카본 블랙 잉크의 혈관 재관류은 뇌 혈관의 신뢰성 시각화 수 있습니다

Neuroscience

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Summary

쥐 뇌 혈관 해부학 분석 실험 뇌졸중 연구에 중요한 역할을한다. 이러한 맥락에서, 색 라텍스와 혈관 재관류는 몇 년을위한 표준 도구로 간주되었습니다. 그러나,이 기술은 재현성을 저해 별개의 기술적 한계를 의미합니다. 여기, 우리는 재현 방식으로 뇌성 혈관을 시각화 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 고 대비 시각화와 뇌성 혈관의 충분한 충전의 왼쪽 심실 심근 결과를 통해이 상업적으로 이용 가능한 카본 블랙 잉크 혼합물의 주입. 우리는 성공적으로 다른 유전 적 배경을 가진 쥐 대뇌 혈관 지역 사이 anastomotic 포인트를 확인하기 위해이 기술을 적용했습니다. 쥐 경색 볼륨을 관찰하고 분석 할 수있는 널리 사용되는 도구 - 우리는 마침내 우리 선박 착색이 소설과 간단한 방법은 triphenyltetrazolium 염화 (TTC) 염색과 결합 할 수 있다는 증거를 제공합니다.

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Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels. J. Vis. Exp. (71), e4374, doi:10.3791/4374 (2013).

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Abstract

대뇌 혈관의 해부학 적 구조는 뇌 혈류 역학의 주요 결정자뿐만 아니라 허혈성 모욕에 따라 부상의 심각성입니다. 대뇌 vasculature 동적으로 다양한 pathophysiological 상태에 응답하며 긴장 사이 유전자 조작 조건에 따라 상당한 차이를 전시하고 있습니다. 기본적으로 intracranial 선박 착색에 대한 신뢰할 수있는 기술은 허혈성 뇌졸중의 pathogenesis을 연구하기 위해 필수적입니다. 최근까지 다양한 기술의 집합은 낮은 점도의 수지, araldite F의 주입을 포함하여 대뇌 vasculature, 젤라틴 2 또는 검은 색 3 탄소없는 다양한 염료 1 (즉, 카민 붉은 색, 인도 잉크) 또는 라텍스과 혼합.를 시각적으로 고용되었습니다 오름 대동맥을 통해 흰색 라텍스 화합물의 재관류가 먼저 코일과 Jokelainen 3보고되었습니다. 마에다 외. 2 carbo을 추가하여 프로토콜을 수정 한뇌의 생리 재관류 후 혈관의 개선 대비 시각화를위한 라텍스 화합물로 N 검은 색 잉크. 그러나, 비효율적 인 재관류와 혈관의 불충분 한 충전이 자주 라텍스 화합물 4의 높은 점도로 인해 발생합니다. 따라서, 우리는 재현 방식으로 5 대뇌 vasculature을 시각화 두 상업적으로 이용 가능한 카본 블랙 잉크 (CB1과 CB2)의 혼합물을 사용하여 간단하고 비용 효율적인 기술을 설명하고 있습니다. 우리는 라텍스 재관류 5 비교에서 더 높은 밀도에 훨씬 작 뇌성 선박의 얼룩에 마우스 결과에 CB1 + CB2와 그 세례를 보여 주었다. 여기, 우리는 앞 (ACA)와 다른 유전 적 배경을 가진 쥐 선박 변화를 공부하는 중 뇌동맥 (MCA) 사이 anastomotic 점을 식별하기위한 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 CB1를 조합하여 마우스의 과도 초점 대뇌 국소 빈혈 모델에서의 기술의 가능성을 보여줍니다 +허혈성 부상의 다양한 각도 TTC의 착색과 CB2로 인한 선박 착색.

Protocol

1. 동물

  1. 실험은 실험실 동물의 보호 및 사용에 대한 NIH 가이드 라인에 따라 실시하고 지방 자치 단체에 의해 승인되었습니다. 모든 실험 C57Bl6 / J 야생 타입 마우스, ApolipoproteinE - / - (ApoE KO) 및 (12-16주 오래된 26~30그램의 체중, 실험 집단 당 5-6 동물) SV129 마우스가 사용되었습니다.

