घ्राण कीट antennal पालि में गैस क्रोमैटोग्राफी मल्टी इकाई रिकॉर्डिंग (GCMR) का उपयोग वाष्पशील की पहचान

Neuroscience

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Summary

घ्राण cues कीड़ों में कई अलग अलग व्यवहार मध्यस्थता और अक्सर जटिल अस्थिर यौगिकों के सैकड़ों के दसियों के शामिल मिश्रण हैं. कीट antennal पालि में मल्टी चैनल रिकॉर्डिंग के साथ गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करना, हम bioactive यौगिकों की पहचान के लिए एक विधि का वर्णन है.

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Byers, K. J., Sanders, E., Riffell, J. A. Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (72), e4381, doi:10.3791/4381 (2013).

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Abstract

Protocol

1. वाष्पशील Follection

  1. इस उदाहरण में, हम एम. से अस्थिर नमूने का उपयोग करें एक अल्पाइन wildflower कैलिफोर्निया के लिए देशी - lewisii फूल. वाष्पशील Riffell एट अल के अनुसार गतिशील sorption तरीकों का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं 14. संक्षेप में, इस विधि का एक बंद लूप फँसाने प्रणाली है जहां फूल एक Teflon बैग में संलग्न हैं कार्यरत हैं. एक आभ्यांतरिक वैक्यूम पंप का प्रयोग, फूलों के चारों ओर हवा एक "जाल" एक पाश्चर विंदुक के शामिल Porapak क्यू मैट्रिक्स के साथ भर के माध्यम से चूसा है. पंप से रिटर्न एयर सक्रिय लकड़ी का कोयला से फ़िल्टर्ड है. एक निर्धारित समय अवधि के बाद, हमारे मामले में 24 घंटे में, Porapak क्यू मैट्रिक्स के साथ एक गैर - ध्रुवीय विलायक है, आम तौर पर hexane eluted है, केंद्रित निकालने इकट्ठा. निकालने -80 में तो ° विश्लेषण जब तक सी संग्रहीत किया जाता है. यदि आवश्यक हो, तो नमूने नाइट्रोजन गैस की एक धारा के तहत विश्लेषण करने से पहले ध्यान केंद्रित कर सकते हैं. जब तक नमूना पहले से ही अच्छी तरह से विशेषता, एक के माध्यम से इसके बारे में एक नि: शेष भाजक चलानेगैस chromatograph मास स्पेक्ट्रोमीटर (जीसी - एमएस) अस्थिर घटकों की पहचान करने के लिए नमूना का उपयोग करने के लिए पहले.

2. Electrophysiological तैयारी

  1. एक 1,000 μl विंदुक टिप के अंत से लगभग 1 सेमी कट. विंदुक टिप के आधार में एक मधुमक्खी bumble (गुड़गुड़ाहट impatiens) प्लेस और धीरे टिप के विपरीत छोर की ओर धक्का तक केवल सिर अवगत कराया है.
  2. दंत मोम पिघल और यह उजागर सिर के चारों ओर मिट्टी, यकीन है कि सुरक्षा के लिए यौगिक आँखों पर और मोम का पालन करता है मधुमक्खी सिर पूरी तरह से स्थिर बनाने के लिए बना रही है. मधुमक्खी के एंटीना पर कोई मोम नहीं पाने के लिए सुनिश्चित.
  3. एक बार सिर सुरक्षित है, सिर कैप्सूल में एक वर्ग, चीरा खिड़की की तरह, एक रेजर ब्लेड ब्रेकर या उचित छल्ली में कटौती स्केलपेल आकार का उपयोग. ब्लेड ब्रेकर का प्रयोग, एंटीना और आसन्न करने के लिए एक यौगिक आँखों के पीछे तुरंत सिर कैप्सूल के पृष्ठीय पक्ष से शुरू करते हैं. कटौतीएक यौगिक आँख से contralateral यौगिक आँख के लिए एक सीधी रेखा. विपरीत यौगिक आँख के लिए एक सीधी रेखा में कटौती के बाद, सिर कैप्सूल घटता है और अपनी छाती के पास समाप्त हो जाती है जब तक एक चीरा पृष्ठीय बनाने शुरू. इस बिंदु पर, सिर कैप्सूल के विपरीत अंत की दिशा में कटौती शुरू करते हैं. अंत में, एक बार एक लाइन के विपरीत छोर पर कटौती की गई है, एक लाइन वापस प्रारंभिक चीरा के शुरू करने की स्थिति में कटौती. यह महत्वपूर्ण है कि एंटीना के लिए निकट छल्ली को दूर करने, के रूप में इस इलेक्ट्रोड की प्रविष्टि रोकना होगा.
  4. एक बार छल्ली काट रहा है, संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए मधुमक्खी छल्ली, जो तब मधुमक्खी के मस्तिष्क का खुलासा करना चाहिए और अधिक महत्वपूर्ण बात, antennal lobes हटाने. कीट नमक के साथ मस्तिष्क superfusing के तुरंत शुरू करने के लिए, तो यह है कि मस्तिष्क dessicated बन नहीं करता. मस्तिष्क के बाद उजागर हो रहा है, ध्यान से बहुत ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए तुरंत antennal lobes ऊपर perineural म्यान हटाने. बहुत सावधान रहना करने के लिए नहींसंदंश के साथ मधुमक्खी का मस्तिष्क पंचर.

