Transformación de Genómica de la Picoeukaryote

Biology
 

Summary

En este artículo se describe la transformación genética del alga marina unicelular

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van Ooijen, G., Knox, K., Kis, K., Bouget, F. Y., Millar, A. J. Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri. J. Vis. Exp. (65), e4074, doi:10.3791/4074 (2012).

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Abstract

Los problemas más comunes que impiden un rápido progreso en Ciencias de la planta incluyen tejido celular y la complejidad del organismo, y en particular el alto nivel de redundancia genómica que afecta a la genética simples en las plantas superiores. La novela de organismo modelo Ostreococcus Tauri es la más pequeña de vida libre eucariota conocido hasta la fecha, y posee un tamaño de genoma reducido en gran medida la complejidad celular y 1,2, que se manifiesta por la presencia de sólo uno de la mayoría de los orgánulos (mitocondrias, los cloroplastos, pila de Golgi) por celda, y un genoma que contiene sólo ~ 8000 genes. Además, la combinación de unicellularity y fácil cultivo proporciona una plataforma susceptible de enfoques de biología químicos. Recientemente, Ostreococcus ha sido empleado con éxito para estudiar los mecanismos básicos que subyacen a la hora normal circadiano 3-6. Los resultados de este organismo modelo han tenido un impacto no sólo ciencia de las plantas, sino también la biología de los mamíferos 7. Este ejemplo pone de relieve cómo la experimentación rápida en uneucariota sencillo del linaje verde puede acelerar la investigación en organismos más complejos mediante la generación de hipótesis comprobables mediante métodos técnicamente viables sólo en este contexto de menor complejidad. El conocimiento del genoma y la posibilidad de modificar los genes son herramientas esenciales en cualquier especie de modelo. 1 Genómica, transcriptómica 8, 9 y Proteómica información para esta especie está disponible gratuitamente, mientras que los métodos reportados previamente 6,10 para transformar genéticamente Ostreococcus se sabe que pocos laboratorios en el mundo.

En este artículo, los métodos experimentales para transformar genéticamente este organismo modelo nuevo con una sobreexpresión construir mediante electroporación se describen en detalle, así como el método de inclusión de las células transformadas en porcentaje de agarosa de bajo para permitir la selección de líneas transformadas procedentes de una sola transformada celular. A raíz de la aplicación exitosa de OstreocoCCU a la investigación circadiano, el interés creciente en Ostreococcus se puede esperar de diversas áreas de investigación dentro y fuera de las ciencias de las plantas, incluidas las áreas biotecnológicas. Los investigadores de una amplia gama de ciencias biológicas y médicas que trabajan en conservadas vías bioquímicas puede considerar la investigación buscando en Ostreococcus, libre de la complejidad genómica y organismal de las especies modelo más grande.

Protocol

1. Preparación del material de algas

  1. Las células se cultivan en Ostreococcus agua de mar artificial (ASW). Sales del mar (típicamente alrededor de 40 gramos por litro) se disuelven en agua desionizada a una salinidad de 30 ppm, según se mide utilizando un medidor de salinidad. Medio de enriquecimiento 11,12, elementos traza de metales y vitaminas se añaden como se describe en las Tablas 1-3. Los medios de comunicación es entonces esterilizada por filtración a través de un filtro de 0,22 um.
  2. Para el mantenimiento, las células de la cepa Ostreococcus OTTH95 son sub-cultivadas asépticamente a una dilución de 1/100 en fresco ASW cada 7 días y cultivadas bajo luz constante en una planta de crecimiento incubadora equipado con Moonlight Blue filtro. La intensidad de la luz debe estar cerca de 20 mol m -1 -2 s y la temperatura se mantiene a 20 ° C. Las células no requieren agitación constante, pero se agitó una vez cada 2 a 3 días para evitar la agregación.
  3. Para cada transformación, 50 ml de células que se requieren en una celda density de 20-30 x 10 6 ml -1, lo que debe ser alcanzado de 5-7 días después de sub-cultivo. Densidad celular aproximado y axeny se puede determinar utilizando citometría de flujo o un hemocitómetro en un mínimo de magnificación x40.

