La perfusion intravasculaire de carbone d'encre noire permet une visualisation fiable des vaisseaux cérébraux

Neuroscience

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Summary

Analyse de l'anatomie vasculaire cérébral des rongeurs joue un rôle important dans la recherche sur l'AVC expérimental. Dans ce contexte, la perfusion intravasculaire avec du latex coloré a été considéré comme un outil standard pour plusieurs années. Cependant, cette technique implique des limitations techniques distinctes, qui nuisent à sa reproductibilité. Nous décrivons ici une méthode simple pour visualiser les vaisseaux cérébraux de façon reproductible. Injection d'un mélange de deux encres noires de carbone disponibles dans le commerce par le biais des résultats du myocarde du ventricule gauche dans le remplissage adéquat des vaisseaux cérébraux avec visualisation à contraste élevé. Nous avons appliqué avec succès cette technique pour identifier les points anastomotiques entre les territoires vasculaires cérébraux de souris avec différents fonds génétiques. Nous avons finalement témoigner que ce nouveau procédé et simple pour la coloration navire peut être combiné avec du chlorure de triphényltétrazolium (TTC) coloration - un outil largement utilisé pour observer et analyser volumes d'infarctus chez la souris.

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Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels. J. Vis. Exp. (71), e4374, doi:10.3791/4374 (2013).

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Abstract

La structure anatomique des vaisseaux cérébraux est un facteur déterminant pour l'hémodynamie du cerveau ainsi que la gravité des blessures à la suite lésions ischémiques. Le système vasculaire cérébral répond dynamiquement aux différents états physiopathologiques et elle présente des différences considérables entre les souches et dans des conditions de manipulations génétiques. Essentiellement, une technique fiable pour la coloration vaisseaux intracrâniens est indispensable pour étudier la pathogenèse de l'AVC ischémique. Jusqu'à tout récemment, un ensemble de techniques différentes ont été utilisées pour visualiser la vascularisation cérébrale, y compris l'injection de résine de faible viscosité, araldite F, de la gélatine mélangée avec divers colorants 1 (c.-à-rouge carmin, encre de Chine) ou en latex avec 2 ou sans 3 du noir de carbone. Perfusion de latex composé blanc à travers l'aorte ascendante a été d'abord rapporté par Coyle et Jokelainen 3. Maeda et al. 2 ont modifié le protocole en ajoutant carbon encre noire pour le composé de latex pour un meilleur contraste de visualisation des vaisseaux après une perfusion saline du cerveau. Cependant, la perfusion inefficace et un mauvais remplissage des navires sont souvent vécu en raison de la viscosité élevée du composé de latex 4. Par conséquent, nous avons décrit une technique simple et rentable en utilisant un mélange de deux encres de carbone commercialement disponibles noir (CB1 et CB2) pour visualiser la vascularisation cérébrale de façon reproductible 5. Nous avons montré que la perfusion avec CB1 CB2 + dans les résultats de la souris, la coloration des vaisseaux cérébraux significativement plus petits à une densité plus élevée par rapport à la perfusion latex 5. Ici, nous décrivons notre protocole d'identifier les points anastomotiques entre la partie antérieure (ACA) et les artères cérébrales moyennes (MCA) pour étudier les variations des navires dans les souris de différentes origines génétiques. Finalement, nous démontrons la faisabilité de notre technique dans un modèle transitoire ischémie cérébrale focale chez la souris en combinant CB1 +Coloration navire CB2 médiée par coloration TTC à des degrés divers de lésions ischémiques.

Protocol

1. Animaux

  1. Des expériences ont été réalisées selon les directives du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par les autorités locales. Pour toutes les expériences, C57BL6 / J souris de type sauvage, apolipoprotéine - / - (ApoE KO) et SV129 souris (12-16 semaines, 26-30 g de poids corporel, 5-6 animaux par groupe expérimental) ont été utilisés.