3. मल्टी चैनल रिकॉर्डिंग के साथ गैस क्रोमैटोग्राफी

  1. मधुमक्खी "तैयारी" - अपने मस्तिष्क के साथ उजागर एक ट्यूब में तय अब electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तैयार है. एक क्लैंप में मधुमक्खी, एक चुंबकीय आधार है कि एक हवा मेज पर स्थित है के लिए तय जगह.
  2. एक चतुर्थ बैग, प्रवाह नियंत्रक, और व्यवस्था (कीट नमक के साथ भर) तो टयूबिंग कि खारा लगातार मस्तिष्क superfuses.
  3. एक micromanipulator, insertareference इलेक्ट्रोड, टंगस्टन तार के बने मधुमक्खी की आंखों में, का उपयोग करना.
  4. एक अलग micromanipulator का प्रयोग, मल्टी चैनल इलेक्ट्रोड, एक coiled तार, tetrode, या सिलिकॉन इलेक्ट्रोड मल्टी चैनल (Neuronexus टेक्नोलॉजीज) के रूप में सम्मिलित करने के लिए, मधुमक्खी की antennal lobes में. इस इलेक्ट्रोड TDT सिस्टम 3-Z Z बस TDT प्रणाली bioamp प्रोसेसर श्रृंखला के रूप में एक पूर्व एम्पलीफायर से जुड़ा है. गैस Chro से आउटपुटएक कवच bnc केबल के माध्यम से matogram डिटेक्टर एम्पलीफायर और डाटा अधिग्रहण ऐसी है कि दोनों तंत्रिका और जीसी संकेत सिंक्रनाइज़ है सिस्टम के साथ interfaced किया जा सकता है.
  5. तंत्रिका रिकॉर्डिंग को स्थिर करने के लिए लगभग 30-60 मिनट रुको. एक बार सहज गतिविधि और रिकॉर्डिंग चैनल में इकाइयों की तरंग आकार लगातार बन गए हैं, एक गंध सिरिंज का उपयोग करने के लिए मधुमक्खी उत्तेजित और गंध को रिकॉर्डिंग चैनलों की प्रतिक्रिया का पालन.
  6. द्वारा न्यूरॉन्स से कोशिकी spikes रिकार्ड ऑटो thresholding 3.5 5 सिग्मा व्यक्तिगत रिकॉर्डिंग चैनलों पर संकेत के द्वारा रिकॉर्डिंग चैनल. मैनुअल thresholding कुछ चैनलों के लिए आवश्यक हो सकता है बिजली के शोर से संक्रमण से बचने के लिए. न्यूरॉन्स से कार्रवाई की क्षमता रिकॉर्डिंग चैनल में वोल्टेज spikes के रूप में दिखाई देगा. जब चैनल वोल्टेज सीमा से अधिक है, सिस्टम buffers बचाता सीमा के पार से पहले और बाद में कुछ मिसे, जिससे takinगा तरंग की तस्वीर शॉट, या कील.
