إصلاح نموذج الحرجة الحجم عيب قبي طريق الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية المقطوع Lipoaspirate

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا البروتوكول يصف عزل الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية lipoaspirate وإنشاء عيب 4 مم الحرجة الحجم قبي لتقييم تجديد الهيكل العظمي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lo, D. D., Hyun, J. S., Chung, M. T., Montoro, D. T., Zimmermann, A., Grova, M. M., Lee, M., Wan, D. C., Longaker, M. T. Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate. J. Vis. Exp. (68), e4221, doi:10.3791/4221 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إصلاح الهيكل العظمي القحفي وتجديد عروض الوعد تشكيل الأنسجة دي نوفو من خلال نهج يستند إلى الخلية باستخدام الخلايا الجذعية. وقد أثبتت الدهنية المستمدة من الخلايا اللحمية (مخولا لصيانة طائرات) لتكون مصدرا للخلايا الجذعية وافرة متعددة القدرات قادرة على تمر المكونة للعظم، والتمايز مكون للغضروف، مكون الشحم، وعضلي. واستكشفت العديد من الدراسات إمكانية المكونة للعظم هذه الخلايا في الجسم الحي مع استخدام المواد الحيوية المختلفة سقالات للتسليم الخلوية. وقد تجلى ذلك من خلال الاستفادة من ذلك osteoconductive، هيدروكسيباتيت المغلفة بولي (اللبنيك-CO-الجليكوليك حمض) (HA-PLGA) سقالة مع المصنف مخولا لصيانة طائرات، عيب الحرجة الحجم قبي، عيب التي تم تعريفها بواسطة عدم قدرتها على الخضوع عفوية يمكن الشفاء على مدى عمر الحيوان، أن تظهر على نحو فعال تجديد عظمي قوي. هذا نموذج الجسم الحي في يدل على أساس النهج متعدية تهدف لتجديد أنسجة العظام - الخلويةوعنصر مصفوفة البيولوجية. هذا الأسلوب يخدم كنموذج لتطبيق السريرية النهائي للخلية السلف نحو إصلاح خلل الأنسجة محددة.

Protocol

1. عزل الخلايا والتوسع

  1. واستعرضت جميع وموافقة المريض البروتوكولات التجريبية والتي وافق عليها مجلس جامعة ستانفورد المراجعة المؤسساتي (البروتوكول # # 2188 و9999).
  2. الحصول على الأنسجة الدهنية تحت الجلد البشري من الإجراءات الانتخابية تحت lipoaspiration المحلية / التخدير العام.
  3. سيكون هناك طبقتين في lipoaspirate (الشكل 1A). طاف يحتوي على الغالبية العظمى من المواد الخلوية المصنعة. في الغالب يتم حقن الطبقة السفلية المالحة. الدهنية المشتقة يمكن أن تحصد من الخلايا اللحمية إما طبقة، ولكن العائد أكبر بكثير من طاف.
  4. لعزل جزء اللحمية الأوعية الدموية (SVF)، وغسل lipoaspirate على نطاق واسع مع أحجام متساوية من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تحتوي على 2.5٪ betadine (X2)، تليها حجم مساو من 1X PBS (X1) دون betadine. السماح لغسل الراسب.
  5. كن حذرا للحفاظ على الشركة المصرية للاتصالات عقيمةيمكن chnique في جميع مراحل العملية والتلوث مع الأنسجة البشرية المجهزة يحدث.
  6. نضح الطبقة السفلية وتجاهل بعد كل غسل.
  7. قسامة 15 مل من الأنسجة الدهنية في 50 مل أنابيب الصقر BD المخروطية.
  8. هضم الأنسجة الدهنية مع حجم مساو (15 مل) من تصفية 0،075٪ النوع الثاني كولاجيناز في الحل هانك ملح المتوازن (HBSS) عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 60 دقيقة تحت التحريض المستمر (حوالي 180 يهز / دقيقة) - كل أنبوب تهوية كل 15 دقيقة.
  9. تحييد نشاط انزيم مع 15 مل PBS تحتوي على 10٪ (مصل بقري جنيني) FBS، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية للحصول على الكثافة العالية SVF بيليه. سوف يكون بيليه مزيج من الخلايا الدهنية المشتقة اللحمية والكريات الحمراء.
  10. تجاهل طاف دون الإخلال بيليه.
  11. إعادة تعليق بيليه في 10 مل من وسائط النمو التقليدية (Dulbecco في النسر متوسطة معدلة [DMEM] / 10٪ FBS / 1٪ البنسلين الستربتوميسين الحل).
  12. مرشح suspen سيون من خلال مصفاة الخلية ميكرومتر 100 النايلون لإزالة الحطام الخلوية.
  13. الجمع بين 3 أنابيب نظيفة في واحدة مخروطية 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في C. ° 4
  14. تجاهل طاف دون الإخلال بيليه.
  15. إعادة تعليق بيليه في 5 مل من وسائل الإعلام التقليدية النمو
  16. الجمع بين كل منهما 50 مل لكل conicals لوحة واحدة 10 سم أو خمسة conicals 50 مل لوحة واحدة 15 سم.
  17. إنشاء الثقافات الأولية بين عشية وضحاها في 37 درجة C/21٪ O 5٪ CO 2.
  18. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، تغسل الصحون على نطاق واسع مع PBS لإزالة المتبقي غير ملتصقة خلايا الدم الحمراء. السكان الخلية الدهنية الناتجة المستمدة من الخلايا اللحمية.
  19. الحفاظ على خلايا في شبه متموجة المستويات لمنع التمييز التلقائي عند 37 درجة C/21٪ O 5٪ CO 2 في وسائل الإعلام النمو. الخلايا عموما بحاجة إلى أن تنقسم كل ثلاثة أو أربعة أيام في وسائل الإعلام العادية النمو عند التقاء في مطلي 50٪.
ve_title "> 2 إعداد سقالة.