2. La electroporación

  1. Preparar ADN para la transformación. Para cada transformación, 5 g de ADN puro, el plásmido linealizado se requiere en una concentración de 1 mg / l en agua desionizada estéril. Para obtener este ADN, los autores recomiendan utilizar un kit de Qiagen Midi de preparación, aunque otros métodos podrían funcionar igualmente bien. Digerir el producto con una enzima que corta en el esqueleto del vector utilizado, pero no en el transgén o gen de selección. Además purificar y concentrar el ADN lineal resultante mediante precipitación con etanol, y resuspender el producto en el volumen adecuado de agua de alta calidad desionizada estéril.
  2. Preparar tubos de microcentrífuga que contienen 5 mg de ADN para cada transformación. Una controversial con ningún ADN es necesaria para cada línea celular de ser transformado. Mantener estos tubos en hielo, junto con una cubeta de electroporación de 2 mm para cada transformación.
  3. Preparar 2,2 ml de tampón de resuspensión por transformación. Disolver sorbitol a una solución 1 M en ddH 2 O, añadir 0,1% de ácido Pluronic F68 y filtro esterilizar.
  4. Añadir ácido Pluronic F68, a una concentración final de 0,1% a las células, y el pellet ellos durante 10 minutos a 8000X g en 10 ° C en un tubo de 50 ml con fondo cónico. Inmediatamente resuspender las células en 1 ml de tampón de resuspensión pipeteando arriba y hacia abajo, y transferir a un tubo de microcentrífuga. Haga girar durante 10 minutos a 8000 xg a 10 ° C, y trabajar con rapidez, repita este paso de lavado, una vez más.
  5. Con una punta de corte, resuspender cada final precipitado en 40 l de tampón de resuspensión. Añadir 40 l de las células resuspendidas a cada tubo de ADN linealizado en hielo, mezclar suavemente y transferir a la cubeta de electroporación.
  6. Colocar la cubeta en el electroporación de la máquina. Cambie la configuración de 6 kV cm -1, 600 Ω y 25 mF. Electroporate las células.
  7. Se incuban las células electoporated en las cubetas a temperatura ambiente durante 10 minutos, y utilizar ese tiempo para preparar los frascos de cultivo de tejidos. Etiqueta y añadir 30 ml de ASW fresca a cada uno. Tomar 1 ml de cada frasco y agregar suavemente a la cubeta correspondiente. Incubar durante 2 minutos y retire con cuidado la ASW, que ahora contiene el glóbulo de las células y suave y lentamente la pipeta directamente en la guerra antisubmarina en el frasco de cultivo.
  8. Las células suelen permanecer en un glóbulo. Tenga cuidado de no mover o perturbar a las células agregadas en este momento. Permitir a las células para recuperar en la incubadora durante 1-2 horas, a continuación, volver a suspender agitando los frascos. En este momento, las células deben resuspender libremente y sin grumos debe ser visible. Deja las culturas para recuperar toda la noche en la incubadora.

3. La inclusión de las células en las placas en un medio semisólido

    2 O en una botella que contiene una varilla de agitación. Mantener fundido a 65-90 ° C en un vaso de precipitados grande que contiene agua en un agitador magnético calefacción. Para cada transformación preparar 8 placas de Petri (55 mm de diámetro) y 8 x 15 ml conteniendo cada uno los tubos 9 ml de ASW más la selección requerida. Si se utiliza nourseothricin o G418, utiliza 2 mg / ml.
  1. Recoger las células transformadas de la incubadora. Trabajar en un Flowhood estéril, añadir 1 ml de la ebullición de agarosa LMP a la 9 ml en uno de los tubos. Cerrar el tubo y mezclar por inversión. A continuación, agregue 0,5 ml de células recién transformadas, mezclar rápidamente y verter en el plato. Repita este proceso con los restantes 7 tubos y luego proceder a la transformación del frasco siguiente.
  2. Deja las placas de abrir en la campana de flujo durante una hora, por la agarosa a establecer. A continuación, cierre las placas y los transfieren a los grandes cuadrados placas de Petri, que tendrá 4 platos cada una. Selle el ingenio placas cuadradash parafilm. Nótese que las placas no se establece completamente, y como resultado, el gel es muy frágil. Se debe tener cuidado de no romper el gel al manipular las placas. Coloque todos los platos cuadrados en la incubadora.

