Внутрисосудистое перфузии Ink Углерод позволяет надежно визуализации сосудов головного мозга

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Анализ грызунов цереброваскулярных анатомии играет важную роль в экспериментальных исследованиях инсульта. В этом контексте внутрисосудистого перфузии с цветным латексом была рассмотрена в качестве стандартного инструмента в течение нескольких лет. Однако, этот метод предполагает различные технические ограничения, которые подрывают его воспроизводимости. Здесь мы рассмотрим простой способ для визуализации сосудов головного мозга в воспроизводимым образом. Инъекции смесь двух коммерчески доступных углерода черные чернила через левый желудочек инфаркт результатов в достаточном наполнении сосудов головного мозга с высоким визуализация контраста. Мы успешно применять эту технику, чтобы определить анастомоза между точками церебральных сосудистых территорий мышей с различным генетическим фоном. Мы, наконец, дать показания, что это новый и простой способ окрашивания судна могут быть объединены с трифенилтетразолий хлорид (TTC) окрашивание - широко используемый инструмент для наблюдения и анализа объемов инфаркта у мышей.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels. J. Vis. Exp. (71), e4374, doi:10.3791/4374 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Анатомического строения сосудов головного мозга является ключевым фактором для мозга гемодинамики, а также от степени серьезности травмы после ишемических инсультов. Церебральной сосудистой динамически реагирует на различные патофизиологические состояния и оно проявляет значительные различия между штаммами и в условиях генетических манипуляций. По сути, надежная техника для окрашивания внутричерепного судна необходимо в целях изучения патогенеза ишемического инсульта. До недавнего времени, множество различных методов был использован для визуализации мозговой сосудистой включая инъекции смола низкой вязкости, Araldite F, желатина смешивают с различными красителями 1 (т.е. карминно-красные, тушь) или латекса с 2 или без 3 сажи. Перфузии белого латекса соединение через восходящую аорту была впервые сообщил Койл и Jokelainen 3. Maeda и др. 2. Изменили протокол, добавив карбоп черные чернила на латекс соединения для улучшения визуализации контрастности сосудов после солевого перфузии головного мозга. Тем не менее, неэффективная и неадекватная перфузия заполнения сосудов часто испытывал из-за высокой вязкости соединения латекса 4. Таким образом, мы описали простой и экономически эффективный метод, используя смесь двух коммерчески доступных углерода черные чернила (CB1 и CB2) для визуализации мозговой сосудистой воспроизводимым образом 5. Мы показали, что перфузия CB1 + CB2 у мышей приводит к окрашиванию значительно меньших сосудов головного мозга в более высокую плотность по сравнению с латексом перфузии 5. Здесь мы описываем наш протокол для определения точки анастомоза между передней (ACA) и средней мозговой артерии (СМА), чтобы изучить судно изменений у мышей с различным генетическим фоном. Наконец, мы демонстрируем возможности нашей техники в переходном церебральной ишемии модели у мышей путем объединения CB1 +CB2-опосредованной судна окрашивания TTC окрашивания в различные степени ишемического повреждения.

Protocol

1. Животные

  1. Эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены местными властями. Для всех экспериментов, C57BL6 / J мышей дикого типа, ApolipoproteinE - / - (ApoE нокаутом) и SV129 мышей (12-16 недель, 26-30 г массы тела, 5-6 животных в опытной группе) были использованы.

2. Окрашивание сосудов головного мозга с цветной латекс

  1. Приготовить смесь из 25 мкл углерода черными чернилами (Herlitz, Германия) с 0,5 мл соединения латекса (Пебео, Франция) в соотношении 1:20 в EP трубку и нагреть смесь при 37 ° С на водяной бане. Сбор смеси в 2 мл шприц с иглой 28-30G до обезболивания животных.
  2. Растворите 50 мг papavarine порошок гидрохлорида в 1 мл стерильного физиологического раствора. Сбор решение в инсулиновый шприц. Оторвать иглы из другой стерильный шприц инсулина. Разместите эту иглу в конце 20 вм PE10 трубку. Теперь придаем этому PE10 трубки на иглу инсулина шприц, содержащий раствор гидрохлорида papavarine, который будет введен через бедренную вену, чтобы обеспечить расширение сосудов и надлежащего заполнения сосудов.
  3. Подготовьте еще два шприца инсулина, каждая из которых содержит 1 мл физиологического раствора. Инсулиновые шприцы позволяют бесперебойное предоставление закачиваемой жидкости в точном месте. Однако, из-за высокой вязкости латекса, альтернативные 1 мл шприца со съемной широкой иглы должен быть использован.
  4. Возьмите все шприцы и стерилизовать инструменты рассекает близко к операционной стадии. Распространение хирургических лист Draper вокруг стадии эксплуатации. Стадии эксплуатации должна быть достаточно освещена и операционный микроскоп может быть использован в случае необходимости.
  5. Теперь измерения веса тела C57BL6 / J мыши, а затем вызвать анестезию с 5% испаряется изофлурана в 70% N 2 O и 30% O 2. Продолжить анестезии 1% испаряется изофлурана. После надлежащего ПОЗИЦИОНИРОВАНИЕг мышью на спине и фиксации конечностей, оценить глубину анестезии. Затем порезать кожу над левой бедренной вены и найдите вену. Вставьте резкий кончик иглы размещены на PE10 трубку и медленно вводят раствор гидрохлорида papavarine в размере 100 мкл в минуту (50 мг / кг массы тела).
  6. После инъекции, разрезать брюшную полость и прокалывают мембрану. Вырезать ребра, чтобы разоблачить сердца без повреждения и кровоподтеки она. Клип нисходящей грудной аорты артерии пинцетом. Сделать резкий рассечение над правым предсердием, чтобы позволить венозной крови стечь. Вводят 2 мл физиологического раствора в левый желудочек, а затем с помощью инъекций цветной латекс вручную с небольшим давлением в течение 18-20 сек. Используйте предварительно заполненных шприцах один за другим. Избегайте любых инъекционных пузыри.
  7. После инъекций из латекса, оставить животное в течение 5 мин. Обезглавьте животных и тщательно удалить весь мозг. Заботьтесь, чтобы не повредить сосуд и архитектуры Corteх при удалении костей черепа и мозговых оболочек. Поместите мозга в 60 мм блюдо клеточной культуры содержащей 6-8 мл 4% PFA, чтобы сделать снимок. Поместите измерительную линейку под прозрачной блюдо. Возьмите фотографии на 25x увеличением спинной и брюшной поверхности головного мозга с камеры, подключенной к операционным микроскопом. Фотографии должны быть приняты под углом 90 ° между чашку Петри и объектива микроскопа в целях количественного оригинальный расстояния.
  8. Повторите процедуру в другой 4-5 животных.

3. Окрашивание сосудов головного мозга смесью сажи чернила

  1. Для сравнения результатов из латекса на основе мозговых сосудов окрашивание с нашим протоколом, приготовить смесь из 100 мкл Herlitz Stempelfarbe чернил (CB1) с 900 мкл Pelican Scribtol Schwarz чернил (CB2) в 1,5 мл трубки EP. Приготовьте две трубы EP, чтобы сделать общим объемом 2 мл смеси CB1 и CB2 в 1:09 отношение. Соберите смесь в двух отдельных шприцах инсулин (1мл каждая). Закройте шприц и разместить их на водяной бане нагреть до 37 ° C. Сбор 2 мл физиологического раствора в другой два шприца инсулина, и поместить их в ванну с водой, а также.
  2. Анестезию животного и повторите ту же процедуру, как описано выше, за исключением введения papavarine гидрохлорида. После инъекций по 2 мл salaine в левый желудочек, вводят 2 мл смеси углерода черные чернила вместо цветного латекса. Выполнять инъекции вручную с небольшим давлением в течение 18-20 сек на мл. Клип нисходящей грудной аорты до инъекции.
  3. Жертвоприношение животного, удалить мозг и сделать фотографии.
  4. Для длительного сохранения мозга, положил мозг в 4% PFA в течение ночи с последующей инкубацией с сахарозой с постепенно возрастающей концентрации до плавающий мозг погружается полностью (5% затем 15%, затем 30%). Мозг животных перфузии с цветным латексом также может быть сохранена в том же пути.
  5. ВыполнитьПроцедура в другой 4-5 животных. Чтобы сравнить разницу в церебральной сосудистой анатомии в связи с различным генетическим фоном или штаммы, повторить протокол в равном количестве ApoE KO и SV129 мышей, соответственно.
  6. Для изучения сосудистой анатомии при ишемическом условий, вызывать переходные церебральной ишемии в течение 45 мин или 90 мин в соответствии со стандартным протоколом внутрипросветного окклюзии СМА под глубоким наркозом (подробное описание операции выходит за рамки настоящей статьи; Мы отсылаем читателя к Doeppner и соавт., 2010). В конце периода реперфузии планируется (1 день или 5 дней), выполните сосудистой окрашивания CB1 CB2 + чернила только и пятно весь мозг с 2%-ным раствором TTC при 37 ° С в течение 5-10 минут, чтобы определить объем инфаркта . TTC сводится к красной формазана в митохондриальных ферментов (в частности, сукцинатдегидрогеназы). После окрашивания ТТК, метаболически активных тканей пятна темно-красный, а инфарктом ткани остается unstaiНед и появляется белый в связи с неблагополучной и денатурированной митохондриальных ферментов. Сбор изображений таким же образом, как описано выше.

4. Изучение мозговых сосудов территорий

  1. Для анализа валовой анатомии сосудов головного мозга, изображения спинной поверхности мозга или окрашенные цветной латекс или CB1 CB2 + чернила могут быть проанализированы с ImageJ программного обеспечения (Java на основе программных средств для обработки и анализа изображений). Мозги перфузии с цветной латекс может показать различной степени окрашивания судно находится на спинной поверхности, в то время как CB1 + CB2 перфузии запятнал все суда как на брюшной и спинной поверхности.
  2. Откройте файл изображения с помощью программного обеспечения ImageJ. Определите все точки анастомоза между ПМА и СМА. Точка анастомоза определяется как место, где диаметр сосуда является узким или половину расстояния между ближайшими точками ветвления ПМА и СМА филиалов, соответственно 2.
  3. Установите шкалу в мм. Измерьте расстояние между линией анастомоза и срединной линии на 4 мм каудально к лобного полюса мозга с помощью прямой инструмент для рисования линий и «мера» инструмент. Сделайте то же самое на 6 мм каудально от лобного полюса. Анализ 3-4 изображений на животных и рассчитать среднее значение. Сравните значения между различными группами животных, чтобы определить изменение мозгового анатомии. В C57BL6 / J животных, линии анастомоза между ПМА и СМА можно проследить ближе к срединной линии на 4 мм, чем на 6 мм каудально от лобного полюса. ApoE KO мышей не представляют существенной разницы в этом отношении. Напротив, в SV129 мышей линии анастомоза будет лежать дальше и параллельно средней линии, как на 4 мм и 6 мм каудально от лобного полюса.
  4. Для анализа сосудистой анатомии яп ишемическая условиях, выполняют те же расчеты, упомянутые выше. Определить миокарда границы, красный и белый цвет края ткани представляет метаболически активных тканей и некротических тканей неокрашенные, соответственно. Измерьте расстояние от инфаркта границы от срединной линии на 4 мм и 6 мм в хвостовой от лобного полюса головного мозга. Сбор среднее значение от 3-4 изображений на животных. Сравнение результатов между различными ишемии и реперфузии периоды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В протоколе описаны здесь преодолевает технические ограничения обычных латекса на основе визуализации грызунов церебральной сосудистой сети. Рисунок 1А показывает, что после перфузии цветной латекс, только крупные сосуды на вентральной поверхности окрашивают, оставляя весь спинной поверхности неокрашенными. Результатом является также сильно варьирует. Только одно животное из шести показывает, частичное окрашивание ПМА и СМА видны на поверхности спинного мозга (данные не показаны). Наоборот, CB1 + CB2 перфузии результатов в достаточном наполнении больших и малых судов в равной степени (рис. 1б). Окрашивание стабилен до 7 дней без изменения качества. Использование программы ImageJ, мы количественно расстояние анастомоза пунктов между ПМА и СМА от средней линии в дикий тип C57BL6 / J мышей (рис. 1С). Мы сравнили эти значения с ApoE мышей KO соблюдать или нет генетической МОДИФИКАЦИЯна какое-либо воздействие на региональный сосудистый анатомии (рис. 1D). Несмотря на то, выбив из ApoE не влияет анатомическое строение сосудов головного мозга в C57BL6 / J мышей, значительная разница была замечена между C57BL/6J и SV129 штаммов (рис. 1E, F). Таким образом, мы можем показать возможности этого протокола окрашивания для оценки анатомических различий головного сосудистой из-за генетических или деформации различия в мышах.

В экспериментальной модели инсульта грызунов, TTC окрашивания широко используется для наблюдения за миокарда объеме. Одновременная визуализация сосудов головного мозга и миокарда объемом дают нам возможность проанализировать морфологические изменения после ишемии-реперфузии. Таким образом, мы убедились, или не CB1 + CB2-опосредованной сосудистой окрашивания был стабильным с TTC окрашивания в различные степени ишемических-реперфузии травмы (рис. 2A-H). Далее мы проанализировали анастомоза Точки между ПМА и СМА через 45 мин или 90 мин ишемии соответствуют либо с 1 дня или 5 дней реперфузии периодов (рис. I, J). Как и ожидалось, среднее расстояние между средней линией и точками анастомоза не показали существенных различий между группами (рис. 2I, J) и находится в том же диапазоне с неишемической животных (рис. 1F). Тем не менее, расстояние от срединной линии на границе миокарда значительно отличались, отражающие увеличение объема миокарда с высокой степенью ишемии-реперфузии (рис. 2K, L). Эти данные показывают, что CB1 + CB2 окрашивания может быть воспроизведен в животных, подвергнутых различной степени ишемии-реперфузии и стабильность окрашивания в сочетании с окрашиванием TTC.

374/4374fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Наблюдение за церебральной сосудистой анатомии у мышей с генетическими различиями и процедить. Рис. 1А показывает, что внутрисосудистого перфузии цветные пятна латекса только крупные сосуды на брюшной поверхности, а спинной поверхности остаются неокрашенными. Наоборот, CB1 + CB2 перфузии приводит к постоянным окрашиванием как небольших, так и крупных сосудов на вентральной и дорсальной поверхности мозга (рис. 1б). Количественная оценка расстояния от точки анастомоза между передней мозговой артерии (ПМА) и средней мозговой артерии (СМА) от средней линии в дикий тип C57BL6 / J мышей (рис. 1С) не показывают разницу с их генетически мутантных ApoE коллегами KO (рис. 1D). Тем не менее, значительная разница между заметил C57BL6 / J и SV129 штаммов (рис. 1E, F). Шкала бар = 2 мм. * Значительно отличается как от C57BL6 / J дикого типа и ApoE KO мышей на 4 мм, с р <0,01.

Рисунок 2
Рисунок 2. Анализ сосудистой анатомии при ишемической мозги. Рис. 2A-H шоу изображений брюшной и спинной поверхности мозга подвергается до 45 мин или 90 мин ишемии на 1 день или 5 дней реперфузии времени. Левая панель показывает CB1 + CB2 опосредованное сосудистых пятен, в то время как правая панель показывает комбинацию обоих сосудистых пятен и TTC окрашивания, с указанием стабильности сосудистой окрашивание в различные степени ишемических-реперфузии травмы (рис. 2A-H). Анализ анастомоза пунктов между передней мозговой артерии (ПМА) и средней мозговой артерии (СМА) в течение 45 мин или 90 мин ишемии соответствуют либо с 1 дня или 5 дней периода реперфузии де-пиктов никаких существенных различий между группами (рис. 2I, J). Тем не менее, существенное различие можно отметить на расстоянии от средней линии на границе миокарда, указывая на увеличение объема миокарда с высокой степенью ишемии-реперфузии (рис. 2K, L). Шкала бар = 2 мм. * Значительно отличается от 45 мин ишемии с 1 день реперфузии, р <0,05 и ** 5 дней реперфузии, р <0,01. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Перфузии + CB1 CB2 ручной инъекций может осуществляться успешно без интенсивного обучения, поскольку оно не связано с каким-либо конкретным устройством, подразумевает определенное давление 2,3. Неоднородность перфузии результатов в нашем протоколе также незначительна. Только 1 животное из 16 неишемической животных и 3 из 20 ишемического животных показали, неполная перфузии. В этих случаях включение пузырьков во время солевого перфузии приводит к закупорке сосудов, скорее всего, причиной неудачного результата.

Хотя перфузии латекса первоначально была осуществляться через восходящей аорты 2,3, альтернативные маршруты перфузии также сообщила, в том числе левого желудочка 7,8 или общей сонной артерии 9. Мы не обнаружили никакой существенной разницы в результатах после перфузии либо через восходящей аорты или левого желудочка (неопубликованные данные). Таким образом, последний былвыбрана в связи с его легче доступности.

Перед выбором конкретного углерода черные чернила, упомянутые в настоящем исследовании мы оценивали результаты внутрисосудистого перфузии с диапазоном имеющихся в продаже углеродных черные чернила. CB1 и CB2 выбраны за их эффективности перфузии и устойчивость окраски. CB1 имеет очень низкую вязкость (1,1 мПа / сек), содержащего 2,1% углерода при CB2 - изначально выпускается в виде каллиграфии тушью - содержит 2,5% углерода с более высокой вязкостью (10-50 мПа / с). Индивидуальное применение этих красок были признаны недостаточными в отношении эффективности и устойчивости окраски. Следовательно, мы объединили красок и титруют комбинации коэффициентов. Перфузии с CB1: CB2 в 1:09 соотношение результатов в постоянном окрашивании больших и малых судов. Таким образом, артериальная анастомозов точки можно легко проследить, чтобы определить стыке двух сосудистых территорий, то есть. ПМА и СМА. Эти Findings согласуются с предыдущими докладами 2,10,11.

ApoE KO мышей представить 5-8 раза выше уровня холестерина в плазме крови и очень восприимчивы к развитию атеросклероза, если положить на диету, богатую холестерином 12. Ли генетические модификации также влияет на анатомию сосудов головного мозга не пока не поступало. С другой стороны, SV129 мышей уже сообщалось представить больший объем миокарда по сравнению с C57BL6 / J мышей в связи с их различной сосудистой анатомии 2. Мы проверили наши протокола в этих трех группах животных, чтобы сравнить разницу в сосудистой анатомии.

Для проверки протокола окрашивания при ишемической мозги, мы привлекали переходные церебральной ишемии включить эффекты реперфузии в отличие от предыдущих исследований, в которых в основном сосредоточены на постоянной закупорки MCA 2-4, 10,13. Как и ожидалось, мы не наблюдали каких-либо значительных различий в структуре лнеравенства анастомоза после различных ишемических и реперфузионных периодов в C57BL6 / J мышей. Никаких изменений в сосуд диаметром от ишемической и неишемической полушариями наблюдалось, по-видимому, такие изменения происходят на более длительное время реперфузии, то есть через 2-3 недели после инсульта 14. В заключение, протокол свидетельствует нас является менее сложным, экономически эффективной техники, которая может быть легко воспроизведен в сравнении с обычными латекса на основе перфузии для визуализации церебральной сосудистой сети. Это можно рассматривать как эффективный инструмент для анализа валовой анатомии сосудов головного мозга и сосудов территорий в различных физиологических и патологических состояниях. В сочетании с TTC окрашивания эта техника открывает новые возможности для выявления степени ишемического инсульта в контексте сосудистых зон питания в головном мозге.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Бритта Kaltwasser за отличную техническую помощь и Махеш Кумар Тели организовать подготовку видеосъемки.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scribtol Schwarz (CB2) Pelican, Germany 221 135
Stempelfarbe (CB1) Herlitz PBS AG, Germany 10417202
Gedeo Latex Pebeo, France 13042B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, H., Peng, Y., et al. Nuclear contrast angiography: A simple method for morphological characterization of cerebral arteries. Brain Research. 1261, 75-81 (2009).
  2. Maeda, K., Hata, R., et al. Differences in the cerebrovascular anatomy of C57black/6 and SV129 mice. Neuroreport. 9, (7), 1317-1319 (1998).
  3. Coyle, P., Jokelainen, P. T. Dorsal cerebral arterial collaterals of the rat. The Anatomical Record. 203, 397-404 (1982).
  4. Coyle, P. Dorsal cerebral collaterals of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) and Wistar Kyoto rats (WKY). The Anatomical Record. 218, 40-44 (1987).
  5. Hasan, M. R., Herz, J., et al. Visualization of macroscopic cerebral vessel anatomy—A new and reliable technique in mice. Journal of Neuroscience Methods. 204, 249-253 (2012).
  6. Doeppner, T. R., Nagel, F., et al. TAT-Hsp70-mediated neuroprotection and increased survival of neuronal precursor cells after focal cerebral ischemia in mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 1187-1196 (2009).
  7. Todo, K., Kitagawa, K., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances leptomeningeal collateral growth induced by common carotid artery occlusion. Stroke. 39, (6), 1875-1882 (2008).
  8. Sugiyama, Y., Yagita, Y., et al. Granulocyte colony-stimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke. Stroke. 42, (3), 770-775 (2011).
  9. Busch, H. J., Buschmann, I. R., et al. Arteriogenesis in hypoperfused rat brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23, (5), 621-628 (2003).
  10. Maeda, K., Hata, R., et al. Regional metabolic disturbances and cerebrovascular anatomy after permanent middle cerebral artery occlusion. in C57black/6 and SV129 mice. Neurobiology of Diseases. 6, 101-108 (1999).
  11. Wang, Y., Kilic, E., et al. VEGF overexpression induces post-ischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena. Brain. 128, (1), 52-63 (2005).
  12. ElAli, A., Doeppner, T. R., et al. Increased blood-brain barrier permeability and brain edema after focal cerebral ischemia induced by hyperlipidemia: Role of lipid peroxidation and calpain 1/2, matrix metalloproteinase-2/9, and RhoA overoxidation. Stroke. 42, (2011).
  13. Coyle, P., Jokelainen, P. T. Differential outcome to middle cerebral artery occlusion in spontaneously hypertensive stroke-prone rats (SHRSP) and Wistar Kyoto (WKY) rats. Stroke. 14, 605-611 (1983).
  14. Coyle, P. Diameter and length changes in cerebral collaterals after middle cerebral artery occlusion in the young rat. The Anatomical Record. 210, (2), 357-364 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics