एक क्रिटिकल आकार Calvarial दोष मॉडल वसा से व्युत्पन्न Stromal Lipoaspirate से काटा कोशिकाओं का उपयोग की मरम्मत

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Summary

इस प्रोटोकॉल के अलगाव का वर्णन वसा व्युत्पन्न एक 4 मिमी महत्वपूर्ण आकार calvarial कंकाल उत्थान का मूल्यांकन करने के दोष के lipoaspirate और निर्माण से stromal कोशिकाओं.

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Lo, D. D., Hyun, J. S., Chung, M. T., Montoro, D. T., Zimmermann, A., Grova, M. M., Lee, M., Wan, D. C., Longaker, M. T. Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate. J. Vis. Exp. (68), e4221, doi:10.3791/4221 (2012).

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Abstract

Craniofacial कंकाल की मरम्मत और उत्थान स्टेम कोशिकाओं का उपयोग एक सेल आधारित दृष्टिकोण के माध्यम से डी Novo ऊतक गठन का वादा करता है. वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं (ASCs) multipotent स्टेम osteogenic, chondrogenic, वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला, और myogenic भेदभाव के दौर से गुजर के सक्षम कोशिकाओं का एक प्रचुर स्रोत हो सिद्ध कर दिया है. कई अध्ययनों से पता vivo में सेलुलर वितरण के लिए विभिन्न मचान biomaterials के उपयोग के साथ इन कोशिकाओं के osteogenic क्षमता का पता लगाया है. यह दिखा दिया है कि एक osteoconductive, hydroxyapatite लेपित पाली (लैक्टिक - सह - glycolic एसिड) (हा PLGA) ASCs साथ पाड़ वरीयता प्राप्त है, एक महत्वपूर्ण आकार calvarial दोष, दोष कि अपने सहज से गुजरना असमर्थता द्वारा परिभाषित किया गया है का उपयोग करके जानवर के जीवन पर चिकित्सा, प्रभावी ढंग से मजबूत हड्डीवाला उत्थान दिखा सकते हैं. Vivo मॉडल में यह translational अस्थि ऊतक को पुनर्जीवित करने के उद्देश्य से दृष्टिकोण के आधार को दर्शाता है सेलुलरघटक और जैविक मैट्रिक्स. इस पद्धति का एक विशिष्ट ऊतक दोष की मरम्मत की दिशा में एक पूर्वज सेल के अंतिम नैदानिक ​​आवेदन के लिए एक मॉडल के रूप में कार्य करता है.

Protocol

1. सेल अलगाव और विस्तार

  1. सभी मरीजों की सहमति और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की समीक्षा की और स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (प्रोटोकॉल 2188 और # 9999) ने मंजूरी दे दी है.
  2. स्थानीय / सामान्य संज्ञाहरण के तहत वैकल्पिक lipoaspiration प्रक्रियाओं से मानव चमड़े के नीचे वसा ऊतकों से प्राप्त करते हैं.
  3. वहाँ lipoaspirate में दो परतों (चित्रा 1 ए) हो जाएगा. तैरनेवाला प्रसंस्कृत सेलुलर सामग्री के विशाल बहुमत होता है. नीचे की परत ज्यादातर खारा इंजेक्शन वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं या तो परत से काटा जा सकता है, लेकिन उपज ज्यादा तैरनेवाला से अधिक है.
  4. Stromal संवहनी अंश SVF () अलग lipoaspirate बड़े पैमाने पर धो 1X के बराबर मात्रा फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस) 2.5% (x2) Betadine 1X पीबीएस (x1) के बराबर मात्रा Betadine बिना द्वारा पीछा युक्त के साथ. वेग धोने की अनुमति दें.
  5. बाँझ ते बनाए रखने के लिए सावधान रहोइस प्रक्रिया भर में प्रसंस्कृत मानव ऊतकों के साथ प्रदूषण के रूप में chnique हो सकता है.
  6. नीचे की परत Aspirate और प्रत्येक धोने के बाद त्यागें.
  7. 50 मिलीलीटर BD फाल्कन शंक्वाकार ट्यूब में 15 मिलीलीटर वसा ऊतकों की अशेष भाजक.
  8. वसा ऊतकों को पचाने के फ़िल्टर्ड 0.075% प्रकार द्वितीय कोलैजिनेज के एक समान (15 मिलीग्राम) हांक संतुलित नमक के घोल में (HbSS) की मात्रा 37 में डिग्री सेल्सियस एक पानी के स्नान में 60 मिनट के लिए लगातार आंदोलन के तहत (लगभग 180 / मिनट हिलाता है) के साथ - प्रत्येक ट्यूब हर 15 मिनट हवादार करना.
  9. 15 मिलीलीटर पीबीएस 1,000 rpm पर 4 में 5 मिनट के लिए 10% (भ्रूण गोजातीय सीरम) FBS, और अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस युक्त प्राप्त करने के लिए एक उच्च घनत्व SVF गोली के साथ एंजाइम गतिविधि बेअसर. गोली वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं और एरिथ्रोसाइट्स के एक मिश्रण होगा.
  10. गोली में खलल न डालें बिना तैरनेवाला त्यागें.
  11. पारंपरिक विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर (है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम [DMEM] / 10% 1 / FBS% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान) में गोली Resuspend.
  12. तक suspen एक 100 सुक्ष्ममापी नायलॉन सेल सेलुलर मलबे को हटाने झरनी के माध्यम से सायन.
  13. एक साफ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में 3 ट्यूबों का मिश्रण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र
  14. गोली में खलल न डालें बिना तैरनेवाला त्यागें.
  15. पारंपरिक विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर में गोली Resuspend
  16. एक 10 सेमी थाली या एक 15 सेमी प्लेट के लिए पाँच 50 मिलीलीटर conicals प्रति दो 50 मिलीलीटर conicals जुडा.
  17. प्राथमिक संस्कृतियों रातोंरात की स्थापना 37 ° C/21% 2 हे, 5% सीओ 2.
  18. रातोंरात ऊष्मायन के बाद, प्लेटें पीबीएस के साथ बड़े पैमाने पर अवशिष्ट गैर पक्षपाती लाल रक्त कोशिकाओं को दूर धो लो. परिणामस्वरूप सेल आबादी वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं हैं.
  19. उप संगामी स्तर में कोशिकाओं को 37 ° C/21% 2 हे, 5% सीओ 2 विकास मीडिया में सहज भेदभाव को रोकने के बनाए रखें. कोशिकाओं को आम तौर पर हर तीन से चार दिनों नियमित रूप से विकास मीडिया में विभाजित किया जा सकता है जब 50% संगम पर चढ़ाया की जरूरत है.
ve_title "> 2. पाड़ तैयारी