  1. وأدلى الدكتور السقالات مين لي في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس - كلية طب الأسنان.
  2. ملفقة من السقالات PLGA 85/15 بولي (حمض اللبنيك الجليكوليك-CO-) (اللزوجة الكامنة = 0.61 غ / دل، البوليمرات برمنغهام) من الصب والمذيبات عملية الترشيح الجسيمات.
  3. كانت مختلطة PLGA / كلوروفورم حلول مع 200-300 ميكرون السكروز قطر للحصول على 92٪ المسامية (آسر الحجم)، وضغطها في صفائح رقيقة في قالب تفلون.
  4. بعد تجميد التجفيف بين عشية وضحاها، ومنغمسين في السقالات ثلاثة تغييرات المزدوج المقطر (د د) O 2 H حل السكروز، وإزالة بلطف من لوحة تفلون مع ملعقة غرامة الإكراميات.
  5. بعد تسرب الجسيمات، وتطهير جميع السقالات عن طريق الغمر في 50٪، 60٪ والإيثانول 70٪ لمدة 30 دقيقة لكل منهما، تليها ثلاث يشطف من DDH 2 O.
  6. وجفت كل السقالات تحت غطاء محرك السيارة الصفحي تدفق.
  7. بعد تلفيق سقالة، قوالمغلفة مع caffolds الأباتيت.
    1. وقد أعد SBF (محاكاة السوائل في الجسم) حل مع تركيز ايون التي كانت 5 مرات من بلازما الدم البشري. وكانت كل الحلول العقيمة التي تمت تصفيتها من خلال غشاء 0،22 ميكرون PES (Nalgene). مباشرة قبل عملية الطلاء، والمجففة تعرضوا لتصريف السقالات PLGA توهج، الأرجون البلازما النقش (Harrick العلمية) لتحسين الرطوبة والتوحيد الطلاء.
    2. ثم حضنت محفورا في السقالات PLGA SBF في 37 ° C داخل الحاضنة بالماء لمدة 12 ساعة تغلف، تليها المغنيسيوم 2 + وHCO 3 - 2 لSBF مجانا آخر ساعة 12 في 37 ° C تحت التحريك لطيف.
    3. وتشطف المغلفة السقالات PLGA بلطف مع العقيمة O 2 DDH ليغسل فائض محلول كلوريد الصوديوم، والمجففة في الصفحي هود تدفق وتطهيرها مع الايثانول 70٪.
    4. تم تحليل سلامة طلاء الأباتيت مع المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). الأباتيت المغلفة هيئة السلع التموينيةوشنت ffolds على بذرة SEM (تيد بيلا) والمغلفة مع الكربون لتحسين التوصيل. تم تطبيق وضع الإلكترون الثانوية خلال الملاحظة (FEI / فيليبس XL-30) SEM. تم الحصول على الطاقة تشتت الأشعة السينية الطيف لتأكيد التركيب العنصري للهياكل الأباتيت.

3. خلية البذر

  1. عند بلوغ مستويات التقاء الفرعية، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني (X2) ويعرض للتريبسين.
  2. عد الخلايا لتحديد لبذر
  3. البذور على السقالات قبل قطع 4،0 مم مع 1.5 X 5 10 خلايا.
    1. المكان الفردية سقالة في بئر من لوحة جيدا 96-
    2. اعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام العادية النمو مع تركيز تقريبا 1.5 × 5 10 خلايا لكل 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام
    3. الماصة 20 ميكرولتر مباشرة على سقالة والمكان إلى خلية حاضنة الثقافة لمدة 30 دقيقة.
    4. بعد 30 دقيقة، أضف 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام والسماح لاحتضان الخلاياعلى منصة الاعدام قبل ليلة وضحاها لجراحة
    5. فإنه ليس من الضروري لضمان التصاق الخلايا على السقالة والبذر عدد كاف من خلايا سيضمن أن أغلبية سوف نعلق على السقالة. تم التحقق من صحة هذا الأمر في المختبر لدينا في الجسم الحي مع تلألؤ بيولوجي والتحليل النسيجي.

4. إنشاء العيوب قبي وزراعة فيفو

  1. تخدير الكبار (60 يوما) CD-1 الفئران عارية مع كوكتيل مخدر. (الكيتامين / زيلازين / آسيبرومازين) في تركيز 50٪ (1:1 مع تخفيف كلوريد الصوديوم 0.9٪) أو في نظام مخدر الموصى بها في البروتوكولات المؤسسة. هذه الفئران هي athymic حتى hASCs لن يسبب رد فعل المناعة.
    1. الجرعة: هيدروكلوريد الكيتامين (80 ملغ / كغ)، زيلازين (2.5 ملغ / كلغ) آسيبرومازين (2.5 ملغ / كغ)
    2. مدة التنفيذ: حوالي 30 دقيقة
  2. ثنى جراحيا الحيوان وتعقيم جراحيموقع مع betadine والكحول (X3)، وتغطي عيون الفأر مع مرهم قبل اتخاذ شق خط الوسط السهمي في فروة الرأس من الحيوان لفضح عظم الجداري الأيمن. إزالة pericranium من عظم الجداري الأيمن مع تجريف فظة (1B الشكل).
  3. إنشاء من جانب واحد 4-مم سمك كامل عيب في حق غير قابل للخياطة عظم الجداري المرتبطة باستخدام معقم حفر منقب المغلفة الماس بت. يجب أن تؤخذ بحذر المتطرفة عدم تعكير صفو الأم الجافية الأساسية (1B الشكل) وسمك الماوس قبي هو <0.3 مم.
  4. قبل زرع، وشطف مع السقالات PBS معقمة لمنع نقل عوامل النمو المشتقة من المتوسط.
  5. وضع سقالة في العيب.
  6. وأخيرا، خياطة الجلد مغلقة ومراقبة الحيوانات في بروتوكولات ما بعد الجراحة المقررة.
  7. استخدام تسكين أنشئت وفقا لتوجيهات البروتوكولات الخاصة بك رعاية الحيوانات حسب الحاجة بعد العملية، على سبيل المثال. البوبرينورفين 0.1 ملغ / كز.

5. الكمي لتشكيل عظمية

  1. بعد تم تنفيذ MicroCT على الماوس، أعيد بناء صورة ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج MicroView كما هو موضح سابقا 1.
  2. باستخدام أدوبي فوتوشوب، كانت الصور الحجم إلى ارتفاع قياسي.
  3. باستخدام ميزة العصا السحرية، تم قياس بكسل من العيب قبي.
  4. تم تحديد نسبة الشفاء من عيب لاحقة الأشعة المقطعية بقياس منطقة قبي عيب وتحديد عدد بكسل وتقسيمه من حيث عدد العيب الأصلي بكسل
  5. وبناء على ذلك، إذا كان MicroCT غير متوفر، والبديل هو استخدام أدوبي فوتوشوب وحصاد calvaria في نقاط زمنية تحدد لعلم الأنسجة.
  6. باستخدام البقع النسيجية مثل الأزرق والأنيلين التي تدل Pentachrome تشكيل عظمية، ينبغي مقاطع متعددة على طول مدى الخلل يكون الملون
  7. باستخدام أدوبي فوتوشوب، والمحاصيل خارج جميع المناطق التي ليستعيب في قبي
  8. استخدام ميزة عصا سحرية وتحديد أعداد بكسل تكوين العظام دي نوفو في مجال العيب وقارن بين عناصر التحكم أو متغيرات أخرى.