  7. तुरंत हवा मेज के बगल जीसी है. जीसी पुष्प निकालने में इंजेक्शन लगाने से पहले, सुनिश्चित करें कि जीसी चलाने के तापमान रैंप के लिए विधि सही है. हमारे उदाहरण में, हम 4 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से तापमान की वृद्धि हुई द्वारा पीछा मिनट के लिए तापमान 50 पर शुरू विधि डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें. 220 डिग्री सेल्सियस है, जो समय पर हम एक अतिरिक्त 6 मिनट के लिए जीसी पकड़. हम वाहक गैस के रूप में एक DB 5 जीसी (जम्मू और डब्ल्यू वैज्ञानिक, Folsom, CA, संयुक्त राज्य अमरीका) हीलियम के साथ कॉलम, का उपयोग करें. इनलेट splitless 200 डिग्री सेल्सियस तापमान के साथ सेट है, लौ ionization डिटेक्टर तापमान 230 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट कर दिया जाता है
  8. जीसी स्तंभ में adsorbed वाष्पशील जारी जीसी की गर्म इंजेक्शन बंदरगाह में पुष्प headspace निकालने नमूना सुई. स्तंभ से प्रवाह लौ Ionization (खूंटी) वेक्षक और मधुमक्खी एक गिलास "वाई" संबंधक (जम्मू एंड डब्ल्यू वैज्ञानिक) का उपयोग एंटीना के बीच 01:01 विभाजित है. आरईसी शुरू करोइलेक्ट्रोड से ording के रूप में आप जीसी में एक नमूना इंजेक्षन.
  9. जीसी रन के बाद समाप्त हो गया है, 5 से 15 मिनट के लिए तैयारी आराम करते हैं. तो या तो जीसी में एक और नमूना इंजेक्षन या एक अस्थिर यौगिकों या यौगिकों के मिश्रण का उपयोग कर तैयारी को प्रोत्साहित. तैयारी उत्तेजक के उत्तरार्द्ध में इस विधि में, एक निरंतर हवा स्ट्रीम से हवा की दालों फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा है जिस पर यौगिकों जमा किया गया है जिसमें एक गिलास सिरिंज के माध्यम से बँट कर रहे हैं. गंध प्रोत्साहन एक solenoid सक्रिय सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित वाल्व के माध्यम से स्पंदित किया गया था.
  10. यदि इकाई गतिविधि अचानक बंद हो जाता है या परिवर्तन, खारा ड्रिप की जांच और 15 मिनट के लिए तैयारी आराम करते हैं. यदि सहज गतिविधि अपने पिछले स्तर नहीं हासिल करता है तो तैयारी और त्याग किया जाना चाहिए एक और मधुमक्खी का इस्तेमाल अगर उपलब्ध है.
  11. प्रयोग के बाद, ऊतक में अभी भी जांच के साथ 20 मिनट के लिए 5 formalin% के साथ मस्तिष्क को ठीक. अगला, आबकारी मस्तिष्कऔर 2% glutaraldehyde में यह 4 घंटे के लिए जगह है, और बाद में वर्गीकृत इथेनॉल निर्जलीकरण श्रृंखला और मिथाइल salicylate के साथ मस्तिष्क को साफ. फिक्सिंग और ऊतक, जहां इलेक्ट्रोड की हवा निकाल दी ऊतक confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा स्पष्ट रूप से नमूदार होना चाहिए अल में स्थानों के समाशोधन के आधार पर.