  1. दंत चिकित्सा के स्कूल - scaffolds कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में डॉ. मिन ली, लॉस एंजिल्स द्वारा किए गए थे.
  2. PLGA scaffolds 85/15 पाली (लैक्टिक - सह - glycolic एसिड) (निहित चिपचिपापन = 0.61 / डेसीलीटर छ, बर्मिंघम पॉलिमर) से विलायक कास्टिंग और एक कण leaching प्रक्रिया द्वारा गढ़े गए थे.
  3. 92% (मात्रा अंश) porosity, और एक Teflon मोल्ड में पतली शीट में संकुचित प्राप्त PLGA / क्लोरोफॉर्म समाधान 200-300 सुक्ष्ममापी व्यास sucrose के साथ मिलाया गया.
  4. रातोंरात फ्रीज सुखाने के बाद, scaffolds डबल - आसुत (डीडी) एच 2 हे तीन परिवर्तन में डूब गया था sucrose भंग, और धीरे एक ठीक टिप रंग के साथ Teflon थाली से हटा दिया.
  5. कण leaching के बाद, 50%, 60% और 70% इथेनॉल में सभी scaffolds विसर्जन द्वारा कीटाणुरहित प्रत्येक के लिए 30 मिनट, DDH 2 ओ के तीन rinses द्वारा पीछा
  6. सभी scaffolds एक लामिना का प्रवाह हुड के नीचे सूख गया.
  7. बाद पाड़ निर्माण,caffolds एपेटाइट साथ लेपित रहे थे.
    1. एसबीएफ समाधान (सिम्युलेटेड शरीर के तरल पदार्थ) आयन सांद्रता कि 5 बार थे कि मानव रक्त प्लाज्मा के साथ तैयार किया गया था. सभी समाधान 0.22 सुक्ष्ममापी PES झिल्ली (Nalgene) के माध्यम से फ़िल्टर्ड बाँझ थे. तुरंत कोटिंग की प्रक्रिया से पहले सूखे, PLGA scaffolds चमक निर्वहन, argon प्लाज्मा नक़्क़ाशी (Harrick वैज्ञानिक) गीला और कोटिंग एकरूपता में सुधार के लिए किए गए थे.
    2. 12 घंटे के लिए एक पानी तख्ताबंदीवाला इनक्यूबेटर अंदर Etched PLGA scaffolds फिर 37 पर थे SBF में incubated ° सी, 2 मिलीग्राम + और ​​HCO 3 - एक और 12 घंटे के लिए नि: शुल्क 2 37 एसबीएफ ° सी कोमल सरगर्मी के तहत.
    3. लेपित PLGA scaffolds धीरे बाँझ DDH 2 हे के साथ rinsed थे दूर अतिरिक्त सोडियम क्लोराइड समाधान, एक लामिना का प्रवाह हुड में सूखे और 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित धो लो.
    4. एपेटाइट कोटिंग की वफ़ादारी एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) के साथ विश्लेषण किया गया. एपेटाइट लेपित scaffolds SEM stubs (टेड पेला) पर रखा गया था और के लिए चालकता में सुधार करने के लिए कार्बन के साथ लेपित. माध्यमिक इलेक्ट्रॉन मोड SEM अवलोकन (फी / फिलिप्स XL-30) के दौरान लागू किया गया था. ऊर्जा फैलाव स्पेक्ट्रम एक्स - रे एपेटाइट संरचनाओं के मौलिक रचना की पुष्टि करने के लिए प्राप्त हुई थी.

3. सेल सीडिंग

  1. उप संगम स्तर तक पहुँचने पर, पीबीएस (x2) के साथ कोशिकाओं को धोने और trypsinize.
  2. कोशिकाओं गणना बोने के लिए मात्रा ठहराना
  3. पूर्व में कटौती 1.5 x 10 5 कोशिकाओं के साथ 4.0 मिमी व्यास scaffolds पर बीज.
    1. एक 96-अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में प्लेस व्यक्ति पाड़
    2. लगभग 1.5 x 10 मीडिया के 20 μl प्रति 5 कोशिकाओं के एक एकाग्रता के साथ पुनः स्थगित नियमित रूप से विकास मीडिया में कोशिकाओं
    3. पाड़ पर सीधे सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 20 μl और जगह pipet.
    4. 30 मिनट के बाद मीडिया के 200 μl जोड़ने और कोशिकाओं सेते हैं करने के लिए अनुमति देते हैं.पाड़ पर रातोंरात सर्जरी से पहले
    5. यह कोशिकाओं के एक पर्याप्त संख्या में बोने के रूप में पाड़ पर कोशिकाओं के आसंजन यह सुनिश्चित करेंगे कि एक बहुमत पाड़ पर देते हैं जाएगा करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक नहीं है. यह bioluminescence और histological विश्लेषण के साथ vivo में हमारी प्रयोगशाला में मान्य किया गया है.

4. Calvarial दोष और Vivo आरोपण में निर्माण

  1. Anesthetize वयस्क (60 दिन पुरानी) चतनाशून्य करनेवाली औषधि कॉकटेल के साथ CD-1 नग्न चूहों. (Ketamine / / xylazine acepromazine) में 50% एकाग्रता (0.9% NaCl के साथ कमजोर पड़ने 01:01) या संस्था प्रोटोकॉल प्रति सिफारिश संवेदनाहारी आहार के प्रति. इन चूहों athymic इतना hASCs एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण नहीं होगा.
    1. खुराक: Ketamine हाइड्रोक्लोराइड (80 मिग्रा / किग्रा), Xylazine Acepromazine (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) (2.5 मिलीग्राम / किग्रा)
    2. प्रभाव: लगभग 30 मिनट की अवधि
  2. शल्य चिकित्सा पशु टांगना और शल्य बाँझ बनानाBetadine और शराब (x3) के साथ साइट और मरहम के साथ माउस आँखें जानवर की खोपड़ी में एक midline बाण के समान चीरा बनाने के लिए सही पार्श्विका हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए पहले से कवर. कुंद scraping (चित्रा 1 बी) के साथ सही पार्श्विका हड्डी से कपाल निकालें.
  3. एकतरफा 4 मिमी सही गैर सीवन संबद्ध पार्श्विका हड्डी में दोष पूर्ण मोटाई एक बाँझ हीरे लेपित ईस यंत्र के व्दारा शल्यक्रिया करना ड्रिल बिट का उपयोग अत्यधिक सावधानी बनाएँ माउस calvarial मोटाई के रूप में अंतर्निहित ड्यूरा मेटर (चित्रा 1B) परेशान नहीं लिया जाना चाहिए. <.3 मिमी है.
  4. आरोपण से पहले, बाँझ पीबीएस के साथ से scaffolds कुल्ला लिए मध्यम व्युत्पन्न वृद्धि कारकों के हस्तांतरण को रोकने के लिए.
  5. दोष में पाड़ रखें.
  6. अंत में सिवनी, त्वचा बंद कर दिया और स्थापित पश्चात प्रोटोकॉल प्रति पशु की निगरानी.
  7. स्थापित analgesia का उपयोग के रूप में अपने पशुओं की देखभाल प्रोटोकॉल के बाद operatively - उदा की जरूरत द्वारा निर्देशित है. buprenorphine 0.1 मिलीग्राम / kजी.

5. Osteoid गठन की मात्रा

  1. बाद microCT माउस पर प्रदर्शन किया था, तीन आयामी छवि MicroView सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के रूप में पहले से वर्णित 1 पुनर्निर्मित किया गया.
  2. एडोब फ़ोटोशॉप का उपयोग, छवियों को एक मानक ऊंचाई आकार थे.
  3. जादू की छड़ी सुविधा का उपयोग करना, पिक्सल calvarial दोष के मापा गया.
  4. दोष का प्रतिशत चिकित्सा बाद सीटी स्कैन calvarial दोष क्षेत्र को मापने और पिक्सेल संख्या का निर्धारण करने और यह मूल दोष पिक्सेल संख्या से विभाजित करके निर्धारित किया गया था
  5. नतीजतन, अगर microCT अनुपलब्ध है, एक वैकल्पिक Adobe Photoshop का उपयोग कर रहा है और ऊतक विज्ञान के लिए निर्धारित समय बिंदुओं पर कैलवेरिया संचयन.
  6. Aniline ब्लू और Pentachrome जैसे histological दाग है कि osteoid गठन निरूपित, दोष की अवधि के साथ कई वर्गों दाग होना चाहिए
  7. Adobe Photoshop, सभी क्षेत्रों में नहीं कर रहे हैं कि बाहर फसल का उपयोगcalvarial दोष में
  8. जादू की छड़ी की सुविधा का प्रयोग करें और दोष के क्षेत्र में डी Novo हड्डी गठन के पिक्सेल संख्या का निर्धारण और नियंत्रण या अन्य चर के लिए तुलना.

6. प्रतिनिधि परिणाम

वसा ऊतकों नैदानिक ​​आवेदन के लिए पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की पीढ़ी में एक महत्वपूर्ण भूमिका में सेवा की क्षमता है. वसा ऊतकों एक अनूठा लाभ है कि वहाँ एक आसानी से उपलब्ध आपूर्ति है कि एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है कि न्यूनतम रुग्णता और मृत्यु दर में काटा जा सकता है है. एक बार ऊतक काटा और एकत्र, हमारे प्रोटोकॉल चित्रा 2 में उल्लिखित है. वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं वाशिंग चरणों का की एक श्रृंखला, कोलैजिनेज पाचन, और centrifugation के माध्यम से अलग कर रहे हैं. एक बार कोशिकाओं संस्कृति में चढ़ाया जाता है, वे का विस्तार किया जा सकता है और इन विट्रो में विभिन्न भेदभाव प्रोटोकॉल में रखा, या सीधे vivo में रखा.

सी4 मिमी महत्वपूर्ण आकार calvarial दोष के reation एक आसानी से सुलभ और vivo मॉडल हमारे वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं की osteogenic भेदभाव करने की क्षमता का परीक्षण करने में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रदान करता है. MicroCT के उपयोग के माध्यम से, हम vivo में कंकाल ऊतक के गठन का पालन करने के लिए और हमारे हस्तक्षेप (3 चित्रा) की प्रगति को ट्रैक करने में सक्षम हैं. महत्वपूर्ण आकार calvarial दोष जानवर के जीवन भर के भीतर ठीक नहीं है और हम देखते हैं 8 सप्ताह के आसपास के लगभग 90% दोष पेटेंट रहना होगा. ही पाड़ (चर्चा देखने के) osteogenic आगमनात्मक गुण है और कुछ बोनी उत्थान के लिए प्रेरित करने की क्षमता दिखाई है. कोशिकाओं बिना पाड़ प्लेसमेंट के विशिष्ट परिणाम से पता चलता है कि एक दोष के एक तिहाई के आसपास डी Novo 8 सप्ताह में हड्डी गठन होगा. वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं की वृद्धि के साथ पूरी तरह से लगभग 8 सप्ताह में दो - तिहाई या दोष का अधिक हड्डीवाला उत्थान दिखाने हालांकि वहाँ variab हैप्रत्येक जानवर और सर्जरी के बीच ility. कंकाल ऊतक के गठन के माध्यम से ऊतक विज्ञान मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और ठेठ परिणाम Aniline ब्लू और Pentachrome धुंधला हो जाना (चित्रा -3 सी) के माध्यम से ASCs के साथ वृद्धि हुई नमूनों में osteoid गठन दिखा. इसके अलावा, हम बताते हैं कि प्रत्यारोपित मानव कोशिकाओं GFP-की लेबल hASCs है कि vivo में डी Novo calvarial दोष में हड्डी गठन के क्षेत्र के निकट 2 सप्ताह में धुंधला हो दिखाने के प्रयोग के माध्यम से अंतर्निहित डी Novo हड्डीवाला गठन के लिए योगदान (चित्रा 3 डी) . इसके अतिरिक्त, हम मानव विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunohistochemistry का उपयोग करने के लिए दोष के क्षेत्र (3E चित्रा) में मानव सेल अस्तित्व और योगदान दिखाने.

चित्रा 1
चित्रा 1 एक - lipoaspirate दो परतों है. ऊपर परत adipocytes और जनसंपर्क के बहुमतसेलुलर सामग्री ocesses जबकि नीचे की परत lipoaspiration प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया खारा होता है. बी - कपाल पर एक midline चीरा अंतर्निहित ड्यूरा मैटर के व्यवधान के बिना सही पार्श्विका हड्डी, एक 4 मिमी महत्वपूर्ण आकार calvarial दोष के बाद निर्माण अलग माध्यम से calvarial दोष के निर्माण.

चित्रा 2
चित्रा 2 कटाई और lipoaspirate की अनुप्रयोग वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं के अलगाव से अपनी विस्तार, भेदभाव, और इन विट्रो में और vivo में उपयोग का अवलोकन.

चित्रा 3
चित्रा 3 hyd के माध्यम से ASCs के आवेदन के साथ महत्वपूर्ण आकार calvarial दोष के vivo चिकित्सा में दिखा microCTroxyapatitie पाड़ (नीचे पंक्ति). - नियंत्रण पाड़ और दोष नहीं (शीर्ष पंक्ति) और दोष पाड़ के स्थापन के साथ कोशिकाओं (मध्य पंक्ति) बी के बिना ASC समूह में काफी वृद्धि हुई चिकित्सा दिखा microCT से हड्डीवाला चिकित्सा की मात्रा में शामिल हैं. सी - प्रोटोकॉल Aniline ब्लू और Pentachrome धुंधला हो जाना के माध्यम से ASC समूह (नीचे पंक्ति) की वृद्धि हुई osteoid गठन दिखा. Aniline ब्लू के लिए, osteoid दाग गहरे नीले और Pentachrome, पीला osteoid दाग के लिए. डी - GFP साथ लेबल hASCS एक पाड़ पर वरीयता प्राप्त कर रहे थे और एक calvarial दोष में रखा और 2 सप्ताह में बलिदान. धुंधला GFP लेबल एंटीबॉडी मानव कोशिकाओं दोष के क्षेत्र में उत्थान के लिए योगदान दिखाने के साथ किया गया था. ई - मानव परमाणु प्रतिजन 2 सप्ताह में दोष के क्षेत्र में मानव कोशिकाओं के प्रसार दिखा immunohistochemistry बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

वसा के अलगाव के बाद से व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं lipoaspirate से 2, इन कोशिकाओं सेलुलर प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता में विभेदित किया है. वसा ऊतक mesodermal मूल से है और इसलिए, multipotent वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं की संभावना एक mesodermal वंश के प्रति आवेदन के साथ सबसे प्रभावी हो जाएगा. कंकाल ऊतक उत्पन्न करने की क्षमता विशेष रूप से एक autograft लिए दाता साइटों और संक्रमण, अस्वीकृति, और 3 बार से अधिक टूटने सहित सिंथेटिक सामग्री के निहित सीमाओं की कमी को देखते हुए महत्वपूर्ण है. वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं एक अपेक्षाकृत बड़े शल्य फसल के प्रति उपज 4 के साथ एक संभावित गैस से झाल लगाना multipotent सेल लाइन की पेशकश करते हैं.

Stromal संवहनी अंश और वसाकोशिका ऊतक के प्रसंस्करण के दौरान, यह उत्कृष्ट बाँझ तकनीक को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. प्राथमिक संस्कृति का एक संक्रमण के बड़े जोखिम lipoa की थोक प्रकृति दिया हैबाँझ सेल संस्कृति हुड के बाहर कदम के साथ धोने, पाचन, और centrifugation के कई कदम के साथ संयुक्त spirate. एक बार गोली पकवान पर चढ़ाया हुआ है, दिखाई कोशिकाओं के बहुमत eyrthrocytes होगा. ये बाँझ पीबीएस के साथ धुल सकता है एक बार वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं थाली या लाल रक्त कोशिका lysis बफर का पालन किया है जोड़ा जा सकता है. यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं प्रारंभिक चढ़ाना कदम पर अपेक्षाकृत सहधारा हैं क्रम में करने के लिए उचित विकास और भेदभाव सुनिश्चित.

कैसे बिल्कुल वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए पर कोई आम सहमति नहीं है. जबकि वहाँ अध्ययन किया गया है प्रवाह cytometry के माध्यम से सेल सतह मार्कर के आधार पर कोशिकाओं के इन आबादी को परिभाषित करने की कोशिश कर रहा है, एक परिभाषित सेट या मार्कर खोजने मुश्किल हो गया है. यह रोगी जनसंख्या में परिवर्तनशीलता और प्ररूपी बहाव के कारण होने की संभावना है कि इन विट्रो में अलग सेल संस्कृति के वातावरण के तहत इन कोशिकाओं अनुभव और क़दम में परिवर्तनशीलताऋषि संख्या. सेलुलर थेरेपी के लिए इंटरनेशनल सोसायटी ने कहा कि कम से कम, एक mesenchymal स्टेम सेल CD105 की अभिव्यक्ति, CD90, CD73 सहित कुछ विशेषताएं होनी चाहिए, जबकि CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α, CD19, और एचएलए DR-5 कमी. इन कोशिकाओं के बहु - शक्तिशाली प्रकृति की मूल परिभाषा इन विट्रो में mesodermal प्रजातियों की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए करने की उनकी क्षमता से आया था और इन प्रोटोकॉल आसानी से उपलब्ध हैं.