4. La selección de colonias transformadas

  1. Las colonias deben aparecer después de 10 a 21 días en las placas de transformación, pero no en las placas falsas transformadas. Para escoger las colonias con una pipeta 200 l con corte de puntas. Sólo tiene que seleccionar las colonias libres y aspirar a la colonia de color verde. Tenga cuidado de no incluir a todas las células de las colonias vecinas.
  2. Transferir las células a 2 ml de medio líquido que contiene la selección, en una placa de 24 pocillos. Cuando se utiliza nourseothricin, utilice 1,75 mg / ml. Mezclar pipeteando arriba y hacia abajo. Seleccione 24-50 colonias por la transformación. Sellar las placas con parafilm y la transferencia a la incubadora.
  3. Después de una semana, deben verterse 100 l de cada pocillo a 2 ml fresca ASW con la selección en una placa de 24 pozos y crecer de una additional 7 días. Supervivientes líneas celulares pueden ser utilizados para estudios posteriores. Integración estable en el genoma y número de inserción debe ser analizado mediante PCR y Southern Blot. El ADN genómico puede obtenerse para estos fines utilizando cualquier método estándar abajo en escala de planta para la extracción de ADN.

5. Los resultados representativos

Las células dividir 1/100 alcanza una densidad de 25 millones de células por mililitro después de crecer durante 7 días. La electroporación de las células con los ajustes apropiados como resultado una constante de tiempo de entre 10 y 14 milisegundos. Cuando las células se transfirieron a un medio en matraces de cultivo, un glóbulo de células deben formar. Al agitarse ligeramente después de una hora, las células con facilidad, deben suspender de nuevo. La inclusión de 1 ml de células transformadas en agar LMP 0,2% debería resultar en un consistente, pero sólo gel semi-sólido. Las colonias deben aparecer después de 10 a 21 días. Cuando la transformación de 5 ug de ADN linealizado utilizando el protocolo anterior, 50-100 colonias por la transformaciónplaca se espera normalmente, versus ninguno en las placas de control negativo. ~ 80% de las colonias recogidas fueron seleccionados positivamente por la resistencia a los antibióticos en medio líquido y se utilizaron en los estudios posteriores.

La concentración final Solución madre Volumen para 1 litro
NaNO 3 8,83 x 10 -4 M 75 g / l H2O 1 ml
NH 4 Cl 3,63 x 10 -5 M 2,68 g / L de H2O 1 ml
β-glicerofosfato 1 x 10 -5 M 2,16 g / L de H2O 1 ml
H 2 SEO 3 1 x 10 -8 M 1,29 mg / L de H2O 1 ml
Tris-base (pH 7,2) 1 x 10 -3 M 121,1 g / L de H2O 1 ml
K traza solución de metal Tabla 2 1 ml
f / 2 solución de vitaminas Tabla 3 0,5 ml

Tabla 1. Los componentes del medio de crecimiento de O. tauri 11, 12. conseguir un volumen total de 1 litro de agua de mar artificial a una salinidad de 30 ppm, y añadir los componentes anteriores de soluciones madre como se indica. Filtrar a esterilizar el medio y su uso dentro de una semana. Las existencias de todos los compuestos excepto la solución de vitaminas pueden ser agrupados para añadir 6 ml de esta solución por cada litro de medio.

La concentración final Solución madre Cantidad para 1 litro
Na 2 2 O 1 x 10 -4 M 41,6 g
FeCl 3 • 6H 2 O 1 x 10 -5 M 3,15 g
Na 2 MoO 4 • 2H 2 O 1 x 10 -8 M 6,3 g / L de H2O 1 ml
ZnSO 4 • 7H 2 O 1 x 10 -9 M 22,0 g / L de H2O 1 ml
CoCl 2 • 6H 2 O 1 x 10 -9 M 10,0 g / L de dH 2 O 1 ml
MnCl 2 • 4H 2 O 1 x 10 -8 M 180,0 g / L de H2O 1 ml
CuSO 4 • 5H 2 O 1 x 10 -8 M 9,8 g / L dH 1 ml

Tabla 2. Trazar solución de metal 11,12. Hacer hasta un total de 1 litro, en dH 2 O, y el calor para disolver. Alícuota de la solución y congelación para su almacenamiento. Las concentraciones finales indicadas se refieren al medio final no, la solución de metales traza.