2. Coloration des vaisseaux cérébraux avec du latex coloré

  1. Préparer un mélange de 25 ul encre de carbone noir (Herlitz, Allemagne) avec 0,5 ml de composé de latex (Pébéo, France) dans un rapport 1:20 dans un tube PE et faites chauffer le mélange à 37 ° C dans un bain-marie. Recueillir le mélange dans une seringue 2 ml munie d'une aiguille de 28-30G avant que l'animal anesthésié.
  2. Dissolvez 50 mg de poudre de chlorhydrate papavarine dans 1 ml de solution saline normale stérile. Recueillir la solution dans une seringue à insuline. Casser l'aiguille d'une autre seringue à insuline stérile. Placer cette aiguille à l'extrémité d'un c 20m PE10 tube. Maintenant fixer ce tube PE10 sur l'aiguille de la seringue contenant la solution de chlorhydrate d'insuline papavarine à être injecté dans la veine fémorale pour assurer un remplissage convenable et vasodilatation des vaisseaux.
  3. Préparer deux autres seringues à insuline contenant chacun 1 ml de solution saline. Seringues à insuline permet une libération lente du fluide injecté à un endroit précis. Toutefois, en raison de la viscosité élevée de latex, de remplacement des seringues de 1 ml avec aiguilles amovibles plus larges devraient être utilisés.
  4. Prendre toutes les seringues et les instruments stérilisés dissection proches de la phase d'exploitation. Étendre une feuille de drapier chirurgicale autour de la phase d'exploitation. La phase d'exploitation devrait être suffisamment éclairée et d'un microscope opératoire peut être utilisé si nécessaire.
  5. Maintenant, mesurer le poids du corps d'une souris C57BL6 / J puis induire une anesthésie avec l'isoflurane 5% vaporisé dans 70% de N 2 O et 30% d'O 2. Continuer anesthésie avec de l'isoflurane 1% vaporisé. Après POSITIONNEMENT bong de la souris sur le dos et les branches de fixation, d'évaluer la profondeur de l'anesthésie. Ensuite, couper la peau au-dessus de la veine fémorale gauche et localiser la veine. Insérez l'extrémité pointue de l'aiguille placée sur le tube PE10 et injecter lentement une solution de chlorhydrate papavarine à un taux de 100 pi par min (50 poids corporel mg / kg).
  6. Après l'injection, couper la cavité abdominale et percer la membrane. Couper les côtes pour exposer le cœur sans endommager ou ecchymoses il. Fixez le aorte thoracique descendante avec une pince hémostatique. Faites une coupe nette sur l'oreillette droite pour permettre au sang veineux s'écouler. Injecter 2 ml de solution saline dans le ventricule gauche, suivie par l'injection du latex coloré manuellement avec une légère pression sur 18-20 sec. Utiliser les seringues pré-remplies l'une après l'autre. Éviter d'injecter des bulles.
  7. Après l'injection de latex, de laisser l'animal pendant 5 min. Décapiter l'animal et retirez avec précaution l'ensemble du cerveau. Prenez bien soin de ne pas blesser l'architecture des navires et cortex tout en enlevant les os du crâne et des méninges. Placez le cerveau dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm contenant 6-8 ml de PFA à 4% pour prendre une photo. Placez une règle de mesure sous la parabole transparente. Prenez des photos avec un grossissement 25x de la dorsale et la face ventrale du cerveau avec une caméra fixée dans le microscope opératoire. Les photos doivent être prises à un angle de 90 ° entre la boîte de Pétri et l'objectif du microscope afin de quantifier la distance d'origine.
  8. Répétez la procédure dans un autre animaux 4-5.

3. Coloration des vaisseaux cérébraux avec mélange d'encres noir de carbone

  1. Pour comparer les résultats de latex à base de coloration vasculaire cérébral avec notre protocole, préparer un mélange de 100 pi de Herlitz Stempelfarbe d'encre (CB1) avec 900 pi de Pelican Scribtol encre Schwarz (CB2) dans un tube de 1,5 ml EP. Préparer deux tubes PE pour obtenir un volume total de 2 ml de mélange de CB1 et CB2 dans un rapport de 1:9. Recueillir le mélange dans deux seringues à insuline séparées (1ml chacune). Reboucher les seringues et les placer dans un bain d'eau à chauffer à 37 ° C. Recueillir 2 ml de solution saline dans un autre seringues à insuline deux et placez-les dans un bain d'eau aussi bien.
  2. Anesthésier l'animal et répétez la même procédure que celle décrite précédemment pour l'injection de chlorhydrate de papavarine. Suite à l'injection de 2 ml salaine dans le ventricule gauche, injecter un mélange de 2 ml d'encres noir de carbone à la place du latex coloré. Effectuer les injections à la main avec une légère pression sur 18-20 sec par ml. Fixez le aorte thoracique descendante avant les injections.
  3. Sacrifier l'animal, retirez le cerveau et prendre des photos.
  4. Pour préservation à long terme du cerveau, mettre le cerveau en PFA à 4% durant la nuit suivie d'une incubation avec du saccharose avec une concentration progressivement croissante jusqu'à ce que le cerveau flottant submerge totalement (5% puis 15% puis 30%). Cerveaux des animaux perfusés avec du latex coloré peut aussi être conservé de la même manière.
  5. Effectuez l'procédure dans un autre animaux 4-5. Pour comparer la différence de l'anatomie vasculaire cérébral dû à bagage génétique différent ou souches, répéter le protocole en nombre égal de ApoE KO et SV129 souris, respectivement.
  6. Pour étudier l'anatomie vasculaire dans des conditions ischémiques, induire une ischémie cérébrale focale transitoire pendant 45 min ou 90 min selon un protocole standard de l'occlusion intraluminale de la MCA sous anesthésie profonde (une description détaillée de l'opération dépasse le cadre de cet article, le lecteur est renvoyé à Doeppner et al., 2010). A la fin de la période de reperfusion prévu (1 jour ou 5 jours), effectuer la coloration vasculaire avec CB1 CB2 + uniquement les encres et tacher le cerveau entier avec une solution à 2% TTC à 37 ° C pendant 5-10 min pour identifier le volume de l'infarctus . TTC est réduit en formazan coloré en rouge par les enzymes mitochondriales (en particulier le succinate déshydrogénase). Après coloration TTC, les taches des tissus métaboliquement actifs profonde en rouge lorsque le tissu infarci reste unstainie et apparaît en blanc en raison de dysfonctionnements enzyme mitochondriale et dénaturé. Recueillir des images de la même manière que décrit ci-dessus.

4. Etude des Territoires vasculaires cérébraux

  1. Pour analyser l'anatomie des vaisseaux cérébraux, des images de la surface dorsale du cerveau, soit colorées avec du latex coloré ou CB1 CB2 + encres peuvent être analysées avec le logiciel ImageJ (un logiciel Java domaine public utilisé pour le traitement d'images et l'analyse). Brains perfusés avec du latex coloré peut présenter des degrés variables de coloration navire situé sur la face dorsale, tandis que CB1 CB2 + perfusion tacher tous les navires sur les deux faces ventrales et dorsales.
  2. Ouvrir un fichier image avec le logiciel ImageJ. Identifier tous les points anastomotiques entre l'ACA et le MCA. Un point d'anastomose est défini comme le lieu où le diamètre de la cuve est plus étroit ou la moitié de la distance entre les points les plus proches de ramification de l'ACA et les branches MCA, respectivement 2.
  3. Définition de l'échelle en mm. Mesurez la distance entre la ligne anastomotique et la ligne médiane de 4 mm caudale du pôle frontal du cerveau en utilisant l'outil de dessin en ligne droite et «mesure» de l'outil. Faites de même à 6 mm caudalement du pôle frontal. Analyser les images 3-4 par animal et calculer la valeur moyenne. Comparer les valeurs entre les différents groupes d'animaux pour identifier la variation de l'anatomie vasculaire cérébral. En C57BL6 / J animaux, la ligne anastomotique entre l'ACA et le MCA peut être retracée plus proche de la ligne médiane de 4 mm à 6 mm de caudale du pôle frontal. Souris KO ApoE présentera pas de différence significative à cet égard. Au contraire, dans SV129 souris la ligne anastomotique se situera mm plus loin et parallèle à la ligne médiane à la fois à 4 mm et 6 caudale du pôle frontal.
  4. Pour analyser l'anatomie vasculaire in des conditions ischémiques, effectuer les mêmes calculs mentionnés ci-dessus. Identifier la frontière infarctus que la marge de tissu de couleur rouge et blanc représentant métaboliquement active et le tissu nécrotique du tissu non coloré, respectivement. Mesurer la distance de la bordure de la ligne médiane du myocarde à 4 mm et 6 mm à partir du pôle caudal frontal du cerveau. Récupérer la valeur moyenne à partir d'images 3-4 par animal. Comparer les résultats entre les périodes d'ischémie reperfusion et différente.

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Representative Results

Le protocole décrit ici permet de surmonter les limitations techniques de visualisation classique à base de latex de la vascularisation cérébrale de rongeurs. La figure 1A montre que la perfusion suivante du latex coloré, seuls les grands navires sur la face ventrale sont tachés, laissant toute la face dorsale non colorées. Le résultat est également très variable. Un seul animal sur six spectacles de coloration partielle de l'ACA et le MCA visible sur la face dorsale du cerveau (données non présentées). A l'inverse, CB1 CB2 + résultats de perfusion dans le remplissage suffisant de navires petits et grands de manière égale (figure 1B). La coloration est stable jusqu'à 7 jours sans aucun changement de qualité. Utilisation du programme ImageJ, nous avons quantifié la distance des points anastomotiques entre l'ACA et le MCA de la ligne médiane de type sauvage C57BL6 / J souris (figure 1C). Nous avons comparé ces valeurs avec les souris KO ApoE d'observer si oui ou non la génétique MODIFICATIsur eu aucun effet sur ​​l'anatomie régionale vasculaire (figure 1D). Bien que assommant de l'ApoE n'a pas d'incidence sur la structure anatomique des vaisseaux cérébraux dans C57BL6 / J souris, une différence significative a été observée entre les souches C57BL/6J et SV129 (figure 1E, F). Ainsi, nous sommes en mesure de démontrer la faisabilité de ce protocole de coloration pour évaluer les différences anatomiques de la vascularisation cérébrale due à des différences génétiques ou de la souche de souris.

Dans des modèles expérimentaux d'AVC chez les rongeurs, la coloration TTC est largement utilisé pour observer le volume d'infarctus. Visualisation simultanée des vaisseaux cérébraux et infarctus du volume nous donne l'occasion d'analyser les changements morphologiques suivant l'ischémie-reperfusion. Par conséquent, nous avons vérifié si oui ou non CB1 CB2 + médiée par coloration vasculaire est stable avec une coloration TTC à des degrés divers de lésions ischémiques-reperfusion (figure 2A-H). Nous avons en outre analysé l'anastomose points entre l'ACA et le MCA après 45 min ou 90 min d'ischémie correspondent soit avec des périodes de 1 jour ou 5 jours de reperfusion (figure I, J). Comme prévu, la distance moyenne entre la ligne médiane et les points anastomotiques n'a montré aucune différence significative entre les groupes (figure 2I, J) et était dans la même gamme de non-ischémiques animaux (figure 1F). Toutefois, la distance de la ligne médiane de la frontière infarctus significativement différente, reflétant le volume d'infarctus accrue avec degré plus élevé d'ischémie-reperfusion (Figure 2K, L). Ces données montrent que CB1 CB2 + coloration peut être reproduit chez les animaux soumis à des degrés divers d'ischémie-reperfusion et la stabilité de la coloration lorsqu'il est combiné avec coloration TTC.

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Figure 1. Observation de l'anatomie vasculaire cérébral chez la souris avec des différences génétiques et de la souche. La figure 1A montre que la perfusion intra-vasculaire de latex coloré taches que les grands navires sur la face ventrale, tandis que la surface dorsale reste sans tache. A l'inverse, CB1 CB2 + résultats de perfusion dans une coloration permanente des deux navires petits et grands sur la face ventrale et les surfaces dorsales du cerveau (figure 1B). La quantification de la distance des points anastomotiques entre l'artère cérébrale antérieure (ACA) et l'artère cérébrale moyenne (ACM) à partir de la ligne médiane de type sauvage C57BL6 / J souris (figure 1C) ne montrent aucune différence avec leurs homologues génétiquement mutants KO ApoE (Figure 1D). Cependant, on a remarqué de différence significative entre les C57BL6 / J et SV129 souches (figure 1E, F). Barre d'échelle = 2mm. * Valeur significativement différente de la fois C57BL6 / J de type sauvage et les souris KO ApoE moins 4 mm, p p <0,01.

Figure 2
Figure 2. Analyse de l'anatomie vasculaire dans le cerveau ischémique. Figure images montrent 2A-H des surfaces ventrale et dorsale du cerveau soumis à 45 min ou 90 min d'ischémie suivie d'1 jour ou 5 fois reperfusion jours. Le panneau de gauche montre CB1 CB2 + coloration médiation vasculaire, tandis que le panneau de droite montre la combinaison des deux coloration vasculaire et la coloration TTC, ce qui indique la stabilité de la coloration vasculaire à des degrés divers de lésions ischémiques-reperfusion (figure 2A-H). Analyse des points anastomotiques entre l'artère cérébrale antérieure (ACA) et l'artère cérébrale moyenne (MCA) au bout de 45 min ou 90 min d'ischémie soit en correspondance avec la période 1 jour ou 5 jours de reperfusionPictes pas de différence significative entre les groupes (figure 2I, J). Toutefois, la différence significative peut être indiquée dans la distance de la ligne médiane de la frontière infarctus, indiquant l'augmentation du volume de l'infarctus avec degré plus élevé d'ischémie-reperfusion (Figure 2K, L). Barre d'échelle = 2 mm. * Valeur significativement différente de l'ischémie 45 min avec 1 reperfusion jour, p <0,05 et ** 5 reperfusion jours, p <0,01. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

La perfusion de CB1 CB2 + par injection manuelle peut être effectuée avec succès par l'absence de formation intensive car il ne comporte pas de dispositif spécifique pour impliquer une certaine pression 2,3. L'hétérogénéité des résultats de perfusion dans notre protocole est également négligeable. 1 seul animal sur 16 animaux non ischémiques et 3 des 20 animaux ischémiques ont montré perfusion incomplète. Dans ces cas, l'incorporation de bulles pendant la perfusion saline conduisant à l'occlusion des vaisseaux était probablement la raison de la conclusion défavorable.

Bien que la perfusion de latex a été initialement réalisée par l'aorte ascendante 2,3, des routes alternatives de perfusion sont également signalés, y compris le ventricule gauche 7,8 ou de l'artère carotide commune 9. Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans les résultats de la perfusion à la suite, soit par l'aorte ascendante ou le ventricule gauche (observations non publiées). En tant que tel, celui-ci étaitchoisi en raison de son accessibilité plus facile.

Avant de sélectionner les encres noires de carbone spécifiques mentionnés dans la présente étude, nous avons évalué les résultats de perfusion intravasculaire avec une gamme d'encres de carbone commercialement disponibles noir. CB1 et CB2 sont sélectionnés pour leur efficacité de perfusion et la stabilité de coloration. CB1 a une viscosité très faible (1,1 mPa / s) contenant du carbone noir tandis que 2,1% CB2 - fabriqué à l'origine comme une encre de calligraphie - contient du carbone 2,5% noir avec une viscosité plus élevée (10-50 mPa / s). Application individuelle de ces encres ont été jugées insuffisantes en ce qui concerne à la fois l'efficacité et la stabilité de la coloration. Par conséquent, nous avons combiné les encres et titré les rapports de combinaison. Perfusion avec CB1: CB2 dans un rapport de 1:9 dans les résultats coloration permanente des deux grands et petits navires. Par conséquent, les points artères anastomotiques peuvent être facilement retrouvés pour définir la jonction entre deux territoires vasculaires, soit. l'ACA et le MCA. Ces fONCLUSIONS sont compatibles avec les précédents rapports 2,10,11.

Souris KO ApoE présenter 5-8 fois plus élevé taux de cholestérol plasmatique et sont très sensibles au développement de l'athérosclérose lorsqu'elles sont mises sur le taux de cholestérol régime alimentaire riche 12. Si la modification génétique affecte aussi l'anatomie des vaisseaux cérébraux n'a pas encore été rapporté. D'autre part, SV129 souris sont déjà signalés à présenter un plus grand volume d'infarctus par rapport aux souris C57BL6 / J en raison de leur anatomie vasculaire différente 2. Nous avons vérifié notre protocole dans ces trois groupes d'animaux à comparer la différence de l'anatomie vasculaire.

Pour valider le protocole de coloration dans les cerveaux ischémiques, nous avons impliqué transitoire ischémie focale cérébrale pour inclure les effets de la reperfusion contrairement aux études précédentes, qui ont porté essentiellement sur ​​l'occlusion permanente de la MCA 2-4, 10,13. Comme prévu, nous n'avons pas observé de différences significatives dans le modèle de la line de l'anastomose après différentes périodes ischémiques et de reperfusion dans des souris C57BL6 / J. Aucun changement dans les diamètres de vaisseau entre les hémisphères ischémiques et non ischémiques ont été observées, sans doute, de tels changements se produisent à des moments plus reperfusion, soit 2-3 semaines post-AVC 14. En conclusion, le protocole démontré par nous est moins compliquée, rentable technique, qui peuvent être facilement reproduits par rapport au latex perfusion conventionnelle basée sur de visualiser la vascularisation cérébrale. Il peut être considéré comme un outil efficace pour analyser l'anatomie des vaisseaux cérébraux et les territoires vasculaires dans différentes conditions physiologiques et pathologiques. En combinant avec TTC coloration cette technique fournit une nouvelle occasion de déterminer l'étendue d'une lésion ischémique dans le cadre des zones d'approvisionnement vasculaires dans le cerveau.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Britta Kaltwasser pour son excellente assistance technique et Mahesh Kumar Teli à organiser la préparation tournage vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scribtol Schwarz (CB2) Pelican, Germany 221 135
Stempelfarbe (CB1) Herlitz PBS AG, Germany 10417202
Gedeo Latex Pebeo, France 13042B

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References

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