6. ممثل النتائج

الأنسجة الدهنية لديه القدرة على خدمة دورا حيويا في توليد الخلايا الاصلية للتطبيق السريرية. الأنسجة الدهنية لديه ميزة فريدة من نوعها في وجود إمدادات متاحة بسهولة التي يمكن حصادها في إجراء بسيط نسبيا، والتي تنطوي على الحد الأدنى من الاعتلال والوفيات. مرة واحدة يتم حصاد الأنسجة والتي تم جمعها، ويرد بروتوكول لدينا في الشكل 2. يتم عزل الدهنية المستمدة من الخلايا اللحمية من خلال سلسلة من الخطوات الغسيل، والهضم كولاجيناز، والطرد المركزي. مرة واحدة ومطلي الخلايا في الثقافة، ويمكن التوسع فيها، وضعت في مختلف البروتوكولات التمايز في المختبر، أو وضعها مباشرة في الجسم الحي.

جreation من عيب الحرجة 4 مم حجم قبي يوفر الوصول إليها بسهولة وقابلة للتكرار في نموذج الجسم الحي لاختبار قدرة التمايز المكونة للعظم من الخلايا الدهنية المشتقة لدينا اللحمية. من خلال استخدام MicroCT، ونحن قادرون على متابعة تكوين أنسجة الهيكل العظمي في الجسم الحي وتتبع التقدم المحرز في تدخلاتنا (الشكل 3). والعيب الحرجة حجم قبي لا تلتئم في غضون فترة حياة الحيوان ونرى ما يقرب من 90٪ من براءات الاختراع في جميع أنحاء عيب يبقى 8 أسابيع. السقالة نفسها (انظر المناقشة) له خصائص الاستقرائي المكونة للعظم وأظهرت القدرة على إحداث بعض التجديد العظمية. نتائج نموذجية من دون وضع سقالة الخلايا تظهر ان نحو ثلث العيب سيكون دي نوفو في تكوين العظام 8 أسابيع. مع زيادة الخلايا الدهنية من المشتقة اللحمية، تماما سوف الثلثين أو أكثر من عيب تظهر تجديد عظمي في حوالي 8 أسابيع على الرغم من أن هناك variability بين كل حيوان والجراحة. يمكن كميا تشكيل الهيكل العظمي الأنسجة من خلال الأنسجة والنتائج النموذجية تظهر زيادة في تشكيل عظمية عينات مع مخولا لصيانة طائرات من خلال تلطيخ الأزرق الأنيلين وPentachrome (الشكل 3C). وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا أن الخلايا المزروعة الإنسان تساهم في تكوين عظمي دي نوفو الكامنة من خلال استخدام hASCs GFP التي تحمل علامات التي تظهر في الجسم الحي في تلطيخ 2 أسابيع في منطقة قريبة من تشكيل العظام دي نوفو في عيب قبي (الشكل 3D) . وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم المناعية الأجسام المضادة المحددة مع الإنسان لإظهار بقاء الخلية البشرية والمساهمة في مجال الخلل (الشكل 3E).

الشكل 1
الشكل 1 A -. lipoaspirate واثنين من طبقات. الطبقة العليا يحتوي على الخلايا الشحمية والغالبية العظمى من العلاقات العامةocesses المواد الخلوية في حين أن الطبقة السفلى تحتوي على محلول ملحي المستخدمة أثناء إجراء lipoaspiration. ب - إنشاء عيب قبي من خلال شق خط الوسط خلال pericranium لعزل عظم الجداري الأيمن، بعد ذلك إقامة من 4 مم الحجم عيب الحرجة قبي دون انقطاع من الأم الجافية الأساسية.

الشكل 2
الشكل 2. نظرة عامة على الحصاد وتطبيق lipoaspirate من عزل الخلايا الدهنية المشتقة من انسجة لالتمايز، والتوسع في استخدام والتجارب المختبرية والحية.

الشكل 3
الشكل 3. A-MicroCT تظهر في الجسم الحي الشفاء من عيب الحرجة حجم قبي مع تطبيق مخولا لصيانة طائرات من خلال HYDroxyapatitie سقالة (الصف السفلي). الضوابط تشمل أي سقالة وعيب (الصف العلوي) وعيب في موضع دون سقالة الخلايا (الصف الأوسط) B - التحديد الكمي للشفاء عظمي من MicroCT تظهر زيادة كبيرة في الشفاء المجموعة ASC. C - علم الأنسجة يظهر تشكيل عظمية زيادة للفريق ASC (الصف السفلي) من خلال تلطيخ الأزرق الأنيلين وPentachrome. لالأنيلين الأزرق، والأزرق الداكن البقع عظمية وPentachrome، والبقع الصفراء عظمية. D - كانت المصنفة المسمى مع GFP hASCS في الصعود إلى منصة الاعدام، ووضع في خلل قبي وضحت في 2 أسابيع. وقد تم تلطيخ مع GFP المسمى الأجسام المضادة لإظهار الخلايا البشرية التي تسهم في تجديد في مجال الخلل. E -. الإنسان المناعية المستضدات النووية تظهر انتشار الخلايا البشرية في مجال الخلل في 2 أسابيع اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

منذ عزل الدهنية المستمدة من الخلايا اللحمية 2 من lipoaspirate، وقد تختلف هذه الخلايا في مجموعة متنوعة واسعة من الأنساب الخلوية. الأنسجة الدهنية هي من أصول أرومية متوسطة، وبالتالي، متعددة القدرات الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية من المرجح أن تكون الأكثر فعالية مع تطبيق النسب نحو أرومية متوسطة. القدرة على توليد الأنسجة العظمية هام على وجه الخصوص نظرا للنقص في مواقع المانحة لطعم ذاتي والقيود المتأصلة في المواد الاصطناعية بما في ذلك العدوى، ورفض، وانهيار بمرور الوقت 3. الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية توفر جهد الخلية متعددة القدرات الغازي خط مع 4 الغلة كبيرة نسبيا في الحصاد الجراحية.

أثناء معالجة جزء من الأوعية الدموية والأنسجة اللحمية خلية شحمية، فمن المهم للحفاظ على تقنية معقمة ممتازة. هناك خطر كبير من تلوث للثقافة الأولية نظرا لطبيعة الجزء الأكبر من lipoaspirate جنبا إلى جنب مع خطوات متعددة من الغسيل، والهضم، والطرد المركزي مع الخطوات خارج غطاء محرك السيارة خلية ثقافة عقيمة. بمجرد مطلي بيليه على الطبق، فإن الغالبية العظمى من الخلايا المرئية تكون eyrthrocytes. يمكن غسلها قبالة مع هذه PBS العقيمة الدهنية مرة واحدة في المستمدة يمكن أن تضاف الخلايا اللحمية انضمت إلى لوحة أو تحلل الخلايا الحمراء في الدم المخزن المؤقت. من المهم أن الخلايا متموجة نسبيا على الخطوة الأولي الطلاء لضمان النمو السليم والتمييز.

ليس هناك توافق في الآراء بشأن كيفية تعريف بالضبط الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية. في حين كانت هناك دراسات تحاول تحديد هذه الخلايا السكان يعتمد على علامات سطح الخلية من خلال التدفق الخلوي، وإيجاد مجموعة محددة أو علامات كانت صعبة. هذا هو الأرجح بسبب التغير في عدد السكان المريض والانجراف المظهري أن هذه التجربة الخلايا في المختبر في إطار مختلف بيئات زراعة الخلايا وتقلب في نظام تقييم الأداءأرقام حكيم. وذكرت الجمعية الدولية للعلاج الخلوية التي في الحد الأدنى، خلية الجذعية الوسيطة يجب أن يكون خصائص معينة بما في ذلك التعبير عن CD105، CD90، CD73، CD45 في حين تفتقر، CD34، CD14، CD11b، CD79α، CD19، HLA-DR و5. جاء التعريف الأصلي للطبيعة المتعددة قوية من هذه الخلايا من قدرتها على التمايز إلى خلايا أرومية متوسطة الأنساب في المختبر، وهذه البروتوكولات هي متاحة بسهولة.

تم التحقق من صحة الحرجة الحجم نموذج عيب قبي كنموذج لدراسة تجديد الهيكل العظمي باستخدام كل من الفئران الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية 6 و الخلايا البشرية المستمدة الدهنية المشتقة من انسجة 1. وإنشاء لعيب مم 4 في calvaria الجداري الأيمن من الماوس لا شفاء في حياة الحيوان. لذلك، أي ينظر الشفاء ويرجع ذلك إلى علاج وضعها داخل خلل قبي. أثناء عملية جراحية، من المهم بصفة خاصة لعدم injuإعادة الأم الجافية الأساسية. الأم الجافية يمكن تحفيز نفسها وتكون العظم أي ضرر يمكن أن تعوق بشكل كبير من عملية الشفاء لقبي الخلل 7.