La concentración final Solución madre Cantidad para 1 litro
La vitamina B 12 1 x 10 -10 M 1 g / l DH 2 O 1 ml
Biotina 1 x 10 -9 M 0,1 g / L de dH 2 O 10 ml
• Tiamina HCl 1 x 10 -7 M 200 mg

Tabla 3. f / 2la vitamina solución de 11. Completar hasta un total de 1 litro en dH 2 O, el filtro a esterilizar, alicuotar y congelar. Las concentraciones finales indicadas se refieren al medio final no, la solución de vitaminas.

Figura 1
Figura 1. Representación gráfica del procedimiento de transformación. Representación esquemática del procedimiento para transformar genéticamente Ostreococcus tauri por electroporación.

Figura 2
Figura 2. Las células de crecimiento Cultura. Son sub-cultivados asépticamente en una dilución de 1/100 en agua dulce ASW cada 7 días y crecido bajo la luz constante en un crecimiento de la planta incubadora equipado con filtro de luz de la luna azul. La intensidad de la luz debe estar cerca de 20 mol m -2 s -1 y la temperatura se mantiene a 20 ° C las células no requieren agitación constante, pero son shaken una vez cada 2 a 3 días para evitar la agregación.

Figura 3
Figura 3. La formación de colonias en el 0,2% de agarosa LMP. Transferencia de 4 platos a un plato de Petri gran plaza, y el sello con parafilm (arriba izquierda). Cuando las colonias se han formado, sólo tiene que seleccionar libres (lo ideal es de forma cónica) colonias (arriba derecha) y aspirar a salir de la placa con una pipeta P200. No debe haber colonias en el control negativo (inferior derecha).

Discussion

Axeny Celular Estado y la cultura es de vital importancia para el procedimiento de transformación. Aunque las células se mantienen normalmente en ciclos de 12 horas de luz, 12 horas oscuro, la eficiencia de transformación en las células cultivadas bajo estas condiciones se encontraron a ser insuficiente. Durante los repetidos granulación / resuspensión pasos, las células deben siempre resuspender fácilmente. Si el agregado células, o de una sustancia con apariencia de moco está presente, es mejor iniciar el procedimiento desde el principio otra vez. Típicamente, ~ 50 colonias se puede esperar en cada placa de transformación, frente a ninguno en la placa de control negativo. En el caso de la eficiencia de transformación bajo, condiciones de cultivo deben ser variados para asegurar las células están en el estado óptimo. Variables que afectan la eficiencia de transformación se encuentran la temperatura ambiente en el laboratorio (en caso de estar cerca de 20 ° C) y velocidad de manipulación (Procedimiento de la sedimentación de células [2,3] para la recuperación [2,7] se deberían tener aproximadamente 1 hora). También es importante que todas las soluciones aRe frescas antes de cada transformación. Para su inclusión en las placas, la concentración de agarosa LMP es crucial. Células Ostreococcus no crecerá en altas concentraciones de agarosa, y se difundirá en bajas concentraciones.

Tres vectores de transformación para Ostreococcus han sido publicados anteriormente 6, y más vectores se espera que se genera y se publicará en breve. El vector existente Pot-Luc 6 permite el uso de un promotor de elección en combinación con una etiqueta C-terminal de la luciferasa de luciérnaga permitiendo la selección de línea más rápida transgénico más manejables patrones de expresión, mientras que el vector Potox 6 lleva el promotor inducible fuerte 13 tomada desde el Ostreococcus Fosfato de alta afinidad Transportador (HAPT) de genes para la sobreexpresión del gen de interés. El vector Potox-Luc deriva de Potox, llevando un marcador luciferasa adicional que puede ser utilizado para la selección indirecta de las líneas de sobreexpresión Ostreococcus son altamente resistentes a muchos antibióticos, y las concentraciones de los compuestos necesarios para la selección de las células transgénicas Ostreococcus es mayor que para los sistemas de modelo convencional (2 mg / ml).

Aunque el proceso parece ineficiente, el gran número de células y el ADN plásmido necesaria para este procedimiento no plantea ningún obstáculo significativo. Una limitación más importante es que cada línea generada que es resistente al marcador seleccionable necesita ser analizada individualmente para comprobar que toda la estructura se integra en el ADN. Hemos observado ejemplos en los que la expresión con éxito de la marcador seleccionable no corresponden a la inserción del gen de interés real; integraciones parciales, es decir puede ocurrir. Evidentemente, la inserción aleatoria en el genoma también significa que no hay control de la zona de inserción utilizando este método, y b métodoson base en la recombinación homóloga se están desarrollando actualmente. Sin embargo, el método descrito aquí es, a nuestro leal saber y entender, actualmente el único método caracterizado para generar células modificadas genéticamente Ostreococcus.

Como Ostreococcus tauri sólo recientemente ha sido utilizado como un organismo modelo experimental, la mayoría de los métodos de trabajo con estas células es probable que evolucionar y ser refinado por la comunidad científica cada vez más involucrados. Este protocolo está pensado para ayudar a la gente a iniciar el trabajo con Ostreococcus, pero de ninguna manera pretende describir todo lo que hay que saber acerca de la transformación genómica de esta microalga. Los autores la confianza que los lectores serán capaces de adaptar este protocolo a sus propias necesidades como las pequeñas diferencias en las incubadoras (los niveles de luz o de calidad) y otros parámetros que existen y que probablemente tienen que ser optimizadas en cada laboratorio en particular para obtener las culturas saludables necesarios para este protocolo. Después de dominar las técnicas descritas aquí,vectores pueden ser construidos para generar fluorescente luminiscente, u otros etiquetados líneas de fusión bajo el control de una amplia gama de promotores. Esta plataforma apasionante novela experimental será útil para estudiar cómo complicados problemas bioquímicos se resuelven en un eucariota de la reducción de la complejidad, en que los enfoques farmacológicos son muy facilitada 3.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

SynthSys un Centro para la Biología de Sistemas Integral financiado por el BBSRC y adjudicación EPSRC D019621. 6 º PM de la UE Red de Excelencia "Genómica Marina" subvención a FYB ha financiado el desarrollo de métodos de transformación genética.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium constituents
Instant Ocean Marine Salt from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk
NaNO3 S5506-250G Sigma
NH4Cl A9434-500G Sigma
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate G9422-100G Sigma
H2SeO3 84920-250G Sigma
Ultra pure tris 15504-020 Invitrogen
Na2EDTA∙2H2O BPE120-500G Fisher Scientific
FeCl3∙6H2O 157740 Sigma
Na2MoO4∙2H2O 31439-100G-R Sigma
ZnSO4∙7H2O Z0251 Sigma
CoCl2∙6H2O 31277 Sigma
MnCl2∙4H2O 203734-5G Sigma
CuSO4∙5H2O C8027 Sigma
Vitamin B12 (cyanocobalamin) V2876 Sigma
Biotin 47868 Sigma
Thiamine ∙ HCl T4625 Sigma
Ampicillin A9518-25G Sigma
Neomycin N6386 Sigma
Kanamycin K4000 Sigma
Consumables for culturing
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
TPP Bottle top filters, 1L, complete 99950T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 500ml, 99500T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 250ml, 99250T Helena Bioscience
TPP Bottle top filters, 150ml, 99150T Helena Bioscience
Salinity Meter for Marine Aquarium DSG-10 Daeyoon
Chemicals for transformation
D-Sorbitol S6021-1KG Sigma
Pluronic F-68 solution P5556-100ML Sigma
ClonNat 51000 Werner
Low melting point agarose 16520-050 Invitrogen
Consumables for transformation
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1810.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1813.502 Starstedt
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel 83.1812.502 Starstedt
Greiner centrifuge tubes 50ml 227261 GBO
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 165-2086 Bio-Rad
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 391-0895 VWR International
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm FB51788 Fisher Scientific
Moonlight Blue light filter 183 Lee Lighting

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References

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