2. 컬러 라텍스와 뇌 혈관의 얼룩

  1. EP 관 1시 20분 비율에 라텍스 화합물의 0.5 ML (Pebeo, 프랑스)와 25 μl 카본 블랙 잉크 (Herlitz, 독일)의 혼합물을 준비하고 물을 욕조에 37 ° C에서 혼합을 따뜻하게. 동물을 anaesthetizing 전에 28 30g의의 바늘로 2 ML의 주사기에 혼합를 수집합니다.
  2. 멸균 정상적인 생리의 1 ML에 papavarine 염산염 분말의 50 MG를 해산. 인슐린 주사기의 솔루션을 수집합니다. 다른 멸균 인슐린 주사기에서 바늘을 중지. 20 C의 끝에이 바늘을 삽입합니다m 길이 PE10 튜브. 지금 vasodilatation과 혈관의 적절한 충전을 보장하기 위해 넙 다리 정맥을 통해 주입 할 수 papavarine 하이드로 클로라이드 솔루션을 포함하는 인슐린 주사기의 바늘에이 PE10 튜브를 연결합니다.
  3. 또 다른 두명의 인슐린 주사기에게 생리의 각 함유 한 ML을 준비합니다. 인슐린 주사기는 정확한 위치에 주입 유체의 원활한 전송을 할 수 있습니다. 그러나, 라텍스, 대체 이동식 넓은 바늘 1 ML 주사기의 높은 점도로 인해 사용해야합니다.
  4. 운영 단계에 가까운 모든 주사기와 살균 해부 악기를보세요. 운영 단계 주위에 수술 포목상 시트를 확산. 작업 단계는 충분히 조명해야하고 필요한 경우 운영 현미경을 사용할 수 있습니다.
  5. 이제 C57Bl6 / J 마우스의 체중을 측정 한 후 5%이 70 % N 2 O 30 % O 2의 isoflurane 기화로 마취를 유도. 기화 isoflurane의 1 %로 마취를 계속합니다. 적절한 positionin 후사지의 그 뒤로 고정에 마우스 g, 마취의 깊이를 신고 할 수 있습니다. 그런 다음 왼쪽 넙 다리 정맥을 통해 피부를 잘라 정맥을 찾습니다. PE10 튜브에 삽입 바늘의 날카로운 끝을 넣고 천천히 분 당 100 μl (50 밀리그램 / kg 체중)의 속도로 papavarine 하이드로 클로라이드 솔루션을 주입.
  6. 분사 후, 복강과 관통 가로막을 잘라. 을 손상하거나 멍이없이 마음을 노출 갈비뼈를 잘라. 동맥 포셉으로 내림차순 흉부 대동맥을 클립. 정맥 피가 사라져 있도록 오른쪽 심방을 통해 날카로운 상처를합니다. 18-20 초 이상 약간의 압력을 수동으로 색 라텍스를 주입 한 다음, 왼쪽 심실에 생리 2 ML를 삽입. 미리 채워진 주사기 다른 후 하나를 사용하십시오. 모든 거품을 주입하지 마십시오.
  7. 라텍스의 주입 후, 5 분의 동물을 두십시오. 동물 목을 벨 조심스럽게 전체 뇌를 제거합니다. 선박 건축과 corte을 해치다하지를 잘 가져가X 두개골 뼈와 meninges를 제​​거하는 동안. 사진을 가져 4% PFA 6-8 ML을 포함하는 60mm 세포 배양 접시의 뇌를 놓습니다. 투명한 접시 아래에 측정 통치자를 놓습니다. 운영 현미경에 부착 된 카메라로 등쪽와 뇌의 복부 표면의 25x 확대 사진을 찍습니다. 사진은 원래 거리를 수량화하기 위해 페트리 접시와 현미경 대물 사이에 90 ° 각도로 촬영해야합니다.
  8. 또 다른 4-5 동물의 절차를 반복합니다.

3. 카본 블랙 잉크의 혼합과 뇌 혈관의 얼룩

  1. 우리 프로토콜 라텍스 기반의 대뇌 혈관 착색의 결과를 비교하려면, 1.5 ML EP 관 펠리칸 Scribtol Schwarz 잉크 (CB2) 900 μl를 Herlitz Stempelfarbe 잉크 (CB1) 100 μl의 혼합물을 준비하고 있습니다. 1시 9분 비율 CB1과 CB2 2 ML 혼합물의 총 볼륨을 두 EP 튜브를 준비합니다. 두 개의 인슐린 주사기 (1 혼합물을 수집ML 각). 37 ° C.까지 따뜻하게 주사기를 모자하고 물 욕조에 넣어 또 다른 두명의 인슐린 주사기에 생리 2 ML를 수집하고,뿐만 아니라 물 목욕에 배치합니다.
  2. 동물을 마취하고 papavarine 하이드로 클로라이드의 주입을 제외하고 위에서 설명한 것과 같은 절차를 반복합니다. 왼쪽 심실에 두 ML salaine의 주입 후, 카본 블랙 잉크 대신 색 라텍스의 2 ML 혼합물을 주입. ML 당 18-20 초 이상 약간의 압력 손으로 주사를 수행합니다. 주사하기 전에 내림차순 흉부 대동맥을 클립.
  3. 동물을 희생 뇌를 제거하고 사진을 찍어.
  4. 부동 뇌는 완전히 submerges 때까지 뇌의 장기 보존의 경우 (5 % 15 % 다음 다음 30 %) 점차 증가 농도 자당과 부화에 의해 PFA는 하루 아침에 다음 4퍼센트에 뇌를 넣어. 색 라텍스와 perfused 동물의 두뇌는 같은 방법으로 보존 할 수 있습니다.
  5. 을 수행또 다른 4-5 동물의 절차. 다른 유전 배경이나 변종으로 인한 뇌성 혈관 해부학의 차이를 비교하려면 각각 ApoE KO와 SV129 마우스의 동등한 수의 프로토콜을 반복합니다.
  6. 깊은 마취 (수술에 대한 자세한 설명은 본 문서의 범위를 넘어 아래에있는 MCA의 intraluminal 가림의 표준 프로토콜에 따라 45 분 또는 90 분에 과도 초점 뇌성 국소 빈혈을 유발, 허혈성 조건 하에서 혈관 해부학을 공부한다 리더는 Doeppner 외., 2010)라고합니다. 경색 볼륨을 식별 할 수 reperfusion 기간 (1 일 ~ 5 일) 계획의 끝에서 CB1 + CB2 잉크 만 사용하여 혈관 착색을 수행하고 5-10 분 동안 37 ° C에서 2% TTC 솔루션을 가지고있는 전체의 뇌를 더럽 히다 . TTC는 mitochondrial 효소 (특히 호박산 탈수소 효소)에 의해 붉은 색의 formazan으로 감소된다. TTC의 착색 후, infarcted 조직 unstai는 붉은 색의 metabolically 활성 조직 얼룩 남아있는 동안네드는와 때문에 역기능과 변성 mitochondrial 효소에 흰색 나타납니다. 위에서 설명한 것과 같은 방식으로 이미지를 수집합니다.

4. 뇌 혈관 지역의 연구

  1. 대뇌 혈관, + CB2 잉크가 ImageJ 소프트웨어 (영상 처리 및 분석에 사용되는 자바 기반의 공개 소프트웨어)를 분석 할 수 색 라텍스 또는 CB1과 뇌 중 스테인드의 등 표면의 이미지의 총 해부학을 분석 할 수 있습니다. CB1 + CB2 살포가 복부와 등쪽 표면 모두에있는 모든 선박을 착색 반면 색 라텍스와 perfused 뇌는, 등쪽 표면에있는 선박 착색의 변수도 표시 될 수 있습니다.
  2. ImageJ 소프트웨어와 이미지 파일을 엽니 다. ACA와 MCA 사이 anastomotic 점을 확인합니다. anastomotic 포인트는 혈관 직경이 좁은 또는 각각 ACA의 가장 가까운 분기 포인트와 MCA 지점 사이의 반 거리, 2 사이트로 정의됩니다.
  3. mm의 규모를 설정합니다. anastomotic 라인과 직선 그리기 도구 및 "측정"도구를 사용하여 뇌의 전두엽 극에 꼬리 4mm의 중간 선 사이의 거리를 측정합니다. caudally 정면 극에서 6mm에서 동일한 작업을 수행. 동물 당 3-4 이미지를 분석하고 평균 값을 계산합니다. 뇌 혈관 해부학의 변화를 확인하기 위해 동물의 서로 다른 그룹 사이의 값을 비교합니다. C57Bl6 / J 동물에서 ACA와 MCA 사이의 anastomotic 라인은 caudally 정면 극에서 6mm에서보다 4mm에 가까운 중간 선을 추적 할 수 있습니다. ApoE KO 마우스는이 점에 큰 차이를 제공하지 않습니다. 한편, SV129 마우스에 anastomotic 라인은 정면 극에서 caudally 추가 및 4mm의 중간 선 모두 병렬 및 6mm 거짓말을합니다.
  4. 혈관 해부학을 분석해서N 허혈성 조건은 위에서 언급 한 동일한 계산을 수행합니다. 각각 metabolically 활성 조직 및 괴사 흠없는 조직을 대표하는 빨간색과 흰색 컬러 조직 마진로 경색 테두리를 식별합니다. 4mm에서와 뇌의 전두엽 극에서 꼬리 6mm의 중간 선에서 경색 테두리의 거리를 측정합니다. 동물 당 3-4 이미지에서 평균 값을 수집합니다. 다른 국소 빈혈 reperfusion 및 기간 사이의 결과를 비교합니다.

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Representative Results

여기에 설명 된 프로토콜 쥐 대뇌 vasculature의 기존의 라텍스 기반의 시각화의 기술 한계를 극복. 그림 1A는 색 라텍스의 다음과 같은 재관류를 보여줍니다, 복부 표면에 만 대형 선박은 전체 등쪽 표면이 흠없는 떠나는, 스테인드 있습니다. 결과는 매우 변수입니다. 뇌 (데이터가 표시되지 않음)의 등 표면에 표시 ACA 및 MCA의 부분적인 착색 여섯번 쇼 하나 밖에 동물. 반대로, CB1 + 같은 방식으로 (그림 1B)에 크고 작은 두 선박의 충분한 충전의 CB2 재관류 결과이다. 착색 품질의 변화없이 칠일까지 안정적이다. ImageJ 프로그램을 사용하여, 우리는 야생 유형 C57Bl6 / J 마우스 (그림 1C)의 중간 선에서 ACA와 MCA 사이의 anastomotic 점의 거리를 정량화하고 있습니다. 우리는 여부 유전 modificati을 관찰하는 ApoE KO 마우스와 함께이 값을 비교에이 지역 혈관 해부학 (그림 1D)에 대한 영향을 미쳤다. ApoE의 패고 것은 C57Bl6 / J 마우스의 대뇌 혈관의 해부학 적 구조에 영향을 미치지 않았지만, 상당한 차이가 C57bl/6J과 SV129 긴장 (그림 1E, F) 사이에 발견되었다. 따라서, 우리는 쥐 유전자 또는 스트레인의 차이로 인해 대뇌 vasculature의 해부학 적 차이를 평가하기 위해이 착색 프로토콜의 가능성을 보여 할 수 있습니다.

실험 쥐 뇌졸중 모델에서 TTC의 착색은 널리 경색 볼륨을 관찰하는 데 사용됩니다. 대뇌 혈관과 경색 볼륨의 동시 시각화은 우리에게 국소 빈혈 reperfusion - 다음과 같은 형태학의 변화를 분석 할 수있는 기회를 제공합니다. 따라서, 우리는 + CB2로 인한 혈관 얼룩은 허혈성-reperfusion 부상 (그림 2A-H)의 다양한 각도 TTC의 착색과 안정 CB1 여부를 확인했습니다. 우리는 더 anastomotic를 분석 한 ACA와 MCA 사이의 포인트 국소 빈혈의 45 분 또는 90 분은 일일 또는 5 일 reperfusion 기간 (그림 I, J) 중 하나와 일치 후. 예상대로, 중간 선 및 anastomotic 지점 사이의 평균 거리가 집단간에 큰 차이 (그림 2I, J)를 보여주지과 비 허혈성 동물 (그림 1 층)과 같은 범위에서했습니다. 그러나, 중간 선에서 경색 경계까지의 거리가 국소 빈혈 reperfusion - 부상의 높은 수준 (그림 2K, L)로 증가 경색 볼륨을 반영 크게 다릅니다. 이 데이터는 CB1 + CB2 착색는 TTC의 착색과 결합 할 때 국소 빈혈 reperfusion - 부상 및 착색의 안정성의 다양한 학위를 받게 동물 복제 할 수 보여줍니다.

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1 그림. 등쪽 표면이 흠없는 유지하면서 유전자와 변형의 차이가있는 마우스의 대뇌 혈관 해부학 적 관찰. 그림 1A는 색 라텍스 만 얼룩 복부 표면에 대형 선박의 혈관 재관류를 보여줍니다. 반대로, 복부에 크고 작은 혈관과 뇌 (그림 1B)의 등 표면 모두의 영구적 인 얼룩의 CB1 + CB2 재관류 결과입니다. 앞 대뇌 동맥 (ACA) 및 야생 유형 C57Bl6 / J 마우스 (그림 1C)의 중간 선에서 중간 대뇌 동맥 (MCA) 사이 anastomotic 점의 거리의 정량화는 유전자 돌연변이 ApoE KO의 대응 (그림과 아무런 차이가 표시되지 1D). 그러나, 중요한 차이는 C57Bl6 / J과 SV129 긴장 (그림 1E, F) 사이에 발견된다. 스케일 바 = 2mm. P, 4mm의 C57BL6 / J 야생 유형과 ApoE KO 마우스 모두에서 * 상당히 다른 P <0.01에서 **.

그림 2
그림 2. 뇌의 복부와 등쪽 표면의 허혈성 뇌에 혈관 해부학 분석. 그림 2A-H 쇼 이미지를 1 일 또는 5 일 reperfusion 시간에 이어 45 분 또는 90 분의 국소 빈혈을 받게. 오른쪽 패널은 허혈성-reperfusion 부상 (그림 2A-H)의 여러도에있는 혈관 착색의 안정성을 나타내는 혈관 착색 및 TTC의 착색 모두의 조합을 보여줍니다 반면 왼쪽 패널은 CB1 + CB2 인한 혈관 얼룩을 보여줍니다. 앞 대뇌 동맥 (ACA)과 중 일일 또는 5 일 reperfusion 기간 드와 일치 45 분 또는 90 분의 국소 빈혈 후 중간 대뇌 동맥 (MCA) 사이 anastomotic 포인트 분석그룹 사이에 큰 차이 (그림 2I, J)는 picts 없습니다. 그러나, 중요한 차이는 국소 빈혈 reperfusion - 부상의 높은 수준 (그림 2K, L)와 경색 볼륨의 증가를 나타내는 중심에서 경색 경계까지의 거리에 기록 할 수 있습니다. 스케일 바 = 2 음. 1 일 reperfusion, P <0.05, 그리고 ** 5 일 reperfusion, P <0.01로 45 분의 국소 빈혈에서 * 전혀 다른. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

이 특정 압력 2,3을 의미 할 특정 장치를 포함하지 않으므로 수동으로 분사하여 CB1 + CB2의 재관류는 집중 훈련없이 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 우리 프로토콜의 재관류의 결과의 이질성도 무시할 수 있습니다. 20 허혈성 동물의 아웃 만 1 16 비 허혈성 동물에서 동물과 3가 완전 재관류을 보여 왔습니다. 이러한 경우에 혈관 폐색으로 이어지는 생리 재관류 동안 거품의 설립은 실패한 결과의 이유 대부분이었다.

라텍스의 재관류는 원래 오름차순 대동맥 2,3 통해 수행되었습니다 있지만, 재관류의 대체 경로는 왼쪽 심실 7,8 또는 온목 동맥 구를 포함보고됩니다. 우리는 오름 대동맥이나 왼쪽 심실 (게시되지 않은 관찰) 또는을 통해 결과에 따라 재관류에 큰 차이를 찾을 수 없습니다. 따라서 후자였다그 쉬운 접근성으로 인해 선택되었습니다.

본 연구에서 언급 된 특정 카본 블랙 잉크를 선택하기 전에, 우리는 상업적으로 이용 가능한 카본 블랙 잉크의 범위와 혈관 재관류의 결과를 평가하고 있습니다. CB1과 CB2는 착색 자신의 재관류 효율과 안정성을 위해 선택됩니다. 원래 서예 잉크로 제작 - - 높은 점도 (10-50 MPA / s)의 검은 2.5 %의 탄소를 포함 CB1는 CB2는 동안 2.1 % 카본 블랙을 포함하는 매우 낮은 점도 (1.1 MPA / 초)이 있습니다. 이 잉크의 개별 응용 프로그램은 착색의 효율성과 안정성 모두에 대한 불충분 한 것으로 판명되었습니다. 따라서, 우리는 잉크를 결합하여 조합 비율을 titrated 있습니다. 크고 작은 선박 모두의 영구적 인 얼룩의 1시 9분 비율 결과를 CB2 : CB1과 재관류. 따라서 동맥 anastomotic 포인트는 쉽게이 혈관 영역, 사이의 연결을 정의하기 위해 추적 할 수 있습니다. ACA와 MCA. 이 Findings 이전 보고서 2,10,11과 일치합니다.

ApoE KO 마우스는 5-8 배 높은 플라즈마 콜레스테롤 수준을 제시하고 콜레스테롤 풍부한 다이어트 12 일 넣을 때 죽상 경화증을 개발에 매우 민감합니다. 유전자 변형은 또한 뇌성 혈관의 해부학 적 구조에 영향을 미치는 여부는 아직보고되지 않았습니다. 한편, SV129 마우스는 이미 다른 혈관 해부학 2 인해 C57Bl6 / J 마우스에 비해 큰 경색 볼륨을 제시보고됩니다. 우리는 혈관 해부학의 차이를 비교하기 위해 동물의이 세 그룹에서 우리의 프로토콜을 확인했습니다.

허혈성 뇌에 착색 프로토콜의 유효성을 검사하기 위해, 우리는 주로 MCA 2-4, 10,13의 영구 폐색에 초점을 맞춘 이전 연구는 달리 reperfusion의 효과를 포함하는 과도 초점 뇌성 국소 빈혈을 참여. 예상했던대로, 우리는 리터의 패턴에 큰 차이를 관찰하지 않았다C57BL6 / J 마우스에서 다른 허혈성과 reperfusion 기간 후 문합의 오프라인. 허혈성 및 비 허혈성 뇌 사이의 혈관 직경에 변화가 관찰되지 않았습니다 추측 컨데, 그러한 변경이 더 reperfusion 시간에서 발생하는, 2-3주 14 포스트 스트로크. 결론적으로, 우리가 입증 프로토콜은 쉽게 뇌 vasculature를 시각적으로 기존의 라텍스 기반의 재관류에 비해 복제 할 수있는 덜 복잡하고, 비용 효율적인 기술입니다. 그것은 서로 다른 생리 학적 및 병리학 조건에서 뇌성 선박 및 혈관 지역의 해부학을 분석 할 수있는 효과적인 도구로 간주 될 수 있습니다. TTC이 기술을 얼룩과 결합하여 뇌 혈관 공급 영역의 컨텍스트에서 허혈성 모욕의 범위를 식별 할 수있는 새로운 기회를 제공합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

우리는 동영상 촬영 준비를 구성하는 그녀의 뛰어난 기술 지원 및 마헤 쿠마르 Teli에 대한 브리타 Kaltwasser 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scribtol Schwarz (CB2) Pelican, Germany 221 135
Stempelfarbe (CB1) Herlitz PBS AG, Germany 10417202
Gedeo Latex Pebeo, France 13042B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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