महत्वपूर्ण आकार calvarial दोष मॉडल मॉडल के रूप में मान्य किया गया है कंकाल दोनों murine वसा व्युत्पन्न stromal 6 कोशिकाओं और मानव व्युत्पन्न वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं 1 उत्थान का उपयोग अध्ययन. जानवर के जीवन भर में एक 4 मिमी एक माउस के सही पार्श्विका कैलवेरिया में दोष का निर्माण ठीक नहीं होगा. इसलिए, किसी भी देखा चिकित्सा calvarial दोष के भीतर रखा उपचार की वजह से है. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान, यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है inju नहींफिर अंतर्निहित ड्यूरा मैटर. ड्यूरा मैटर ही अस्थिजनन प्रोत्साहित करना और किसी भी चोट काफी calvarial 7 दोष चिकित्सा की प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं कर सकते हैं.

स्टेम कोशिकाओं के लिए एक तंत्र के रूप में उपयोग च पाड़ कंकाल इंजीनियरिंग की दुनिया में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. कंकाल ऊतक के समारोह में विशिष्ट मैक्रो पर्यावरण के तीन आयामी संरचना से संबंधित है. उचित पाड़ केवल vivo में स्टेम सेल वितरण में सहायता, कर सकते हैं लेकिन यह भी बढ़ाया osteogenic गुणों के माध्यम से ही पाड़ के अस्थिजनन बढ़ाने के. हमारी प्रयोगशाला PLGA इस सामग्री के osteoinductive और osteoconductive गुण के कारण रीढ़ की हड्डी पर hydroxyapatite, एक कैल्शियम व्युत्पन्न, शामिल हैं. हालांकि, वहाँ पाड़ निर्माण के लिए कई अन्य विकल्प है कि मजबूत osteoinductive और osteoconductive 8 गुण, 9 हो सकता है कर रहे हैं. इसके अलावा, पाड़ भी शक्तिशाली इस तरह के adjuvants देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैके रूप में छोटे अणुओं 10, 11 और वैक्टर नीचे दस्तक करने के लिए या जीन 12 लक्ष्य, 13 upregulate.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम उनके और हमारे शोध का समर्थन और सहयोग के के डॉ. जॉर्ज कॉमन्स और डॉ. डीन Vistnes धन्यवाद करना चाहते हैं. इस काम के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल और craniofacial अनुसंधान 1 DE019274 R21-01 अनुदान, R01EB009689 और RC2 DE020771-02, ओक फाउंडेशन और बाल MTL डा. ह्यून पुनर्योजी चिकित्सा के लिए Hagey प्रयोगशाला द्वारा समर्थित है सेंट जोसेफ दया अस्पताल GME द्वारा समर्थित है .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipoaspirate Harvest
PBS Gibco 10010-023
Hank's Balanced Salt Solution Cellgro 21-023-CV
Collagenase Sigma C6885-500MG
Cell Strainer 100 μm BD Falcon 352360
Steri-top 500 ml .22 μm filter Millipore SCGPT05RE
Calvarial Defect
Z500 Brushless MicromotorsUM50C NSK NSKZ500
Circular Knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40

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References

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Comments

2 Comments

  1. How did you create your bone tissue constructs to maintain the proper thickness in the calvarial defect? You mention the scaffold diameter but not the thickness.

    Reply
    Posted by: Karin W.
    April 24, 2013 - 12:08 PM
  2. The HA-PLGA scaffolds were designed to mimic the thickness of native calvarial bone. The thickness of the HA-PLGA scaffolds are measured using SEM analysis and range from 500-700 um.

    Reply
    Posted by: Mike T.
    April 25, 2013 - 6:43 PM

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