4. डेटा विश्लेषण

  1. विश्लेषण के लिए अलग और दर्ज तंत्रिका इकाइयों की पहचान करने के लिए प्रयोग के बाद डाटा एकत्र. अलग waveforms, या "spikes", शिखर या घाटी आयाम, शिखर आधे चौड़ाई, आदि के रूप में कील आकार, या कम उपायों पर आधारित (प्रमुख घटक) 17 ठेठ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम (ऑफ़लाइन सॉर्टर, MClust, और SClust) का प्रयोग करें , 18 (2 चित्रा). केवल spikes है कि तीन आयामी अंतरिक्ष में अलग (PC1 PC3) और सांख्यिकीय एक दूसरे से अलग कर रहे हैं उन समूहों का उपयोग करें (बहुभिन्नरूपी एनोवा, पी <0.05) (2 चित्रा) आगे के विश्लेषण के लिए. कृपया देखेंtetrode रिकॉर्डिंग और कील - छँटाई के तरीके के पूर्ण विवरण के लिए प्रशस्ति पत्र # 17-19 s.
  2. प्रत्येक क्लस्टर में समय टिकट spikes, और MATLAB या Neuroexplorer (नेक्स टेक्नोलॉजीज, विंस्टन सलेम, नेकां) का उपयोग करने के लिए रेखापुंज भूखंडों और फायरिंग दर प्रतिक्रियाएं (2 आंकड़े, 3 ए) बनाने के विश्लेषण के लिए इन आंकड़ों का निर्यात.
  3. एक साथ दर्ज जीसी डेटा का उपयोग वाष्पशील की अवधारण के समय को पहचानें. वाष्पशील की अवधारण बार chromatogram से चोटी के शीर्ष द्वारा निर्धारित किया जाता है, का उपयोग उन बिंदुओं पर समय इकाई प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए.
  4. जीसी रन के माध्यम से अलग - अलग इकाई प्रतिक्रियाओं की जांच, 100 मिसे के अंतराल में spikes की संख्या बिन और संदर्भ के साथ दर प्रतिक्रियाओं वाष्पशील eluting की अवधारण समय फायरिंग के समय पाठ्यक्रम की जांच. 100 मिसे के अंतराल में spikes के binning समय जीसी से एक eluting odorant neuronal प्रतिक्रिया के पाठ्यक्रम के बारे में काफी विस्तार से, या संकेत प्रदान करता है.
  5. Exa के लिएअस्थिर खदान अलग eluting वाष्पशील जनसंख्या प्रतिक्रियाओं, एक 3 सेकंड नमूना खिड़की पर अलग अलग इकाइयों की फायरिंग दर प्रतिक्रियाओं को एकीकृत, 1.5 सेकंड पहले, और 1.5 सेकंड के बाद, अवधारण के समय (3 चित्रा). इस समय अवधि एक जीसी से अस्थिर eluting की अवधि के विशिष्ट है. और उन्हें प्रत्येक पंक्ति जीसी प्रवाह (स्तंभों) के कलाकारों की टुकड़ी प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व के साथ एक गतिविधि मैट्रिक्स के रूप में व्यवस्था (, हम रंग कोडिंग उन्हें (नीले रंग की एक कम प्रतिक्रिया है लाल एक उच्च फायरिंग दर प्रतिक्रिया) द्वारा फायरिंग इकाइयों की दर प्रतिक्रियाओं दिखा चित्रा 3).

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Representative Results

GCMR परख का उपयोग कर एम. lewisii फूलों की खुशबू है, हम जीसी में निकालने की 3 μl इंजेक्षन. जीसी के माध्यम से वाष्पशील eluting की कुल संख्या आम तौर पर 60-70 वाष्पशील. एम. की खुशबू lewisii मुख्य रूप से monoterpenoids का बना है, (अचक्रीय) β myrcene और α पाइनीन सहित 2 HEXANOL रूप में छह कार्बन वाष्पशील, और sesquiterpenoids कि headspace की <1% समावेश से बना खुशबू के शेष के साथ.

GCMR antennal पालि न्यूरॉन्स की संवेदनशीलता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से neuronal biologically महत्वपूर्ण वाष्पशील के प्रसंस्करण का लाभ लेता है. हालांकि, इस प्रकार की मल्टी चैनल रिकॉर्डिंग, प्रभाव में, antennal पालि में न्यूरॉन्स की एक यादृच्छिक नमूना ले. यह इसलिए है क्योंकि अलग तैयारी के बीच जांच की स्थिति की स्थिति में मामूली परिवर्तन रिकॉर्डिंग सरणी अलग न्यूरॉन्स नमूना के लिए पैदा कर सकता है. इसके अलावा, सटीक पदों और मोदर्ज न्यूरॉन्स की rphologies अज्ञात क्योंकि रिकॉर्डिंग कोशिकी है. इन प्रभावों के लिए समायोजित करने के लिए, हम आम तौर पर प्रत्येक तैयारी में 8 से 18 तंत्रिका इकाइयों के साथ 8 से 16 की तैयारी के साथ GCMR प्रयोगों, चलाते हैं. चित्रण के प्रयोजनों के लिए, तथापि, हम केवल एक तैयारी (8 इकाइयों) से डेटा का उपयोग करेगा.

प्रयोगों से GCMR, हमने पाया है कि इकाइयों को आश्चर्यजनक रूप से उनके वाष्पशील करने के लिए जवाब में चयनात्मक है, के रूप में चित्रा 3A में चित्रित कर रहे हैं. कम ट्रेस (काला) आयन chromatogram, जहां प्रत्येक चोटी एक दिया अस्थिर है कि समय पर डिटेक्टर पर पहुंचने के लिए मेल खाती है अर्थ. ऊपरी ट्रेस (नीला) फायरिंग एक इकाई की दर प्रतिक्रियाओं से पता चलता है. यूनिट प्रतिक्रियाएं एक 100 मिसे अंतराल में उत्पादित spikes की संख्या binning द्वारा गणना की गई है, और है कि समय सीमा से विभाजित करने के लिए दर का उत्पादन. उदाहरण में, तंत्रिका इकाई D-लाइमोनीन जवाब में चयनात्मक है. ध्यान दें कि इस इकाई में, सहज firinछ दर अभी भी चर और यादृच्छिक उतार - चढ़ाव के अधीन किया जा सकता है. बहरहाल, D-लाइमोनीन प्रतिक्रियाओं का 95% विश्वास अंतराल के ऊपर अच्छी तरह से किया गया है, के रूप में समय के माध्यम से फायरिंग दर प्रतिक्रियाओं में विचरण से गणना की.

इकाइयों बिल्कुल नहीं, तथापि, जीसी से eluting वाष्पशील प्रतिक्रिया व्यक्त की. वास्तव में, औसत पर प्रत्येक पहनावा में दर्ज की गई इकाइयों के लगभग 50% (3B चित्रा) अनुत्तरदायी थे. यह पुष्प headspace कि जीसी से eluting रहे हैं में अस्थिर यौगिकों की विविधता को देखते हुए आश्चर्य की बात है. हालांकि, एक जोड़ा में गैर जिम्मेदार इकाइयों के अनुपात आश्चर्यजनक तैयारी, के रूप में पिछले 13,14 अध्ययन में पाया के बीच लगातार है.

एकल इकाइयों की प्रतिक्रिया के अलावा, GCMR प्रणाली भी जीसी से eluting odorants को जनसंख्या स्तर प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. यहां दिखाए गए उदाहरण में, वहाँ कई odorants का एक समूह के लिए मजबूत कलाकारों की टुकड़ी चयनात्मकता ( पार बीटा ocimene, क्रमशः) odorants मजबूत प्रतिक्रियाओं का उत्पादन किया है, के रूप में कलाकारों की टुकड़ी में प्रत्येक इकाई के सामान्यीकृत गोलीबारी दर (रंग पैमाने) द्वारा प्रतिनिधित्व.

चित्रा 1
चित्रा 1. Headspace sorption और GCMR प्रणाली के योजनाबद्ध आरेख. (ए) योजनाबद्ध में, एक फूल एक Teflon बैग के भीतर संलग्न है, और एक वैक्यूम पंप का उपयोग, बैग से एक अस्थिर जाल (Porapak क्यू) के माध्यम से चूसा हवा के लिए ध्यान केंद्रित वाष्पशील उत्सर्जित. हवा फ़िल्टर और संलग्न फूल को लौट (बी) पुष्प headspace निकालने नमूना है इंजेक्षन.जीसी में एड और स्तंभ से प्रवाह विभाजित है प्रवाह के इस तरह है कि आधे या तो जीसी लौ ionization डिटेक्टर में प्रवेश करती है, और प्रवाह के अन्य आधा एक गर्म हस्तांतरण लाइन के द्वारा किया जाता है और मधुमक्खी एंटीना पर एक साथ आता है. अल तंत्रिका कलाकारों की टुकड़ी से ऐक्शन पोटेंशिअल जीसी के माध्यम से गंध प्रसव के 20 मिनट के दौरान लगातार extracellularly दर्ज की गई. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2 इकाइयों की छंटनी. मधुमक्खी अल में मल्टी चैनल रिकॉर्डिंग सरणी (एमआर) का उपयोग कर दर्ज की गई. दो shanks जैसे है कि सरणी एएल की एक बड़ी मात्रा में शामिल हैं स्थान दिया गया है. (ए) तरंग विशेषता (जैसे amp litude, घाटी) प्रत्येक tetrode रिकॉर्डिंग में "कील" के तीन आयामी अंतरिक्ष में प्लॉट किया जा सकता है. यहां दिखाए गए उदाहरण में, 3 4 रिकॉर्डिंग चैनलों के प्रत्येक कील की ऊंचाई 3-D में साजिश रची है. क्योंकि प्रत्येक इकाई अपने स्वयं के कील आकार होगा, एक भी इकाई से spikes साथ क्लस्टर, जिससे इकाइयों की पहचान की जा करने के लिए और एक दूसरे से हल की अनुमति होगी. और तरंग (सी) प्रत्येक जूते के तल्ले का मध्य भाग पर चार चैनल glomeruli और neuropil प्रसंस्करण के भीतर व्यापक क्षेत्रों में से एक रिकॉर्डिंग प्रदान के आकार पोजिशनिंग, के आधार पर छाँटे गए इकाइयों फायरिंग प्रतिक्रियाओं में स्पष्ट मतभेद (रेखापुंज साजिश B) से पता चला. तंत्रिका गतिविधि चार चैनलों में से प्रत्येक पर दर्ज किया गया था, 3 आयामी अंतरिक्ष में साजिश रची (के रूप में दिखाया गया है), और तरंग विशेषताओं के अनुसार क्रमबद्ध. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

तरीके "> चित्रा 3
चित्रा 3. (ए) एम. के से eluting यौगिकों के लिए इकाई प्रतिक्रियाओं की दर histograms निशानेबाजी lewisii headspace निकालने (3 μl इंजेक्शन) (नीचे का पता लगाने, काले). कुछ odorants (जैसे लाइमोनीन, लाल तीर) इकाइयों में महत्वपूर्ण प्रतिक्रियाओं (बी) कि एमआर से प्रत्येक जीसी से eluted odorant दर्ज किए गए सभी इकाइयों की प्रतिक्रिया पैदा. अलग - अलग इकाइयों के सामान्यीकृत फायरिंग दर प्रतिक्रियाओं के अनुसार सतह साजिश है रंग कोडित. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

कीट घ्राण की मध्यस्थता व्यवहार प्रजनन, मेजबान साइट चयन, और उचित भोजन संसाधनों की पहचान सहित कई विभिन्न प्रक्रियाओं, ड्राइव. इन प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए स्रोत है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए है कि व्यवहार में मध्यस्थता कर रहे हैं उन यौगिकों की पहचान करने की क्षमता से उत्सर्जित वाष्पशील की पहचान करने की क्षमता की आवश्यकता है. मामलों उलझी है कि odors व्यक्तिगत यौगिकों कि एक साथ एक अनोखी खुशबू है कि व्यक्ति 6,7,13,19,20 घटक से अलग माना जाता है बनाने के सैकड़ों के दसियों के शामिल हैं. रिसर्च, शुरू में सेक्स pheromone प्रणाली 12 में आयोजित किया, और अधिक भोजन और oviposition से संबंधित 13,20 odors में हाल ही में पता चला है कि मिश्रण के व्यवहार प्रभाव मिश्रण में कुछ, कुंजी वाष्पशील के एक समारोह के रूप में रहता है, और कि मिश्रण काफी व्यक्तिगत घटक से अधिक व्यवहार प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना. उन प्रमुख की पहचानघटक इस प्रकार आधुनिक दिन रासायनिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से घ्राण तंत्रिका जीव विज्ञान पारिस्थितिकी में एक महत्वपूर्ण घटक है.

