تحديد مواد متطايرة الشم باستخدام الغاز اللوني موضوع وحدة تسجيلات (GCMR) في الفص Antennal الحشرات

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

العظة حاسة الشم التوسط السلوكيات المختلفة في الحشرات، وغالبا ما تكون معقدة هي مزيج يتألف من عشرات إلى مئات من مركبات طيارة. باستخدام كروماتوغرافيا الغاز مع تسجيل متعدد القنوات في الفص antennal الحشرات، ونحن تصف طريقة لتحديد المركبات النشطة بيولوجيا.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Byers, K. J., Sanders, E., Riffell, J. A. Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (72), e4381, doi:10.3791/4381 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

جميع الكائنات الحية تعيش في عالم مليء من المحفزات الحسية التي تحدد استجابتها السلوكية والفسيولوجية لبيئتهم. الشم أهمية خاصة في الحشرات، والتي تستخدم نظمها حاسة الشم للرد على، وتميز بين، المحفزات الرائحة المعقدة. هذه الروائح تثير السلوكيات التي تتوسط عمليات مثل الاستنساخ واختيار السكن 1-3. بالإضافة إلى ذلك، والاستشعار الكيميائية السلوكيات يتوسط الحشرات التي تكون مهمة للغاية من أجل الزراعة وصحة الإنسان، بما في ذلك التلقيح 4-6 و الحيوانات العاشبة من المحاصيل الغذائية وانتقال الأمراض 8،9. تحديد إشارات حاسة الشم ودورها في سلوك الحشرات وبالتالي من المهم لفهم كل العمليات الإيكولوجية والموارد الغذائية البشرية ورفاهها.

حتى الآن، وقد تم تحديد المواد المتطايرة التي تدفع سلوك الحشرات صعبة وشاقة في كثير من الأحيان. وتشمل التقنيات الحاليةتسجيل electroantennogram الغاز اللوني يقترن (GC-EAG)، والغاز اللوني جانب واحد التسجيلات sensillum (GC-SSR) 10-12. أثبتت هذه التقنيات لتكون حيوية في تحديد المركبات النشطة بيولوجيا. قمنا بتطوير الطريقة التي يستخدم الغاز اللوني بالإضافة إلى متعدد القنوات التسجيلات الكهربية (وهو ما يسمى 'GCMR') من الخلايا العصبية في الفص antennal (AL؛ مركز الحشرة حاسة الشم الأولية) 13،14. هذه التقنية للدولة من بين الفن يسمح لنا لبحث كيفية تمثيل المعلومات في الدماغ رائحة الحشرات. وعلاوة على ذلك، وذلك لأن الاستجابات العصبية للروائح على هذا المستوى من التجهيز حاسة الشم هي حساسة للغاية نظرا لدرجة التقارب بين الخلايا العصبية مستقبلات الهوائي في الخلايا العصبية AL، سوف تسمح التسجيلات AL الكشف عن المكونات النشطة من الروائح الطبيعية بكفاءة ومع حساسية عالية. نحن هنا وصف GCMR وتعطي مثالا على استخدامها.

العديد من الخطوات العامة هي involفيد في الكشف عن المواد المتطايرة والاستجابة النشطة بيولوجيا الحشرات. المتطايرة تحتاج أولا إلى أن تم جمعها من مصادر ذات الاهتمام (في هذا المثال نستخدم الزهور من جنس Mimulus (Phyrmaceae)) وتتميز حسب الحاجة باستخدام معيار GC-MS تقنيات 14-16. وتعد الحشرات لدراسة باستخدام الحد الأدنى من تشريح، وبعد ذلك يتم إدخال إلكترود تسجيل في الفص antennal وتسجيل متعدد القنوات العصبية تبدأ. بعد معالجة البيانات العصبية التي تكشف ثم odorants خاصة تسبب ردود العصبية كبيرة من الجهاز العصبي للحشرات.

