長イメージングは​​また、蛍光標識されたアストロサイトや血管などのRMSの他の細胞要素に沿っニューロンの移動を追跡するために、適切なフィルターセットを(クロマ)を使用して実行できます。顕微鏡、CCDカメラとDG-4(下記参照)が設定される時間経過取得プログラムのさまざまなパラメータを許可されたMetaMorphソフトウェア(分子デバイス)によって制御されていました。スライスはPH1シリーズ20超静音イメージング顕微鏡上に構築されたチャンバー(ハーバード装置)に移した。チャンバーは、自動加熱システム(TC-344B、ハーバード装置)に接続されていた、継続的に酸素化されたACSF( 図1D)で灌流した。チャンバー内の温度は31から33℃に維持し、ACSFの流量は分あたり1-2 mlであった。

  1. 顕微鏡のイメージングチャンバー内でスライスを慎重に配置します。へ撮像時のスライス漂流避け、慎重にスライスの上にナイロンメッシュ(ワーナーInstruments)を配置することによって、それを安定させる。メッシュは0.3〜1.13ミリメートルから0.12ミリメートル厚さや開口部の範囲である。それはイメージング分野( 図1D)をふさがないようにメッシュを配置します。興味のある分野を見つけて10X対物レンズを使用し、40X対物レンズを従事し、ピントを合わせます。
  2. スライスが連続ACSFで客観的かつスライス間の溶液が十分にあることを灌流されていることを確認します。 ACSF灌流、不規則な灌流、または急激な温度変化漂流引き起こし、撮影時の焦点面の変化の速度の変化。
  3. アクイジション·システムを制御MetaMorphソフトウェアを使用して、時間経過取得パラメータ( すなわち励起持続時間は、z平面の数、各zセクション間の距離、時間間隔、および記録時間)を設定し、時間を開始買収を失効。ダtaが自動的に取得された時間経過のビデオの1時点に対応する各ファイルをTIFFファイルとしてMetaMorphによって保存されます。
  4. 少なくとも1〜2時間のために撮影を行うと2固定相によって中断された対価の渡り鳥のフェーズにかかる。イメージングは​​、神経芽細胞の遊走特性におけるいかなる変更なしで4時間(私たちは4時間以上持続するイメージングセッションを実行していなかった)にアップするために行うことができます。スライスの表面の画像セルしないでください。 20〜100μmの深さで我々は、通常の画像。確実に静止し、移行フェーズの開始と終了を決定するために - 私たちは、短い取得間隔(30秒15)を使用することをお勧めします。
  5. 神経前駆細胞の遊走の分子の特定の要因の関与を評価するために、通常のACSFはACSFは任意の所望の薬理学的薬剤( すなわち 、異なるアゴニスト、アンタゴニスト、遮断薬、増殖因子など)を含んで置換することができる。少なくともための撮影を行う統制条件で、次に薬剤の存在下で1時間、1時間。

4。神経芽細胞の移行を分析

我々は、データを分析するためにImarisソフトウェア(ビットプレン)を使用します。これは、私たちは自動的に3Dで新生児の細胞移動を追跡することができます。 Imaris 7.0F1パッケージはMeasurementsPro、Imarisトラッキング、ImarisColoc、ImarisXT、フィラメントトレーサ、およびInPressモジュールが含まれています。

  1. Imarisでムービーを開くには、単にプログラムのアイコン上でビデオの最初の時点の画像をドラッグ&ドロップして取得した画像(TIFFファイル)を読み込みます。
  2. ムービーが読み込まれたら、画面の調整ウィンドウの信号の明るさとコントラストを調整し、画像のプロパティで取得した映像(ボクセルサイズと時間間隔)のパラメータを設定し、等間隔の時間点を設定ウィンドウ(図4A) 。ボクセルサイズを指定したら、それは3Dのフレームと同様の時間とスケールを参照することが可能であるビデオ。
  3. 自動的に記録された細胞を追跡するために、スポット機能を選択してサーパスウィンドウ内のフィールド内の各セルのスポットを作成します。手順に従い、画像化されたオブジェクト( 図4B)に基づいてパラメータを設定します。パラメータの一つは、スライスのウィンドウで測定することができる細胞の直径である。
  4. 時間をかけて検出されたオブジェクトの信頼性を検査します。すべての遊走細胞が自動的に検出されない場合は、検出のしきい値( 図4B)を変更し、すべての細胞は全ての時点で斑点が選択されていることを確認してください。
  5. 近隣の時点から、二つのオブジェクトがそれらの境界/エッジの間の任意の重複している場合は、自動追跡中、トラックの接続は、各オーバーラップのために作られます。同じトラックの隣接時点を表す2点間の最大距離および最大のギャップの大きさ( 図4C)は、プログラムが時間POINを接続できるように指定する必要がTS。最大距離は、時間の点で、その後の同じオブジェクト間の距離によって決定されます。
  6. トラックが作られていたら、それはトラックをフィルタリングして、単純に( 図4C)を削除することによって、無関係なトラックを削除することが可能である。トラックが別のトラックと同じトラックの異なる時点( 図4C)を接続および切断することで修正できます。
  7. いったんすべての修正がなされてきたが、トラックでの最終的な外観を取ると、Excelファイル( 図4D)にデータを(時点ごとのセルの変位、トラックの長さ、変位長さ、トラックのデュレーションなど)をエクスポートします。

5。代表的な結果

我々はテストされ、神経芽細胞遊走の広視野タイムラプスイメージングを最適化しました。ウイルスラベリングまたは移行細胞における堅牢なGFP発現( 図2)に対して許可SVZに蛍光標識された神経芽細胞の移植。多波長イメージングは​​b缶eは、デキストランTexasRed満ちた血管4( 図3およびムービー1)、蛍光グリア細胞特異的プロモーター( 2B)12を用いてウイルスの定位注入によって標識アストロサイト、としてRMSの他の細胞要素に沿った神経芽細胞の移行を可視化するために適用されるまたは具体的にトランスジェニック動物において星状膠細胞を標識した。

固定相( 図3、映画1と2)で区切られた最先端のプロセスに向かって神経細胞体の変位:急性スライスにおける神経芽細胞遊走の広視野映像イメージングは、2つの別個のフェーズから成る神経前駆細胞の移行の跳躍行動を明らかにした。静止および移動相の持続を確実に識別するには、このような変位速度(マイグレーションフェーズ中にのみ計算される)のような他の細胞移行パラメータを導出するために、イメージングは​​15ごとに一度短い取得間隔(使用して、3Dで行われたまたは30秒)。定常と移行フェーズの期間の正確な識別は、データの明確な解釈のための非常に重要です。例えば、与えられた期間中に、移行の距離の違いでは、マイグレーションの速度の変化によって、または移行および固定相の持続時間や周期性における変更のいずれかによって誘導することができる。これらの様々な可能性は、長い間、取得間隔を使用して区別することはできません。

Imarisソフトウェアは、3Dでの神経芽細胞の移動を分析するために使用したとトラックのデュレーションとトラックの長さだけでなく、変位ベクトルであるトラック変位長さ、などの細胞遊走の追加パラメータを導出する。トラックの真直度もトラックずれの長さによって、トラックの長さで除して算出し、それは個々の神経芽細胞の移行経路の直進性を示すことができます。

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図1。急性ライブスライスの準備の概略図。1尾、1 intrahemisphericと2サジタルカットの)略図。ビブラトームの寒天ブロックとプラットフォーム上でマウス脳を配置B)の概略図。急性スライスのインキュベーション室のC)の概略図。正立顕微鏡上に構築されたイメージングチャンバーのD)の概略図。

図2
図2。 RMSでの神経芽細胞のラベリング。成人RMSの神経芽細胞や血管の堅牢なラベルを示す)低倍率像は。レトロエンコーディングGFPは、SVZに注入し、GFP発現細胞(緑)(左パネル)3日後、RMSで検出された。血管は、デキストランがマウスの心臓(赤、右パネル)にTexasRed注入することによって標識した。挿入図は、高い壮麗なを示しています血管や血管に関連バイラル標識した神経芽細胞のationイメ​​ージ。成人RMSの異なる細胞要素のB)ラベリング。神経芽細胞は、SVZにおけるmCherryエンコードレンチ(赤)を注入することによって標識した、アストロサイトは、RMS(緑)のGFAPプロモーターの制御下にレンチウイルスGFPをコードを注入することによって標識し、そして血管がデキストランCascadeBlue(青を注入することによって標識した)中心部にあります。成体野生型マウスのSVZにGAD67-GFPマウスのSVZから解離GAD67-GFP細胞の注入C)の概略図。 D)は7日SVZにおいて移植後のRMSで検出GAD67-GFP細胞(緑)移植した。 RMSは、GFAP(青)を用いて免疫染色しています。 E)を移植GAD67-GFP細胞(緑)DCX(赤色)免疫あったが、GFAP(青)immunonegativeました。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。

図3
図3。神経芽細胞のタイムラプスイメージング。神経芽細胞のタイムラプスイメージング(緑色)血管に沿って移行(赤)。矢印は神経芽細胞の移行段階を示し、矢印は固定相を示す。

図4
図4。神経芽細胞の遊走の解析 (AD)は神経芽細胞の移行解析の様々なステップ。赤い丸はテキストに記載されているさまざまな機能を示しています。 拡大図を表示するにはここをクリック

ビデオ1。デキストランに沿って移行バイラルというラベルの付いた神経芽細胞のタイムラプスイメージング(緑)が標識された血管(赤色)TexasRed。 Cビデオをご覧になるにはここをなめる。

ビデオ2。Imarisソフトウェアによって神経芽細胞の移行を追跡。緑色のドットは、細胞体を示しており、トラックは移動の距離を示す。 ビデオを見るにはここをクリック

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Discussion

適切な脳領域に神経前駆細胞の正確なターゲティングは、神経回路の適切なアセンブリと関数の基礎となる基本的なプロセスです。細胞の大半は、胚発生中に移行し、唯一のそのようなOB、歯状回および小脳な​​どのいくつかの地域では、出生後の脳では、ニューロンの変位は、まだ行われます。出生後の脳内の細胞遊走を編成するメカニズムはよくわかっていない、しかし、残っている。成熟した神経組織において細胞遊走を誘導に関与する機序と分子経路の知識は、生後脳における神経ターゲティングの我々の理解を改善し、脳の病気の領域に神経細胞の動員を誘導するために新たな戦略を開発するための臨床的意義を持っているかもしれません。

本稿では、成体マウスの前脳の急性スライスにおける細胞移動を監視するためのプロトコルを記述します。我々は、成人SVZ-OBを使用しながらモデル系として経路は、同じ技術が胚および生後初期の脳内だけでなく、成人の脳損傷後における細胞遊走をフォローするために適用することができる。我々は、小脳や成人脳卒中後の線条体(Eiriz、グレード、マルバとSaghatelyan、未発表データ)、出生後早期のRMS 12における細胞遊走をフォローするために、このプロトコルを使用していました。

神経芽細胞遊走のイメージングは、細胞遊走が密接in vivo条件下模倣微小環境で勉強できるようにするライブ急性スライスを用いて実施した。遊走細胞はウイルス粒子の定位注入により、または野生型マウスのSVZにレポーターマウスから神経芽細胞を移植のいずれかによって可視化した。マイグレーション分析が注射部位から遠く離れて行った。 RMSでの接線の移行を検討するために、我々は、神経芽細胞を標識した3-5日後に急性スライスを用意しました。 OBの放射状移動を研究するために、スライスは7-10日後に調製したステレオSVZにreotaxic注入。成体SVZにおける神経前駆細胞の標的化ウイルスはまた、勉強するために使用され、特定の分子手がかりをアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることにより、移行プロセスに関与する因子を調節することができます。これは、RMSの異なる細胞型にラベルを付けたり、トレーサー充填血管4,13またはに沿ってウイルスまたは遺伝的に標識されたアストロ2、12に沿って神経芽細胞の移行パターンを解明するために、多波長イメージングを行うことも可能である。

イメージの神経芽細胞の移行に我々は、励起光の短パルス(30-100ミリ秒)後に別のz平面で比較的急速な買収を許可されたCCDカメラを搭載した電動蛍光正立顕微鏡を使用していました。これは、退色を防止し、神経芽細胞の移行の3次元可視化と干渉することなく、2以降の取得の時間間隔を減少させた。他のグループは、細胞MIGRを監視するために共焦点または二光子顕微鏡を使用していた生後RMS 14-16 ation。両方の技術は、主に時間的、空間的な解像度の問題に関連して、それぞれの長所と限界を持っています。私たちは、連続した買収の間で短い間隔(15〜30秒)を使用してお勧めします。新生ニューロンは、跳躍動作を持っており、移行相は4月10日分4と同じくらい簡単なことができ、静止期間によって中断されています。このタイプの移行を考えると、それは確実に移行し、固定相の先頭と末尾を識別するために、連続する時間ポイント間の比較的急速な取得間隔を(15-30秒)で使用することが重要です。これは2つの連続した​​買収の時間間隔は数分の範囲にあるときに達成することは困難である。定常と移行フェーズの正確な決定は明確に移行フェーズ4、17時のみに定量化されるべきである神経芽細胞の移行速度を定義する必要があります。ロング取得間隔アベレージを計算することができます距離などの電子速度も固定相を含み、一定の期間を旅行した。このメソッドによって定義された平均速度の変化は、しかし、移動速度の違い(移行フェーズでのみ定義されている)によって、または定常および移行フェーズ期間中のいずれかによって引き起こされる場合があります。取得パラメータでこれらの違いは、異なるグループによって報告された神経芽細胞の移行速度の不一致を根底にする可能性があります。 15〜30秒間隔で急速な買収を行うと移行フェーズで排他的に移動速度を決定することにより、我々はの取得間隔を使用して他のグループに対し、120から150ミクロン/ hの4,12の移行の速度を計算した3月7日分は、50〜100μmの/ hの14、15、18の速度を報告した。 CCDカメラ付き広視野蛍光イメージングの主な欠点は、それがスキャンシステムより低い空間分解能を提供することである。しかし、以来、神経芽細胞の移行は、コンパクトMORPを持ってソーマと短いリードするプロセスとhology、低い空間分解能は、細胞体および一流のプロセス( 図3および動画1と2)のレベルで神経芽細胞の信頼性の高い識別と追跡することを妨げるものではない。

我々は本明細書に記載の技術は密接に分析される生体内の条件模倣微小環境における神経芽細胞の移行は、RMSの異なるコンポーネント間の相互作用を研究することを可能にし、神経芽細胞の遊走におけるこれらの相互作用の役割が調査される。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

この作品は、部分的にラヴァル大学の交わりによってサポートされていましたASJKに健康研究(CIHR)助成金のカナダの協会によってサポートされていました。 ASは出生後の神経発生におけるカナダリサーチチェアの受取人である。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma S9378
Glucose (ACSF) EMD DX0145-3
NaCI Sigma S9625
KCI Sigma P9541
MgCI2x6H2O Sigma-Aldrich M2670
NaHCO3 Sigma S5761
NaH2PO4xH2O EMD SX0710-1
CaCI2x2H2O Sigma-Aldrich C3881
Dextran TexasRed Invitrogen D1864
Dextran CascadeBlue Invitrogen D1976
Glucose (40X solution) Sigma G8769
Sodium pyruvat Gibco 11360-070
HEPES Sigma H3375
HBSS Gibco 14170-112
DNase I Sigma D-5025
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Neurobasal medium Gibco 21103-049
BSA EMD 2930
Pen/Strep Life Technologies 15140-122
Ketamine/Xylazine CDMV 5230
Pasteur pipette VWR 14672-380
15 ml conical tube Sarstedt 62.553.205
50 ml conical tube Sarstedt 62.547.205
Glass capillaries (stereotaxic injection) WPI 4878
Paraffin oil EMD PX0045-3
Proviodine Rougier 65655-1370
Suture Stoelting 50487
Anafen CDMV 11508
20 cc Syringe VWR SS-20L2
Petri dish VWR 25384-094
Agar Laboratoire Mat AP-0108
Glue Permabond 910
95% O2/5% CO2 Linde 24068835
Blade WPI 501901
Nylon mesh Warner Instruments 64-0198
Centrifuge Eppendorf 5702 000.019
Pipette puller Sutter Instrument P-97
Nanoliter injector WPI B203MC4
Stereotaxic injection apparatus WPI 502900
Micro drill system WPI 501819
Vibratome Thermo Scientific 920110
Wide-field fluorescent microscope Olympus BX61WIF
CCD camera Photometrics CS-HQ2-D
Ultra-quiet imaging chamber Harvard Apparatus 64-1487
PH-1 Series 20 heater platform Harvard Apparatus 64-0284
Heating system Warner Instruments TC-344B
40X water immersion objective Olympus 1-UM587
10X water immersion objective Olympus 1-UM583
Lambda DG-4 Sutter Instruments DG-4/OF
MetaMorph software Molecular Devices 40000
Imaris software Bitplane BPI-IM70-F1

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References

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