Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

Bioengineering
 

Summary

Células tumorales circulantes son aislados de la sangre de pacientes con cáncer sin causar daño celular. El aislamiento de las células tumorales se logra usando una superficie bimolecular de E-selectina además de anticuerpos contra marcadores epiteliales. Un recubrimiento de nanotubos específicamente promueve la adhesión de las células cancerosas que resulta en purezas de captura altas.

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Hughes, A. D., Mattison, J., Powderly, J. D., Greene, B. T., King, M. R. Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples. J. Vis. Exp. (64), e4248, doi:10.3791/4248 (2012).

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Abstract

Las células tumorales circulantes (CTC) son células que difunden de un tumor primario en todo el sistema circulatorio y que en última instancia, pueden formar tumores secundarios en sitios distantes. CTC cuenta se puede utilizar para seguir la progresión de la enfermedad sobre la base de la correlación entre la concentración de CTC en la sangre y la gravedad de la enfermedad 1. Como una herramienta de tratamiento, CTC podría ser estudiado en el laboratorio para desarrollar terapias personalizadas. Para este fin, el aislamiento CTC debe causar ningún daño celular, y la contaminación por otros tipos de células, particularmente leucocitos, debe evitarse tanto como sea posible 2. Muchas de las técnicas actuales, incluida la única aprobada por la FDA para la enumeración de dispositivos CTC, destruir CTC como parte del proceso de aislamiento (para más información ver ref. 2). Un dispositivo de microfluidos para capturar viables CTC se describe, que consta de una superficie funcionalizada con E-selectina glicoproteína además de anticuerpos contra marcadores epiteliales 3. Para mejorar el rendimiento del dispositivoMance una capa de nanopartículas se ha aplicado consiste en nanotubos de halloysita, una de nanopartículas de arcilla aluminosilicato cosechado 4. Las moléculas de E-selectina proporcionar un medio para capturar movimiento rápido CTC que se bombea a través del dispositivo, dando una ventaja sobre los dispositivos de microfluidos alternativos en los que los tiempos de procesamiento ya son necesarios para proporcionar células diana con el tiempo suficiente para interactuar con una superficie. Los anticuerpos contra objetivos epiteliales proporcionar CTC-especificidad para el dispositivo, así como proporcionar un parámetro fácilmente ajustable para sintonizar aislamiento. Por último, el recubrimiento de nanotubos de halloysita permite el aislamiento significativamente mayor en comparación con otras técnicas, ayudando a capturar rápidamente las células en movimiento, proporcionando una mayor superficie para la adsorción de proteínas y leucocitos contaminantes repeler 3,4. Este dispositivo se produce por una técnica sencilla utilizando fuera de la plataforma materiales, y ha sido utilizado con éxito para capturar las células cancerosas de la sangre de metastásicopacientes con cáncer. Las células capturadas se mantienen durante un máximo de 15 días de cultivo después del aislamiento, y estas muestras suelen consistir en> 50% de células viables de cáncer primario de cada paciente. Este dispositivo ha sido utilizado para capturar viables CTC tanto de sangre diluida conjunto y muestras de la capa leucocitaria. En última instancia, se presenta una técnica con la funcionalidad en un entorno clínico para desarrollar terapias personalizadas contra el cáncer.

Protocol

El protocolo siguiente es para la producción de un dispositivo microtubo clave.

1. Preparación de la solución de nanotubos de halloysita

  1. Baño de ultrasonidos (10-13 W (RMS)) 250 l solución de nanotubos de halloysita (6,6% en peso en agua) 30 seg. Solución de enfriamiento con agua fría y ultrasonidos repetir una vez. Enfriar de nuevo.
  2. Dibujar solución sonicado en una jeringa, colocar un filtro de 0,45 micras jeringa, y solución de filtro en el tubo de microcentrífuga limpio. Vortex la solución ocasionalmente para mantener la homogeneidad.

2. El recubrimiento de la superficie interior con microtubos de nanotubos de halloysita

  1. Obtener 50 cm de sección larga de la Micro-Renathane microtubing (300 m de diámetro interior, 35,3 l volumen interior). Corte un extremo del microtubo en una diagonal y se insertan en un pedazo pequeño adaptador IDEX. Insertar la aguja de una jeringa 3/10 cc 29G en el otro extremo del microtubo.
  2. Para limpiar el microtubo, colocar el extremo abierto del microtubo (el extremocon el adaptador) en etanol al 70% y un empate ~ 50 l de etanol en la jeringa para llenar microtubo.
  3. Lavar el etanol a partir del microtubo dibujando un volumen suficiente de agua destilada en la jeringa.
  4. Retire la jeringa del microtubo, vaciar la jeringa, y luego vuelva a colocar en el microtubo.
  5. Preparar una solución de 0,02% w / v de poli-L lisina en agua. Extraer 50 l en el microtubo y dejar reposar durante 5 min a temperatura ambiente (TA).
  6. Dibuja 100 l solución filtrada de nanotubos en el microtubo y dejar incubar durante 3 min a temperatura ambiente.
  7. Dibuja de agua de 100 l por el microtubo para enjuagar la solución de nanotubos. Permitir microtubo recubierto para sentarse, lleno de agua, durante la noche a temperatura ambiente.

3. Preparación de Microtubos para el aislamiento de la célula

  1. Preparar una solución de 10 mg / ml de proteínas G en fosfato 1X Dulbecco (PBS, pH 7,0 a 7,2). Extraer 50 l de PBS a través microtubo y luego dibujar 50 l dela solución de proteína-G y permitir a incubar durante 1,5 horas a temperatura ambiente.
  2. Prepare una solución que contenía 5 mg / mL de E-selectina-IgG y 50 ug / ml de anticuerpos (anti-EpCAM para las muestras de cáncer de la mayoría de los anti-PSMA de muestras de cáncer de la próstata) en PBS. Extraer 50 L de la E-selectina y solución de anticuerpos en el microtubo y dejar incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
  3. Adhesión celular no específica se bloquearon con proteínas de la leche al 5%. Preparar una solución de 5% (w / v) de proteína de la leche en PBS. Dibujar 50 l solución proteína de la leche en el microtubo y permitir a incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
  4. Extraer 50 l de PBS en el tubo y dejar a temperatura ambiente hasta que las muestras de sangre o de la capa leucocitaria están listos para su procesamiento.
  5. 10 minutos antes de usar el microtubo para el aislamiento, dibujar 50 l de PBS que ha sido saturada con Ca 2 + ("PBS +") para activar las moléculas de selectina.

4. Preparación de muestras para el aislamiento de células

  1. Dibujar o obtener 10 ml de sangre del paciente en heparinizadatubo.
  2. Colocar 10 ml de Ficoll-Paque solución de aislamiento de linfocitos en 50 ml tubo de centrífuga. Suavemente la capa 10 ml de sangre entera en la parte superior de Ficoll para que no se mezcle la sangre y Ficoll.
  3. Se centrifuga a 2000x g durante 15 min a 4 ° C con una desaceleración mínima.
  4. Retire la capa de la capa leucocitaria y el lugar en el nuevo tubo.
  5. Lavado de la capa leucocitaria con PBS (centrifuga a 230x g durante 10 minutos, descartar el sobrenadante).
  6. Resuspender las células con 1 ml de solución amortiguadora de lisis de glóbulos rojos y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente para lisar los eritrocitos.
  7. Añadir 10 ml de PBS, mezclar suavemente, y se centrifuga a 230x g durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado con cuidado en 3 a 4 ml de PBS +.

5. Celda de aislamiento

  1. Conecte un extremo del microtubo funcionalizado a una jeringa de 5 ml con adaptadores de IDEX.
  2. Insertar la jeringa en una bomba de jeringa.
  3. Sumergir el extremo abierto del microtubo funcionalizado en la célula suspension.
  4. Procesar la suspensión celular a través de la microtubo de 1 a 4 ml / h.
  5. Transferir el extremo abierto del microtubo a un tubo que contenía PBS + y dibujar 300 L + PBS en jeringa a 0,016 ml / min para eliminar las células no unido y débilmente ligados desde el microtubo.
  6. Coloque el extremo abierto del microtubo en un tubo limpio. Desconecte la jeringa del microtubo y adjuntar una jeringa precargada con Accutase. Suavemente perfundir Accutase suficiente en el microtubo para llenar (~ 50 l) y se deja incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  7. Coloque una jeringa precargada con 1 ml de medio de crecimiento (79% de RPMI, FBS al 20%, 1% de penicilina estreptomicina) y perfundir en microtubo, recogiendo efluente en cultivo de tejidos tratados bien placa.
  8. Las células de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 bajo condiciones de humedad.

6. Los resultados representativos

El objetivo de esta técnica consiste en aislar células viables de cáncer de la sangre de pacientes con cáncer. Existen varios métodos para identificar las células cancerosas en la cultura, la verificación necesaria para el éxito del dispositivo. Hemos elegido para teñir las células en cultivo con anticuerpos contra restos epiteliales tales como EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial) o PSMA (antígeno prostático específico de membrana), además de DAPI para identificar los núcleos de células intactas (Fig. 2 y 3). El número de células cancerosas capturados utilizando esta técnica es necesariamente una función del número de CTC en la muestra de partida, y la variabilidad del paciente puede ser alto. En el procesamiento de las muestras tomadas de pacientes diagnosticados con cáncer en estadio IV, que habitualmente capturan entre 100 y 500 células cancerosas por el tubo de sangre, en el grado de pureza> 50%. Inmediatamente después de aislamiento, un mayor número de leucocitos contaminantes pueden estar presentes. Sin embargo, estos números se agota después de incubación en medio de cultivo durante un máximo de 5 días.

Figura 1

Figura 2
Figura 2. Los datos representativos de aislamiento CTC de muestras de sangre extraídas de un paciente con cáncer de mama y un paciente de cáncer de pulmón. El número de células viables positivamente identificados como CTC basado en la tinción EpCAM está representado por las barras de sólidos y se refieren a la ordenada izquierda y el porcentaje de células que fueron identificadas como CTC en comparación con el número total de células capturadas está representado por las barras abiertas y medido en la ordenada derecha. Los resultados son los siguientes cinco días de cultivo.

Figura 3
Figura 3. Micrografías representativas de los donantes separados (A y B) de CTC en la cultura 5 días posteriores a isolatien una muestra de cáncer de la sangre del paciente. Las células fueron teñidas con fluorescencia para EpCAM con AlexaFluor 488 (verde) y 4 ',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para visualizar el núcleo (azul).

Discussion

A menudo es el caso de que los primeros pasos en el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos del cáncer utilizan líneas celulares de cáncer, que se parecen a las células cancerosas cuestionable primarios todavía permanecen en uso debido a su facilidad de uso en el laboratorio. La investigación sobre el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer podría ser más rápida si las células cancerosas humanas primarias se utilizaron a principios de la investigación novela. CTC son el tipo más fácilmente accesible de células cancerosas, debido a su presencia en la sangre y la facilidad de una extracción de sangre estándar. Además, las células tumorales circulantes representan un paso necesario en el proceso de metástasis 5,6, por lo que su importancia para la enfermedad y de utilidad para la orientación de nuevos fármacos es clara. Aislamiento de CTC de la sangre in vitro se complica por sus bajas concentraciones: del orden de un millón de leucocitos por uno o por billón de eritrocitos 7. La mayoría de los métodos actuales para la detección de CTC en la sangre, incluyendo el de la célula única técnica aprobada por la FDA Buscar (Veridex), dañar o destruir las células en el proceso de detección, lo que impide su uso más allá de la enumeración. El método descrito anteriormente no pone en peligro la viabilidad celular y por lo tanto abre la puerta a futuras investigaciones clínicas sobre el cáncer. A medida que la recuperación de células intactas es el objetivo de esta técnica, es imperativo que las células se maneja con cuidado, especialmente durante las etapas de separación de sangre.

Hay un número de parámetros sintonizables en este sistema que pudiera ser alterada para lograr un mejor rendimiento dependiendo de las características críticas tales como el tipo de cáncer. En los pasos descritos anteriormente, se había optado por utilizar EpCAM como un anticuerpo específico de CTC para todos los tipos de cáncer, excepto cuando se procesan las muestras de cáncer de próstata, en el que lucha contra la PSMA se utilizó. Sustituciones adicionales de cáncer de anticuerpos específicos ciertamente puede ser utilizado para mejorar el rendimiento de los pacientes individuales. Además, las concentraciones de selectina y el anticuerpo se puede alterar para mejorar la captura de 8.

"> Una característica esencial del dispositivo es la incorporación de E-selectina moléculas sobre la superficie. E-selectina se expresa normalmente en la superficie luminal de las células endoteliales y la función de reclutar rápidas leucocitos se desplazan a sitios de inflamación. Leucocitos que fluyen a enlazar de forma transitoria moléculas de selectina, dando como resultado una más lenta, el comportamiento rodadura que facilita la unión más lenta y más fuerte de la célula al endotelio por integrinas. evidencia experimental convincente que hace que existe el caso que CTC puede extravasación por un mecanismo similar 9,10. La inclusión de selectina también permite que el dispositivo para operar a velocidades de flujo mayores, las tasas que de otro modo prevenir las células de la unión a anticuerpos 11. Así, nuestro dispositivo fisiológicamente imita una vénula para capturar biomimetically fluye CTC sin causar daño celular.

Rendimiento del dispositivo mejorado se puede atribuir a la adición de la capa de nanotubos halloysita a la superficie luminaldel dispositivo. Estudios anteriores han demostrado que hay tres componentes principales de la capa de nanotubos que permite una funcionalidad mejorada. En primer lugar, el revestimiento nanotubo proporciona mayor área superficial, lo que permite una mayor deposición de proteínas en la superficie 4. En segundo lugar, en la realización de microscopía de fuerza atómica en el recubrimiento de nanotubos se ha determinado que los nanotubos individuales sobresalen de la superficie en el flujo. Esto permite que las moléculas de selectina para ser presentado tanto como una micra por encima de la superficie para que las células pueden ser capturados y reclutados a la superficie anterior en su trayectoria a través del tubo 4. Por último, el recubrimiento de nanotubos halloysita es capaz de prevenir la adhesión de leucocitos y la difusión en la superficie, lo que permite una reducción del número de leucocitos capturados junto con el CTC y por tanto, mayores subsiguientes purezas CTC 3.

Disclosures

MRK es asesor científico de la CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

Acknowledgments

El trabajo descrito fue apoyada por el Centro de Cornell sobre el microambiente y la metástasis a través Número U54CA143876 Premio del Instituto Nacional del Cáncer. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Cáncer o el Instituto Nacional de Salud. Este trabajo fue financiado, además, en parte por la National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
300 um ID tubing Braintree Scientific, Inc. MRE025
Larger tubing for connection to syringe IDEX Health Science 1507L
5mL syringe for pump BD Biosciences 309603
Connector small to large tubing IDEX Health Science P-770
Connector large tubing to syringe IDEX Health Science F-120 and P-659
Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') BD Biosciences 309301
Accutase MP Biomedicals LLC 1000449
Ficol-Paque Plus GE Healthcare Bio-Sciences AB 17-1440-03
RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) Qiagen 1014614
Protein G, 5 mg CalBiochem (calbiochem.com) 539303
Human EpCAM/TROP-1 Antibody R&D Systems MAB960
PSMA Antibody (GCP-04) Abcam ab66911
96 well plates (Microtest 96) BD Biosciences 35-3072
Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g Bio-Rad 216005508
Halloysite Nanotubes NaturalNano NN-HNT200
Calcium Carbonate, 5g Aldrich Chemistry 481807
rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug R&D Systems 724-ES
RPMI Medium 1640 GIBCO, by Life Technologies 22400-089
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-095
Poly-L lysine 0.1% w/v in water Sigma-Aldrich P8920-100ML
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 100
Fetal Bovine Serum Atlanta Biochemicals S11056H
Penicillin Streptomycin Sigma Life Siiences P0781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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