على الرغم من أن المثال هنا هو نقدم محددة لدراسات التلقيح، يمكن توسيع GCMR لطائفة واسعة من الكائنات الحية ومصادر الدراسة المتقلبة. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذه الطريقة في تحديد odorants جذب الحشرات أو صد النواقل وآفات المحاصيل. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم لGCMR تحديد جاذبة للحشرات النافعة، مثل بوllinators. ويمكن توسيع هذه التقنية في مواضيع غير الحشرات أيضا.

Protocol

1. متقلبة Follection

  1. في هذا المثال، فإننا نستخدم عينات المتطايرة من M. lewisii الزهور - زهرة برية في جبال الألب الأم إلى ولاية كاليفورنيا. يتم جمع المواد المتطايرة باستخدام أساليب الامتصاص الحيوي وفقا لوآخرون Riffell 14. لفترة وجيزة، وهذه الطريقة تستخدم لمحاصرة نظام حلقة مغلقة حيث يتم تضمين الزهور في كيس تفلون. باستخدام مضخة فراغ خاملة، وامتص الهواء حول الزهور من خلال "فخ" تتألف من ماصة باستور مليئة Porapak Q المصفوفة. يتم تصفية الهواء من مضخة العودة من الفحم المنشط. بعد فترة زمنية محددة، في ح لدينا 24 حالة، ومزال سؤال Porapak مصفوفة مع المذيبات غير القطبية الهكسين عادة، لجمع استخراج المركزة. ثم يتم تخزين واستخراج في -80 درجة مئوية حتى التحليل. إذا لزم الأمر، يمكن أن تتركز عينات قبل التحليل في إطار تيار من غاز النيتروجين. ما لم يتم بالفعل العينة جيدا من تميز، تشغيل قسامة من ذلك من خلالالغاز اللوني مطياف الكتلة (GC-MS) لتحديد المكونات المتطايرة قبل استخدام العينة.

2. إعداد الكهربية

  1. قطع ما يقرب من 1 سم من نهاية تلميح ماصة ميكرولتر 1000. وضع النحل تلعثم (impatiens Bombus) في قاعدة غيض ماصة، ودفع برفق نحو الطرف الآخر من طرف حتى يتعرض فقط الرأس.
  2. تذوب الشمع الأسنان وقولبته حول الرأس المكشوفة، والتأكد من أن تلتزم الشمع على أعين الأمن ومجمع لجعل رأس النحلة قادرة على الحركة تماما. تأكد من عدم حصول أي الشمع على الهوائي للنحل.
  3. مرة واحدة في الرأس آمنة، وجعل مربع، نافذة مثل شق في كبسولة الرأس باستخدام شفرة الحلاقة أو ثقيل الحجم المناسب مشرط لقطع بشرة. باستخدام شفرة الكسارة، بدء من الجانب الظهري من الكبسولة الرأس، على الفور وراء هوائي واحد وبالقرب من مجمع للعيون. قطعخط مستقيم، من واحد إلى مجمع العين بالعين مجمع المقابل. بعد قطع خط مستقيم إلى مجمع العين المعاكس، البدء بتقديم شق ظهريا حتى منحنيات كبسولة الرأس وينتهي بالقرب من الصدر. في هذه المرحلة، تبدأ في خفض نحو الطرف الآخر من الكبسولة الرأس. وأخيرا، مرة واحدة وقد تم قطع خط إلى الطرف الآخر، وقطع خط العودة إلى نقطة الانطلاق للشق الأول. من المهم إزالة إهاب هذا هو المتاخمة للهوائي، حيث سيؤدي ذلك إلى إعاقة إدخال القطب.
  4. مرة واحدة يتم قطع بشرة، استخدام زوج من ملقط لإزالة إهاب النحل، التي ينبغي أن تعرض الدماغ ثم النحل والأهم من ذلك الفص antennal. تبدأ على الفور مع superfusing الدماغ المالحة الحشرات، بحيث لا يصبح الدماغ المجفف. بعد تعرض الدماغ، استخدم بعناية زوج من ملقط دقيق جدا لإزالة غمد حول العصب مباشرة فوق فصوص antennal. يكون حريصا جدا على ألاثقب الدماغ النحل مع ملقط.

3. اللوني للغاز مع تسجيل متعدد القنوات

  1. النحلة "إعداد" - ثابتة في أنبوب مع دماغها يتعرض - على استعداد الآن لتسجيل الكهربية. وضع النحل في المشبك، مثبتة في قاعدة المغناطيسي الموجود على جدول الهواء.
  2. ترتيب حقيبة IV، تحكم في التدفق، وأنابيب (مليئة المالحة الحشرات) بحيث المالحة superfuses باستمرار الدماغ.
  3. باستخدام مياداة مجهرية، القطب insertareference، مصنوعة من الأسلاك التنغستن، في عين النحلة.
  4. باستخدام مياداة مجهرية منفصلة، ​​تضاف القناة متعدد القطب، مثل سلك ملفوف tetrode، أو السيليكون متعدد القنوات الكهربائي (Neuronexus تكنولوجيز)، في فصوص antennal للنحل. ويرتبط هذا القطب إلى مكبر للصوت قبل مثل نظام TDT في سلسلة S-3 Z إلى المعالج Z-bioamp حافلة من نظام TDT. الإخراج من الغاز CHROيمكن كشف matogram، عبر الكابل BNC محمية يكون ربطه مع نظام مكبر للصوت واقتناء مثل هذه البيانات التي يتم مزامنتها كل من إشارة العصبية وGC.
  5. الانتظار حوالي 30-60 دقيقة للتسجيلات العصبية لتحقيق الاستقرار. وبمجرد أن النشاط العفوي وشكل الموجي وحدات تسجيل في القنوات أصبحت متسقة، استخدم حقنة لتحفيز رائحة النحل ومراقبة الاستجابة للقنوات التسجيل للرائحة.
  6. تسجيل المسامير خارج الخلية من الخلايا العصبية التي كتبها لصناعة السيارات في العتبة القنوات التسجيل عن طريق 3،5 حتي 5 سيجما للإشارة على القنوات الفردية تسجيل. قد تكون هناك حاجة لدليل العتبة بعض القنوات لتجنب التلوث من الضوضاء الكهربائية. فإن إمكانات العمل من الخلايا العصبية تظهر ارتفاع الجهد في القناة التسجيل. عندما الجهد القناة يتجاوز عتبة، ونظام المخازن المؤقتة، وتقي جزء من الثانية قبل وبعد عبور العتبة، تاكين بذلكGA المفاجئة شوت للالموجي، أو ارتفاع.
  7. على الفور بجانب الجدول الهواء هو GC. قبل حقن خلاصة الزهور في GC، تأكد من أن طريقة لتعلية درجة حرارة التشغيل GC هو الصحيح. في مثالنا، ونحن نستخدم طريقة درجة الحرارة ابتداء من الساعة 50 درجة مئوية لمدة 4 دقائق تليها زيادة في درجة الحرارة بمعدل 10 درجة مئوية / دقيقة. إلى 220 ° C، في الوقت الذي نحن نحمل GC لحد أدنى 6 إضافية. نستخدم DB-5 العمود GC (J & W العلمية، فولسوم، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)، مع الهليوم والغاز الناقل. مدخل هو إنعدام التقسيم، مع درجة حرارة 200 درجة لتعيين C. تم تعيين كاشف التأين درجة حرارة اللهب إلى 230 ° C.
  8. حقن العينة مستخرج من فراغ الرأس الموجود الأزهار في منفذ الحقن الساخنة في GC للافراج عن المواد المتطايرة كثف في العمود GC. يتم تقسيم النفايات السائلة من العمود 1:1 بين الشعلة كاشف التأين (FID) والهوائي النحل باستخدام الزجاج "Y" موصل (J & W العلمية). تبدأ تفصيلأوردينج من القطب كما كنت حقن عينة في GC.
  9. بعد انتهاء المدى GC، والسماح للبقية إعداد لمدة 5 إلى 15 دقيقة. ثم حقن عينة أخرى إما في GC أو تحفيز إعداد باستخدام مركبات طيارة واحد أو خليط من المركبات. في هذا الأسلوب الأخير لتحفيز إعداد، يتم تحويل البقول من الهواء من تيار الهواء المستمر من خلال حقنة زجاجية تحتوي على قطعة من ورق الترشيح الذي يكون قد تم فيه إيداع المركبات. كان الحافز رائحة نابض عن طريق صمام الملف اللولبي تنشيط تسيطر عليها البرنامج.
  10. إذا توقف فجأة وحدة النشاط أو التغييرات، والتحقق من بالتنقيط المالحة، والسماح للبقية إعداد لمدة 15 دقيقة. إذا كان النشاط العفوي لا يستعيد مستواه السابق وينبغي بعد ذلك يتم تجاهل إعداد واستخدام النحل أخرى إذا كانت متوفرة.
  11. بعد التجربة، إصلاح الدماغ مع الفورمالين 5٪ لمدة 20 دقيقة مع التحقيق لا يزال في الأنسجة. المقبل، استئصال الدماغووضعه في غلوتارالدهيد 2٪ لمدة 4 ساعة، والقيام بعد ذلك الجفاف الإيثانول متدرج سلسلة ومسح الدماغ مع ساليسيلات الميثيل. بناء على نتائج المباريات والمقاصة من الأنسجة، والمواقع في AL حيث الأقطاب ثقب الأنسجة يجب أن يكون مميزا بوضوح من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.

4. تحليل البيانات

  1. تحليل البيانات التي تم جمعها بعد التجربة لفصل وتحديد وحدات مسجل العصبية. استخدام برامج الحاسب الآلي نموذجي (فارز متصل، MClust، وSClust) إلى الطول الموجي منفصلة، ​​أو "مسامير"، استنادا إلى ارتفاع الأشكال، مثل وادي الذروة أو السعة، ذروة نصف العرض، وما إلى ذلك، أو تدابير خفض (المكونات الرئيسية) 17 ، 18 (الشكل 2). فقط استخدام تلك مجموعات من المسامير التي تفصل في حيز ثلاثي الأبعاد (PC1 PC3-) وتختلف إحصائيا عن بعضها البعض (ANOVA متعدد المتغيرات، P <0.05) (الشكل 2) لمزيد من التحليل. يرجى الرجوع إلىالاقتباس # S 17-19 لوصف كامل للتسجيل ومنهجيات ارتفاع tetrode-الفرز.
  2. الوقت الطوابع المسامير في كل مجموعة، وتصدير هذه البيانات للتحليل باستخدام MATLAB أو Neuroexplorer (NEX تكنولوجيز، وينستون سالم، NC) لإنشاء المخططات النقطية والردود معدل اطلاق النار (أرقام 2، 3A).
  3. تحديد أوقات الاحتفاظ المتطايرة باستخدام البيانات المسجلة في وقت واحد GC. استغلال الأوقات الإبقاء على المواد المتطايرة، والتي تحددها ذروة الذروة من كروماتوغرام، لدراسة ردود تلك النقاط في وحدة الزمن.
  4. لدراسة ردود الفردية من خلال وحدة على المدى GC بن عدد المسامير في فترات ميللي ثانية 100 و دراسة الوقت أثناء إطلاق استجابات معدل بالإشارة إلى الوقت الاحتفاظ يبلغ حجمه المتطايرة. وbinning من المسامير في فترات ميللي ثانية 100 يوفر ما يكفي من التفاصيل، أو إشارة، حول المسار الزمني للاستجابة الخلايا العصبية ليبلغ حجمه الرائحة من GC.
  5. لإكساءالألغام الردود عدد السكان يبلغ حجمه إلى المتطايرة المختلفة، ودمج الردود معدل إطلاق الوحدات الفردية أكثر من النافذة 3 ثوانى أخذ العينات، 1.5 ثانية من قبل، و 1.5 ثوان بعد، في الوقت الإبقاء على المتطايرة (الشكل 3). هذه الفترة الزمنية هي الحال في مدة ليبلغ حجمه المضطربة من GC. نعرض اطلاق ردود معدل وحدات من الترميز اللوني، منها (الأحمر هو معدل اطلاق النار عالية الاستجابة؛ الأزرق هو استجابة منخفضة) (وترتيبها ومصفوفة النشاط مع كل صف يمثل استجابة لفرقة النفايات السائلة GC (أعمدة) الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في مقايسة GCMR باستخدام M. lewisii رائحة الأزهار، ونحن حقن 3 ميكرولتر من استخراج في GC. العدد الإجمالي للالمتطايرة يبلغ حجمه من خلال GC هو عادة 60-70 المتطايرة. رائحة M. وتتكون في الغالب من lewisii monoterpenoids، بما في ذلك ميرسين-β (لا حلقية) وبينين α-، مع ما تبقى من رائحة يتألف من ستة الكربون المتطايرة، مثل HEXANOL-2، والتي تشكل sesquiterpenoids <1٪ من فراغ الرأس الموجود.

GCMR يستفيد من حساسية الخلايا العصبية الفص antennal فضلا عن تجهيز الخلايا العصبية من المواد المتطايرة المهمة بيولوجيا. ومع ذلك، متعدد القنوات تسجيلات من هذا النوع، في الواقع، أخذ عينة عشوائية من الخلايا العصبية في الفص antennal. وذلك لأن تغييرات طفيفة في الموقف من موقف التحقيق بين مختلف الاستعدادات يمكن أن يسبب مجموعة لأخذ عينات الخلايا العصبية تسجيل مختلفة. وعلاوة على ذلك، فإن المواقف بالضبط وموrphologies من الخلايا العصبية المسجلة غير معروفة لأن التسجيل هو خارج الخلية. لاستيعاب لهذه الآثار، ونحن عادة تشغيل التجارب GCMR مع الاستعدادات 8 حتي 16، وامتناع 8 الى 18 وحدات العصبية في كل إعداد. لأغراض التوضيح، ومع ذلك، سوف نستخدم البيانات من إعداد واحد فقط (8 وحدات).

من خلال تجارب GCMR، وجدنا أن وحدات من المستغرب انتقائية في استجابتها لالمتطايرة، كما هو مبين في الشكل 3A. انخفاض التتبع (باللون الأسود) يدل على كروماتوغرام أيون، حيث كل الذروة يتوافق مع تقلب بالنظر إلى أن وصوله إلى كاشف مع مرور الوقت. التتبع العليا (الأزرق) يبين معدل الردود اطلاق وحدة. وحسبت الردود الوحدة binning عدد المسامير التي تنتج في فاصل زمني ميللي ثانية 100، وقسمة هذا الإطار الزمني لإنتاج قيم. في المثال، وحدة العصبية انتقائية ردا على الليمونين D-. نلاحظ أنه، في هذه الوحدة، وعفوية firinيمكن أن يكون لا يزال الجميع التقييم متغير ويخضع لتقلبات عشوائية. ومع ذلك، كانت الردود على الليمونين D-أعلى بكثير من فاصل الثقة 95٪، وتحسب على أساس الفرق في الردود معدل اطلاق النار عبر الزمن.

ليس كل وحدة، ومع ذلك، ردت على المتطايرة يبلغ حجمه من GC. في الواقع، في المتوسط ​​ما يقرب من 50٪ من الوحدات المسجلة في كل فرقة لا تستجيب (الشكل 3B). هذا يثير الدهشة نظرا لتنوع مركبات طيارة في فراغ الرأس الموجود الأزهار التي يبلغ حجمه من GC. ومع ذلك، فإن نسبة غير استجابة وحدة في مجموعة متكاملة متناسقة من المستغرب بين الاستعدادات، كما هو موجود في الدراسات السابقة 13،14.

ما وراء ردود حدات واحد، ونظام GCMR تمكن أيضا من تحليل السكان على مستوى الردود على odorants يبلغ حجمه من GC. في المثال الموضح هنا، هناك فرقة قوية الانتقائية لمجموعة من odorants عدة ( وعبر β ocimene، على التوالي) استجابات قوية في الفرقة، ممثلا في معدل إطلاق تطبيع كل وحدة في فرقة (مقياس اللون).

الشكل 1
الشكل 1. الرسم التخطيطي الامتصاص فراغ الرأس ونظام GCMR. (A) في التخطيطي، ترد زهرة داخل كيس تفلون، وباستخدام مضخة فراغ، وامتص الهواء من الكيس من خلال فخ المتطايرة (Porapak Q) لتركيز المتطايرة المنبعثة. يتم تصفية الهواء، وعاد إلى زهرة المغلقة. (B) وعينة من استخراج فراغ الرأس الموجود الأزهار هو حقنيتم تقسيم إد في GC والنفايات السائلة من العمود مثل أن نصف تدفق يدخل إما في كشف GC في التأين لهب، ويتم النصف الآخر من النفايات السائلة بواسطة خط النقل المسخن ويصل في وقت واحد في الهوائي النحلة. وتسجل باستمرار إمكانات العمل من فرقة AL العصبية خارج الخلية خلال 20 دقيقة من الولادة عن طريق رائحة GC. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2
سجلت الرقم 2. وحدات الفرز باستخدام مجموعة تسجيل متعدد القنوات (MR) في AL النحلة. متباعدة في السيقان اثنين من الممثلين أن مجموعة تضم كمية كبيرة من AL. (A) والسمة الموجي (مثل أمبير يمكن رسم litude، وادي) من كل "زيادة" في تسجيل tetrode في حيز ثلاثي الأبعاد. في المثال الموضح هنا، يتم رسم ذروة كل ارتفاع في 3 من 4 في تسجيل قنوات D-3. لأن كل وحدة سيكون شكله ارتفاع الخاصة، والمسامير من وحدة الكتلة نظرا معا، مما يتيح الكشف عن هويته وحدات وفرزها عن بعضها البعض. وأظهرت وحدات مصنفة اختلافات واضحة في ردود اطلاق (B؛ النقطية مؤامرة) والموجي الشكل (C) لتحديد المواقع من القنوات أربعة على كل ساق تقديم تسجيل مناطق واسعة داخل وتجهيز كبيبات neuropil. تآمر تم تسجيل النشاط العصبي على كل من القنوات الأربعة، في 3 الأبعاد الفضاء (كما هو موضح في A)، وفرزها وفقا لخصائص الموجي. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

طرق "> الشكل 3
الشكل 3. (A) إطلاق المدرج الاحصائي معدل الردود إلى وحدة المركبات يبلغ حجمه من M. lewisii headspace سعة استخراج (3 حقن ميكرولتر) (التتبع أسفل، أسود). استجابات كبيرة في وحدات (B) الاستجابة لجميع الوحدات التي تم تسجيلها من MR الرائحة إلى كل من مزال GC؛ odorants معينة (السهم الأحمر مثل الليمونين D-). والمؤامرة سطح مرمزة وفقا لردود إطلاق معدل تطبيع الوحدات الفردية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الحشرات حاسة الشم بوساطة السلوكيات دفع العديد من الإجراءات المختلفة، بما في ذلك الاستنساخ، واختيار المضيف في الموقع، وتحديد الموارد الغذائية المناسبة. دراسة هذه العمليات يحتاج الى القدرة على تحديد المواد المتطايرة المنبعثة من المصدر، وكذلك القدرة على تحديد تلك المركبات التي يتم التوسط في السلوكيات. تعقيد الأمور هو أن تتكون الروائح من عشرات إلى مئات من المركبات الفردية التي تخلق رائحة فريدة من نوعها معا التي ينظر إليها بشكل مختلف عن المكونات الفردية 6،7،13،19،20. وقد أظهرت الأبحاث التي أجريت في البداية في الجنس فرمون النظام 12، ومؤخرا في الغذاء ووضع البيض 13،20 المتصلة الروائح، أن فعالية السلوكية للخليط يقيم بوصفها وظيفة من المواد المتطايرة، وعدد قليل الرئيسية في الخليط، و أن خليط الحصول على ردود بشكل كبير أكبر من المكونات السلوكية الفردية. تحديد تلك المفتاحالمكونات وبالتالي عنصرا هاما في البيئة الكيميائية في العصر الحديث وكذلك بيولوجيا الأعصاب الشمية.

نشأت مجموعة متنوعة من التقنيات في السنوات الخمسين الماضية لتحديد المركبات النشطة بيولوجيا التي تدفع السلوك في الحشرات. هذه التقنية الأولية للكشف عن المواد المتطايرة من قبل هوائي الحشرة هو الغاز اللوني electroantennography (GC-EAG). وضعت أصلا من قبل EAG شنايدر 21 عاما، الذي سجلت تقلبات الجهد صغيرة يفترض عموما أن يكون سبب depolarisations الكهربائية من الخلايا العصبية الشمية كثيرة بين طرف وقاعدة من هوائي الحشرة خلال التحفيز. في وقت لاحق تم دمج EAG مع GC لتحديد دقيق للفراغ الرأس المتطايرة التي تثير ردود antennal 12،22. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير التسجيل في وقت لاحق من الخلايا العصبية مستقبلات الفردية من الهوائي والحشرات 11،23 جانب GC لتوفير واحد sensillum التسجيلات، أو GC-SSR. Although GC-SSR هو المزيد من الوقت كثيفة وصعبة من GC-EAG، التسجيلات تقديم معلومات عن استجابات الخلايا الفردية عن طريق إمكانات العمل ردا على GC-النفايات السائلة، ويسمح تحديد تلك المستقبلات التي هي متخصصة لمركبات خاصة أن يمكن تفويتها من قبل GC-EAG 24.

وGC-EAG وتقنيات GC-SSR نقدم تحديد تلك المواد المتطايرة التي تثير ردود على هامش، وبالتالي تشارك في استقبال الرائحة. وقد بدأت التقنيات الأكثر حداثة في دراسة استجابات الجهاز العصبي المركزي من كل من الثدييات والحشرات، وتشارك بالتالي في تصور الرائحة. هذه التقنيات تندرج تحت فئتين رئيسيتين: طرق التصوير ووصف 25 GC-I (الغاز اللوني التصوير) وطرق الكهربية مباشرة (على سبيل المثال GCMR). GC-I وتقدم العديد من المزايا GCMR بسبب تقارب الخلايا العصبية الحسية إلى الإسقاط، أو الإخراج، في الخلايا العصبيةAL، فضلا عن أن هذه الأساليب تسمح تحديد الكيفية التي يتم بها odorants في الدماغ الحشرات. وعلاوة على ذلك، يتم الآن أساليب مماثلة تستخدم في أدمغة الثدييات 25.

على الرغم من هذه المزايا، وGCMR I-GC نقدم السلبيات أيضا. يمكن تحليل البيانات وقتا طويلا، وفي حالة GCMR، توقعات الكبيبي من الوحدات العصبية المسجلة غير معروفة نظرا لكونها التسجيلات خارج الخلية. وعلاوة على ذلك، يتم معصب وAL الحشرات عدة أنواع من الخلايا العصبية المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية الإسقاط (السندات الإذنية) وinterneurons المحلية (LNS) مما يجعل تحديد الوحدات المسجلة صعبة. ومع ذلك، في العثة، M. سيكستا، أظهرت الأعمال الأخيرة التي يمكن تحديدها والسندات الإذنية LNS من سلوك الخلايا العصبية من ارتفاعه، مما يسمح لتحديد هذه الأنواع من الخلايا العصبية نشاطهم عفوية 26. ومع ذلك، وGCMR I-GC يسمح التعرف على odorants أن activatالخلايا العصبية مستقبلات ه المتخصصة التي قد لا الحصول على ردود EAG قوية، وكذلك تحديد كيفية السكان من الخلايا العصبية في الدماغ عملية المتطايرة. دراسة مقارنة هذه المنهجيات المختلفة لم تجر بعد، على الرغم من البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن الأولية GCMR قد تكون أكثر ملاءمة من GC-EAG لتلك المركبات الحيوية النشطة التي هي ولكن على مستويات التتبع في استخراج (النتائج Riffell غير منشورة). قد عمل في المستقبل دراسة المفاضلة في حساسية للكشف عن odorants النشطة بيولوجيا مع الوقت بين تحليل منهجيات مختلفة.

على الرغم من أن نركز هنا على تفاصيل الأساليب التي نستخدمها لفحص B. impatiens النحل ورائحة من M. lewisii، واستخراج ويمكن تغيير أنواع الحشرات المستخدمة إذا تم إجراء بعض التعديلات. يمكن وضعها في أنواع الحشرات ماصة نصائح مختلفة (10 إلى 200 ميكرولتر) تبعا حجمها. أكبر الأنواع، مثل العثة، ماندوكاسيكستا، يمكن وضع قارورة العينة إلى 6 مل. بطريقة، يتم الاحتفاظ إعداد التسجيلات على قيد الحياة مما يتيح مستقرة عدة ساعات في المدة.

أخذت معا، الطرق التحليلية لعزل المركبات جنبا إلى جنب مع التسجيلات الكهربية في الدماغ الحشرات الأدوات القوية الحالية لتحديد المركبات النشطة بيولوجيا، وعندما تستخدم جنبا إلى جنب مع التجارب السلوكية، قد يقدم وسيلة يمكن من خلالها تحديد المواد المتطايرة ذات الصلة مهمة للالغذاء السلوكيات في الحشرات 13، وكذلك المشاركين في الموقع المضيف والدم في استضافة السلوكيات ذات الصلة ال 27 التي هي مهمة لالآفات الزراعية وناقلات الأمراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل NSF منحة IOS 1121692، وجامعة مؤسسة البحوث واشنطن.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Porapak Type Q 80-100 mesh Waters WAT027060
Reynolds Oven Bags Reynolds
GC Agilent 7820A
GC column J&W Scientific, Folsom, CA, USA DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
Analytical helium carrier gas Praxair HE K 1 cc/min
16-channel silicon electrode Neuronexus Technologies a4x4-3mm50-177
Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 For making custom tetrodes and stereotrodes
Pre-amplifier Tucker-Davis System PZ-2
Amplifier Tucker-Davis System RZ-2
Data acquisition system - OpenEx suite Tucker-Davis System
Online spike-sorting software - SpikePac Tucker-Davis System
Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
  3. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
  4. Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
  5. Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
  6. Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
  7. De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
  8. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
  9. Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
  10. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
  11. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
  12. Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
  13. Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
  14. Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
  15. Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
  16. Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. e3440 (2011).
  17. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. e1098 (2009).
  18. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. e3282 (2011).
  19. Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
  20. Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
  21. Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
  22. Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
  23. Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
  24. Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
  25. Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
  26. Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
  27. Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics