L'effet synergique de la lumière visible et sur Gentamycin

Immunology and Infection

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Summary

Nous montrons qu'un dispositif biomédical développé impliquant un traitement par laser visible continu ou pulsé qui est combiné avec un traitement antibiotique (gentamicine), se traduit par un effet synergique statistiquement significative conduisant à une réduction de la viabilité de

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Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Polak, P., Zalevsky, Z. The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms. J. Vis. Exp. (77), e4370, doi:10.3791/4370 (2013).

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Abstract

Récemment, il ya eu plusieurs publications sur l'effet bactéricide de la lumière visible, la plupart d'entre eux affirmant que partie bleue du spectre (400 nm-500 nm) est responsable du meurtre de divers agents pathogènes 1-5. L'effet phototoxique de la lumière bleue a été suggéré d'être le résultat d'espèces induites par la lumière réactives de l'oxygène (ROS) formation par photosensibilisants bactériennes endogènes qui absorbent la lumière principalement dans la région bleu 4,6,7. Il existe également des rapports d'effet biocide de rouge et le proche infra-rouge 8 ainsi que la lumière verte 9.

Dans la présente étude, nous avons développé une méthode qui nous a permis de caractériser l'effet d'une forte vert de puissance (longueur d'onde de 532 nm) d'une lumière continue (CW) et pulsé Q-switched (QS) sur Pseudomonas aeruginosa. En utilisant cette méthode, nous avons également étudié l'effet de la lumière verte combiné avec un traitement antibiotique (gentamicine) sur la viabilité des bactéries. P. aeruginosa est acommon noscomial pathogène opportuniste causant diverses maladies. La souche est assez résistant à divers antibiotiques et contient beaucoup prédisaient AcrB / Mex polychimiothérapie de type RND systèmes d'efflux 10.

La méthode utilisée phase de bactéries Gram-négatives fixes libres (souche de P. aeruginosa PAO1), cultivés dans du bouillon de Luria (LB) exposés à Q-switched et / ou CW lasers avec et sans l'ajout de la gentamicine antibiotique. La viabilité cellulaire a été déterminée à différents points dans le temps. Les résultats obtenus ont montré que le traitement au laser seul ne réduit pas la viabilité cellulaire par rapport au témoin non traité et que le traitement de gentamicine seul seulement abouti à une réduction de 0,5 log dans le compte viable pour P. aeruginosa. Le laser combiné et le traitement de gentamicine, cependant, ont abouti à un effet de synergie et la viabilité de P. aeruginosa a été réduit de 8 journal de.

La méthode proposée peut en outre être mise enœuvre par le développement de cathéter comme dispositif capable d'injecter une solution antibiotique dans l'organe infecté tout en éclairant simultanément la zone de lumière.

Protocol

1. Culture bactérienne

  1. P. Gram négatif aeruginosa souche PAO1 ont été cultivées dans du bouillon de Luria (LB) à 37 ° C pendant 18 heures.
  2. La culture de cellules est ensuite centrifugé à 7500 rpm (tours par minute) pendant 5 min et le surnageant a été retiré.
  3. Les bactéries ont été remises en suspension dans 10% LB et re-pousser pendant 2 heures pour permettre à la culture pénètre de nouveau dans la phase stationnaire.
  4. La suspension de bactéries est alors divisé en deux groupes: dans le premier groupe (2 tubes) ont été ajoutés aucun antibiotique, dans le deuxième groupe, nous avons ajouté l'antibiotique gentamicine (50 pg / ml).

2. Détermination des unités formant colonie (UFC)

  1. Pour déterminer la viabilité cellulaire de 20 échantillons ont été prélevés ul de l'expérience environ toutes les 2 heures dans le délai de 24 heures. Dilution en série des échantillons ont été faites et sur des plaques d'agar LB et incubé pendant une nuit à 37 ° C.
  2. Pour chaque traitement, les CFU par plate a été déterminée et une comparaison a été faite entre les périodes et les différents traitements. La réduction logarithmique UFC a été calculée comme décrit dans l'équation. (1):
    Connexion réduction = Logu-LogC [CFU / ml]
    Où U est la formation de colonies valeur d'unités à chaque point de temps; UFC est une unité formant des colonies, tandis que les unités de CFU / ml égale à:
    CFU / ml = (nombre de colonies x facteur de dilution) / (volume inoculé)
    Et c est la CFU trouvé dans l'échantillon de contrôle au moment du départ. Notez que U désigne la formation de colonies facteur à l'instant de mesure.
  3. Le facteur de dilution est le nombre de dilutions tandis que dans chacun d'eux la concentration des bactéries est réduite par un facteur de 10. Le volume inoculé était toujours 200 micro litres et elle est liée à la taille de notre tube à essai.

Donc pour résumer le point de vue de la concentration, l'antibiotique gentamicine était à une concentration de 50 ng / ml. En ce qui concerne les bactéries, jusqu'à la fin dele processus, nous avons eu ensemble 8 dilutions. Chaque dilution a été par un facteur de 10 et cela a été fait dans des tubes de 200 pi. Le point de départ était de 20 ul d'échantillons ajoutés dans le tube de 200 pi (et donc la concentration initiale était 20/200C 0 = 0.1C0 avec C 0 étant la concentration initiale en 20 pi d'échantillons) et la concentration finale a été réduit de 8 ordres de grandeur à cause des dilutions 8.

3. Illumination

  1. CW Nd: YAG (longueur d'onde de 532 nm et une puissance optique moyenne de 200 mW) a été scindé en deux chemins optiques utilisant optique 50% / 50% diviseur de faisceau. Le diamètre du faisceau est d'environ 10 mm. La durée d'exposition était de 24 heures.
  2. Q-switché à impulsions Nd: YAG (longueur d'onde de 532 nm, une puissance moyenne de 300 mW et une puissance de crête optique de 2,5 MW) est également divisé en deux chemins optiques à l'aide de 50% / 50% diviseur de faisceau. Le diamètre du spot était de 6 mm. La largeur d'impulsion du laser déclenché a été de 6 ns et la fréquence de répétition est 15Hz. Lela densité de puissance moyenne est de 106 mW / cm 2 et la densité de puissance de crête est 8,83 kW / mm 2. La durée d'exposition était de 24 heures.

Notez que la suspension bactérienne agité pendant l'irradiation et il a été maintenu dans des conditions de culture appropriées pour la croissance bactérienne (dans tous les tubes y avait moyen Luria Broth pour permettre aux bactéries de se développer).

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Representative Results

La configuration basée sur le laser est présentée schématiquement à la figure 1. La première condition expérimentale a utilisé un laser CW Nd: YAG de longueur d'onde de 532 nm (le second harmonique de Nd: YAG) et de la puissance optique moyenne de 200 mW. Cette poutre a été divisée en deux chemins optiques à l'aide de 50% / 50% diviseur de faisceau optique de telle sorte que chaque faisceau divisé eu puissance de 100 mW. Le diamètre du faisceau est d'environ 10 mm, et donc la densité de puissance est d'environ 100 mW / cm 2. La durée d'exposition était de 24 heures. Bien que la puissance d'éclairage est relativement élevé, il n'est pas suffisamment élevée pour provoquer un échauffement de l'échantillon.

La seconde condition expérimentale utilisé un laser pulsé Nd Q-switché: YAG de longueur d'onde de 532 nm (seconde harmonique) et le diamètre du spot de 6 mm. La puissance moyenne est de 300 mW et une puissance de crête optique de 2,5 MW. La largeur d'impulsion du laser déclenché a été de 6 ns et la fréquence de répétition est 15Hz. Ce faisceau a été également divisé en deux voies à l'aide optique50% / 50% diviseur de faisceau. La densité de puissance moyenne était d'environ 100 mW / cm 2 et la densité de puissance crête est 8.83 kW / mm 2. Cette densité de puissance de crête est équivalente à l'énergie de la fluidité 88,3 pJ / mm 2 par impulsion que chaque impulsion est de 10 ns de temps dans le domaine temporel. La durée d'exposition était de 24 heures. Les deux expériences ont été réalisées dans des conditions de croissance similaires à l'exposition sans lumière (c'est à dire avec et sans gentamicine) qui a servi de témoin.

Sur les figures 2 (a) et 2 (b) l'effet obtenu grâce à l'illumination de l'échantillon avec de la lumière laser continu et avec le laser Q-switched, respectivement avec et sans antibiotique sur P. aeruginosa est présenté.

Dans les échantillons qui n'ont pas été exposés à la lumière (c'est à dire le contrôle) il n'y avait pas de réduction de la viabilité cellulaire avec ou sans traitement de gentamicine. Ce résultat suggère que les bactéries sont résistantes au traitement par la gentamicine, imitantla situation souvent rencontrée dans la clinique.

La lumière laser seul n'a pas provoqué une mort non plus. Cependant, la combinaison de la lumière laser et la gentamicine réduit la viabilité des bactéries par plusieurs ordres de grandeur. L'effet le plus important a été mesurée après 24 heures dans lequel la combinaison de deux ou CW laser Q-switched réduit la viabilité de 8 ordres de grandeur par rapport aux mesures obtenues dans le groupe témoin (antibiotique seul ou seule lumière).

C'est un résultat important qui peut suggérer une solution de traitement pour ce type de bactéries résistantes aux antibiotiques. Le fait que plusieurs heures sont nécessaires afin d'obtenir abattage efficace des bactéries ne réduit pas le potentiel clinique de cette approche depuis le traitement proposé peut être incorporé dans les cathéters et autres dispositifs utilisés à l'hôpital. Par exemple dans la figure 3, nous présentons un exemple d'un cathéter conçu qui en outretion pour le canal d'injection de liquide, il ya plusieurs trous permettant de diffuser simultanément un éclairage approprié dans l'organe infecté.

Le nombre d'échantillons utilisés pour les statistiques était de 6 (il y avait un ou deux cas de quelques-uns des tubes qui ont été accidentellement contaminés, puis ils ont été sortis des statistiques). La valeur de p était inférieure à 0,05.

Notez que nous n'avons pas répéter nos expériences pour différents niveaux de concentration des antibiotiques. Dans toutes nos expériences, la concentration était très élevé. La raison pour cela était de mieux démontrer la force de notre approche comme dans la plus grande concentration de la bactérie n'était toujours pas affectés par les antibiotiques sans éclairage et a été détruit avec l'éclairage, il sera évidemment se produire pour des concentrations plus faibles.

L'une des raisons du choix de la longueur d'onde d'illumination a été de choisir une longueur d'onde pour laquelle le bacteria et les antibiotiques sont transparentes. Ceci est démontré dans la figure 4. Motivation supplémentaire pour utiliser le 532 nm longueur d'onde laser est due à sa disponibilité dans notre laboratoire et en raison du fait que cela nous a permis également d'obtenir une puissance d'éclairage plus élevé (par rapport à une source de lumière blanche régulière avec filtres spectraux) ainsi que la capacité de réglage pour l' la puissance et pour le comportement temporel de l'éclairement.

Figure 1
Figure 1. . Bactéries configuration d'éclairage Le laser était soit CW Nd: YAG laser Q-switched ou pulsés Nd: YAG. Sur la gauche, on peut voir l'image de l'installation expérimentale dans laquelle le laser est divisé entre deux tubes, l'un avec des antibiotiques et une sans elle, afin d'illuminer les deux d'entre eux dans des conditions identiques. Les deux tubes sont situation ed sur un agitateur. Schéma de principe du dispositif expérimental est vu dans la partie droite de la figure.

Figure 2
Figure 2. (A). Effet de la CW-laser et la gentamicine sur P. aeruginosa. Les échantillons ont été éclairés par une lumière laser CW (puissance de 100 mW) avec et sans gentamicine (50 pg / ml). La moyenne de 3 expériences est présentée. (B). Effet du laser déclenché et la gentamycine à P. aeruginosa. Les échantillons ont été éclairés par la lumière laser Q-switched (1,65 MW) avec et sans gentamicine (50 pg / ml) sur P. viabilité aeruginosa. La moyenne de 3 expériences est présentée.

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Figure 3. Le dispositif à base de cathéter proposé pour le traitement biomédical contre P. aeruginosa. Les points sur la figure représentent des points de diffusion de la lumière causant la lumière soit diffusée dans les tissus traités.

Figure 4
Figure 4 Le spectre d'absorption (en UA) autour de la longueur d'onde de 532 nm pour:. (A). Les bactéries, (b). La gentamicine. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

La photothérapie a été un domaine de recherche multidisciplinaire de pointe au cours des dernières années émergents comme une approche prometteuse pour le traitement de nombreuses maladies. Dans ce contexte, l'utilisation de la lumière dans le domaine visible a été largement étudiée. Par exemple, il a été constaté que les plaies infectées peuvent être guéries plus efficacement en les exposant à la lumière visible intense à des fins de stérilisation. Le mécanisme d'action de cette approche a été prouvé que par l'induction de radicaux libres d'oxygène induites par la lumière (ROS) qui tuent les bactéries 11.

Des études antérieures ont démontré 6 montants beaucoup plus élevés de ROS dans les bactéries illuminés par la lumière bleue que ceux induits par la lumière infra-rouge rouge et le proche. C'est ce qui explique pourquoi la plupart des preuves dans la littérature se concentre sur l'effet bactéricide de la lumière bleue.

Un autre exemple récent de l'utilisation de la lumière laser pour combattre les bactéries résistantes a été démontrée par Krespi et al. 12. Dans ce laser d'étude généré technologie onde de choc a été utilisé pour éliminer les biofilms. En utilisant une miniature Q-switched laser Nd: YAG et des fibres fines, des sondes particulières générées formation de plasma qui produit un effet d'onde de choc. Les auteurs ont montré que cette méthode était capable de perturber efficacement P. biofilms aeruginosa in vitro.

L'approche que nous avons présenté dans cette étude était quelque peu différente 13 que nous avons tenté d'augmenter l'efficacité de la non-photosensibilisant agent antimicrobien utilisant une lumière laser. Nos résultats suggèrent que, en combinant un traitement antibiotique avec illumination, l'activité antimicrobienne peut être considérablement augmentée.

En effet, à partir d'un phénotype complètement résistant, observée dans l'antibiotique seul les bactéries sont devenues sensibles à la présence d'un traitement antibiotique et de la lumière. Le mécanisme d'action de cet effet n'est pas claire et il faudra encore ENQUÊTEd'ions. Cependant, dans la résonance des mesures d'électrons paramagnétiques (EPR) que nous avons effectués pour déterminer si ROS sont générés pendant le traitement, aucune différence significative entre les différents traitements a été obtenue 13. Ces résultats suggèrent que l'effet du traitement combiné n'a pas la production de ROS et différents mécanismes doivent être pris en considération. On peut supposer que le traitement par la lumière modifie la perméabilité de la membrane et, finalement, permet aux antibiotiques de pénétrer dans la cellule bactérienne qui donne son assassinat.

Bien que le mécanisme de fonctionnement n'est pas entièrement exploré, notre approche en évidence le potentiel de la thérapie combinée de la lumière avec des antibiotiques commerciaux qui peuvent avoir été abandonnés à cause de la résistance aux antimicrobiens, tout en appliquant cette combinaison peut maintenant être réutilisés efficacement dans les cliniques.

Évidemment, comme il est indiqué dans le manuscrit, illumination de plusieurs heures sont nécessaires pour en Hance l'efficacité des antibiotiques. C'est en effet un inconvénient de l'approche proposée. La réalisation d'un tel éclairage peut être obtenue par exemple en installant la source d'éclairage à l'intérieur de cathéters (comme proposé par la figure 3). En plus de cela, si la plaie est à l'extérieur des bandes spéciales que le plâtre avec une source d'éclairage peut être mis sur le dessus de la plaie et l'illuminer pendant plusieurs heures, par exemple pendant que le patient dort la nuit. Si l'infection est interne et que le patient est hospitalisé et il / elle est connectée à poche de perfusion pendant plusieurs heures, pour certains organes d'un canal d'éclairage tel qu'un endoscope ou une fibre spéciale peut être abordé à l'orgue et constamment l'allumer (à l' appliquer un traitement antibiotique) pendant que le patient est hospitalisé (exactement comme la poche de perfusion est connecté au patient pendant plusieurs heures). Nous sommes entièrement d'accord pour dire que l'approche n'est pas bonne pour le traitement des organes généralement infectées.

nt "> Notez que dans ce manuscrit, nous montrons l'avantage de la technique proposée pour une application rapide et pratique, mais pour y parvenir d'autres études sont nécessaires comme des expériences in vivo. L'étude de toxicité sur des fibroblastes ou cellules épithéliales sera utile aussi bien que les études qui permettront de démontrer le mécanisme de la thérapie proposée dans les cellules bactériennes sont nécessaires. De plus, dans cet article, nous avons émis l'hypothèse que les changements induits par la lumière de la membrane bactérienne qui rend plus perméable à l'antibiotique. Évidemment, les choses seront différentes dans un . milieu clinique où les infections bactériennes sont dues à des biofilms Ensuite, il ya deux problèmes majeurs:. bactéries des biofilms sera plus résistant par rapport à leurs homologues planctoniques et la pénétration des antimicrobiens dans la masse de biofilm se limitera donc à explorer les effets de la lumière et de la gentamicine sur un modèle de biofilm à P. aeruginosa est le but de notre étude future.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lauria Broth Difco 241420
Gentamycin Sigma G1914
Bacto Agar Difco 231710

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References

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