तकनीक की एक किस्म में पिछले पचास वर्षों में bioactive यौगिकों की पहचान है कि कीड़ों में व्यवहार ड्राइव के लिए पैदा हुई है. कीट एंटीना द्वारा वाष्पशील का पता लगाने के लिए प्राथमिक तकनीक गैस क्रोमैटोग्राफी electroantennography (जीसी - ईएजी) है. ईएजी मूल रूप से 21 Schneider, जो आम तौर पर टिप और उत्तेजना के दौरान एक कीट एंटीना के आधार के बीच कई घ्राण न्यूरॉन्स की बिजली depolarisations की वजह से माना जाता है छोटे वोल्टेज उतार चढ़ाव दर्ज द्वारा विकसित किया गया था. ईएजी बाद headspace वाष्पशील कि antennal प्रतिक्रियाओं 12,22 प्रकाश में लाना की सटीक पहचान के लिए जीसी के साथ एकीकृत किया गया. इसके अलावा, कीट एंटीना से व्यक्तिगत रिसेप्टर न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग के बाद 11,23 विकसित किया गया था और जीसी साथ मिलकर एकल sensillum रिकॉर्डिंग, या जीसी - SSR. एकlthough जीसी - SSR जीसी - ईएजी से अधिक समय लेने वाला और मुश्किल है, रिकॉर्डिंग जीसी - effluents के जवाब में कार्रवाई क्षमता के माध्यम से अलग - अलग सेल प्रतिक्रिया पर जानकारी प्रदान करते हैं, और उन रिसेप्टर्स कि विशेष यौगिकों कि विशेष कर रहे हैं की पहचान की अनुमति देता है 24 जीसी - ईएजी द्वारा याद किया जा सकता है.

जीसी - ईएजी और जीसी - SSR तकनीक उन वाष्पशील कि परिधि पर प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना की पहचान प्रदान करते हैं, और इस प्रकार odorant स्वागत में शामिल हैं. अधिक हाल ही में तकनीक दोनों स्तनधारियों और कीड़ों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रतिक्रियाओं की जांच शुरू कर दिया है, और इस प्रकार odorant धारणा में शामिल कर रहे हैं. इन तकनीकों दो व्यापक श्रेणियों के अंतर्गत आते हैं: इमेजिंग तरीकों 25 करार दिया (गैस क्रोमैटोग्राफी इमेजिंग) जीसी - मैं और प्रत्यक्ष electrophysiological तरीकों (GCMR उदाहरण के लिए). जीसी - मैं और GCMR संवेदी न्यूरॉन्स के प्रक्षेपण, या उत्पादन करने के लिए अभिसरण में न्यूरॉन्स की वजह से कई लाभ प्रदानअल, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पता है कि इन तरीकों कैसे odorants कीट मस्तिष्क में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं के दृढ़ संकल्प की अनुमति. इसके अलावा, इसी तरह के तरीकों को अब 25 स्तनधारी मस्तिष्क में इस्तेमाल किया जा रहा है.

इन फायदों के बावजूद, GCMR और जीसी मैं कमियां के रूप में अच्छी तरह से प्रस्तुत करते हैं. डेटा विश्लेषण समय लेने वाली हो सकते हैं, और GCMR के मामले में दर्ज तंत्रिका इकाइयों की glomerular अनुमानों कोशिकी रिकॉर्डिंग करने के लिए किया जा रहा है कारण अज्ञात हैं. इसके अलावा, कीट AL कई प्रक्षेपण (पीएन) न्यूरॉन्स और स्थानीय (LNS) interneurons इस प्रकार दर्ज मुश्किल इकाइयों की पहचान बनाने सहित विभिन्न neuronal प्रकार के द्वारा innervated है. हालांकि, कीट में एम., Sexta का प्रदर्शन किया है, हाल ही में काम कि पीएन और LNS न्यूरॉन्स की spiking व्यवहार से पहचाना जा सकता है, जिससे उनके सहज गतिविधि 26 से इन न्यूरॉन प्रकार की पहचान के लिए अनुमति देता है. बहरहाल, GCMR और जीसी मैं odorants की पहचान की अनुमति देता है कि activatई विशेष रिसेप्टर न्यूरॉन्स कि मजबूत ईएजी प्रतिक्रियाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह का निर्धारण करने प्रकाश में लाना नहीं सकता कैसे मस्तिष्क प्रक्रिया में न्यूरॉन्स वाष्पशील की आबादी. इन विभिन्न तरीकों की तुलना अध्ययन आयोजित किया गया है अभी तक नहीं गया है, हालांकि हमारे प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि GCMR से अधिक उपयुक्त हो सकता है जीसी - EAG उन यौगिकों कि bioactive लेकिन निकालने (Riffell अप्रकाशित परिणाम) में स्तर का पता लगाने में कर रहे हैं के लिए. भविष्य के काम के विभिन्न तरीकों के बीच विश्लेषण समय के साथ bioactive odorants का पता लगाने की संवेदनशीलता में व्यापार बंद की जांच कर सकते हैं.

हालांकि हम यहाँ परख तरीकों हम बी के लिए उपयोग का विवरण पर ध्यान केंद्रित किया है impatiens मधुमक्खियों और एम. से खुशबू lewisii, निकालने और कीट प्रजातियों अगर कुछ संशोधनों के बना रहे हैं बदला जा सकता है. कीट प्रजातियों अलग विंदुक (10 से 200 μl) के सुझावों उनके आकार के आधार पर में रखा जा सकता है. कीट Manduca की तरह बड़ा प्रजातियों,Sexta, 6 मिलीग्राम नमूना शीशियों में रखा जा सकता है. एक ऐसे तरीके से, तैयारी जीवित जिससे स्थिर रिकॉर्डिंग की अवधि में कई घंटे की अनुमति रखा है.

साथ में ले ली, यौगिकों के अलगाव के लिए विश्लेषणात्मक तरीकों के साथ bioactive यौगिकों की पहचान के लिए कीट मस्तिष्क वर्तमान शक्तिशाली उपकरण में electrophysiological रिकॉर्डिंग के साथ और जब व्यवहार प्रयोगों के साथ मिलकर में प्रयोग किया जाता है, को पेश करने के लिए एक साधन है जिसके द्वारा भोजन से संबंधित के लिए महत्वपूर्ण वाष्पशील का निर्धारण कर सकते हैं 13 कीड़े में व्यवहार, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 2 मेजबान साइट में शामिल उन लोगों के लिए, और रक्त मेजबान से संबंधित 27 व्यवहार है कि कृषि कीट और रोग वैक्टर के लिए महत्वपूर्ण हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम NSF अनुदान IOS 1121692, और वॉशिंगटन रिसर्च फाउंडेशन के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Porapak Type Q 80-100 mesh Waters WAT027060
Reynolds Oven Bags Reynolds
GC Agilent 7820A
GC column J&W Scientific, Folsom, CA, USA DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
Analytical helium carrier gas Praxair HE K 1 cc/min
16-channel silicon electrode Neuronexus Technologies a4x4-3mm50-177
Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 For making custom tetrodes and stereotrodes
Pre-amplifier Tucker-Davis System PZ-2
Amplifier Tucker-Davis System RZ-2
Data acquisition system - OpenEx suite Tucker-Davis System
Online spike-sorting software - SpikePac Tucker-Davis System
Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB toolbox

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References

  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
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