وو استخدام السقالة كآلية تسليم الخلايا الجذعية أهمية خاصة في عالم الهندسة الهيكل العظمي. ويرتبط بشكل فريد وظيفة الهيكل العظمي الأنسجة إلى بنية ثلاثية الأبعاد للبيئة الكلي. يمكن للسقالة السليم لا تساعد فقط في تسليم الخلايا الجذعية في الجسم الحي، ولكن أيضا من خلال زيادة تكون العظم المكونة للعظم خصائص المعزز للسقالة نفسها. مختبرنا يتضمن هيدروكسيباتيت، وهو مشتق الكالسيوم، على العمود الفقري PLGA نظرا لخصائص ومحرض عظمي osteoconductive من هذه المواد. ومع ذلك، هناك العديد من الخيارات الأخرى لإنشاء سقالة يمكن أن يكون لها خصائص قوية ومحرض عظمي osteoconductive 8 و 9. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم السقالة لتقديم المواد المساعدة مثل هذه قويةكما جزيئات صغيرة 10 و 11 و ناقلات لهدم أو upregulate أهداف الجين 12 و 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتور جورج جميل والدكتور عميد Vistnes على دعمهم والتعاون من أبحاثنا. ويدعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للمنح أبحاث الأسنان والجمجمة 1 R21-01 DE019274، وR01EB009689 RC2 DE020771-02، ومؤسسة أوك ومختبر للطب التجديدي Hagey الأطفال إلى MTL الدكتور هيون معتمد من قبل القديس يوسف GME مستشفى الرحمة .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipoaspirate Harvest
PBS Gibco 10010-023
Hank's Balanced Salt Solution Cellgro 21-023-CV
Collagenase Sigma C6885-500MG
Cell Strainer 100 μm BD Falcon 352360
Steri-top 500 ml .22 μm filter Millipore SCGPT05RE
Calvarial Defect
Z500 Brushless MicromotorsUM50C NSK NSKZ500
Circular Knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levi, B., James, A. W., Nelson, E. R. Human adipose-derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defect. PLoS One. 5, (2010).
  2. Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjia, P. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  3. Keefe, M. S., Keefe, M. A. An evaluation of the effectiveness of different techniques for intraoperative antibiotics into alloplastic implants for use in facial reconstruction. Arch Facial Plastic Surg. 11, 246-251 (2009).
  4. Mitchell, J. B., McIntosh, K., Zvonic, S. Immunophenotype of human adipose-derived cells: Temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
  5. Dominici, M., Blanc, K. L. e, Mueller, I. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stroma cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  6. Cowan, C. M., Shi, Y. Y., Aalami, O. O. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size calvarial defects. Nat Biotechnol. 22, 560-567 (2004).
  7. Levi, B., Nelson, E. R., Li, S. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29, 1241-1255 (2011).
  8. Phipps, M. C., Clem, W. C., Catledge, S. A. Mesenchymal stem cells responses to bone-mimetic electrospun matrices composed of polycaprolactone, collagen I and nanoparticulate hydroxyapatite. PLoS One. 6, (2011).
  9. Yuan, H., Zang, Z., Li, Y. Osteoinduction by calcium phosphate biomaterials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 9, 723-726 (1998).
  10. Wei, G., Jun, Q., Giannobile, W. V. The enchancement of osteogenesis by nano-fibrous scaffolds incorporating rhBMP-7 nanospheres. Biomaterials. 28, 2087-2096 (2007).
  11. Li, C., Verpari, C., Jin, H. J. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  12. Zhang, Y., Fan, W., Nothdurft, L. In vitro and in vivo evaluation of adenovirus combined silk fibroin scaffolds for bone morphogenetic protein-7 gene delivery. Tissue Eng Part C Methods. 17, 789-797 (2011).
  13. Levi, B., Hyun, J. S., Nelson, E. R. Non-integrating knockdown and customized scaffold design enhances human-adipose-derived stem cells in skeletal repair. Stem Cells. 29, 21028-21029 (2011).

Comments

2 Comments

  1. How did you create your bone tissue constructs to maintain the proper thickness in the calvarial defect? You mention the scaffold diameter but not the thickness.

    Reply
    Posted by: Karin W.
    April 24, 2013 - 12:08 PM
  2. The HA-PLGA scaffolds were designed to mimic the thickness of native calvarial bone. The thickness of the HA-PLGA scaffolds are measured using SEM analysis and range from 500-700 um.

    Reply
    Posted by: Mike T.
    April 25, 2013 - 6:43 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics