זיהוי נדיפים חוש ריח באמצעות קלטות כרומטוגרפיה-Multi-יחידת גז (GCMR) באונת מחושי החרקים

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

רמזי ריח לתווך התנהגויות רבות ושונות בחרקים, ולעתים קרובות הם תערובות מורכבות מורכבות מעשרות עד מאה תרכובות נדיפות. שימוש בגז כרומטוגרפיה עם הקלטה רבה ערוצית באונת מחושי החרקים, אנו מתארים שיטה לזיהוי של תרכובות ביו.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Byers, K. J., Sanders, E., Riffell, J. A. Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (72), e4381, doi:10.3791/4381 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

כל היצורים חיים בעולם מלא בגירויים חושיים שקובעים התגובה התנהגותית ופיזיולוגית שלהם לסביבתם. Olfaction חשוב במיוחד בחרקים, המשתמשים במערכות חוש הריח שלהם כדי להגיב, ולהפלות בין גירויי ריח, מורכבים. ריחות אלה לעורר התנהגויות אשר מתווכים תהליכים כגון רבייה ובית גידול בחירת 1-3. בנוסף, חישה כימית על ידי חרקי התנהגויות מתווכות שהם משמעותיים ביותר לחקלאות ולבריאותו של אדם, כוללים האבקה 4-6, תזונה צמחונית של גידולי מזון 7, והעברת מחל 8,9. זיהוי אותות ריח ותפקידם בהתנהגות חרקים כן חשוב להבנת שני תהליכים אקולוגיים ומשאבי מזון אדם ורווחתו.

עד כה, זיהוי נדיפים המניעים את התנהגות חרקים כבר קשה ולעתים מייגע. טכניקות שוטפות כוללותהקלטת גז כרומטוגרפיה מצמידי electroantennogram (GC-EAG), וגז כרומטוגרפיה שילוב הקלטות sensillum יחידות (GC-SSR) 10-12. טכניקות אלה הוכחו כחיוניים בזיהוי של תרכובות ביו. אנחנו פתחנו שיטה שמשתמשת בגז כרומטוגרפיה מצמידה להקלטות אלקטרו מרובים ערוצים (מכונה 'GCMR') מתא העצב באונת המחושים (AL; מרכז ההרחה הראשוני של החרק) 13,14. טכניקה זו מדינה-of-the-art מאפשרת לנו לחקור כיצד מידע ריח מיוצג במוח החרק. יתר על כן, בגלל תגובות עצביות לריחות ברמה זו של עיבוד חוש ריח הן בגלל רגישות גבוהה למידת ההתכנסות של נוירונים הקולטן של האנטנה לנוירונים AL, הקלטות AL תאפשרנה זיהוי של רכיבים פעילים של ריחות טבעיים ביעילות וברגישות גבוהה. כאן אנו מתארים GCMR ולתת דוגמה לשימוש בו.

כמה צעדים כלליים הם involVED בזיהוי של ביו נדיפים ותגובה של חרקים. נדיפים ראשונים צריכים להיות שנאספו ממקורות העניין (בדוגמה זו אנו משתמשים בפרחים מסוג פרח הקוף (Phyrmaceae)) ומאופיין במידת הצורך באמצעות טכניקות הסטנדרטיות GC-MS 14-16. חרקים מוכנים למחקר באמצעות נתיחה מינימאלית, לאחר שחוט רושם מוכנס לתוך אונת מחושים ורבי ערוצי הקלטה עצבית מתחילה. לאחר העיבוד של הנתונים העצביים ואז מגלה שodorants מסוים לגרום לתגובות עצביות משמעותיות על ידי מערכת העצבים של החרקים.

למרות הדוגמא שנציג כאן היא ספציפית למחקרי האבקה, GCMR ניתן להרחיב למגוון רחב של אורגניזמים לימוד ומקורות נדיפים. לדוגמה, בשיטה זו ניתן להשתמש בזיהוי odorants מושך או דוחה חרקים ומזיקי וקטור צומח. יתר על כן, GCMR יכול לשמש גם כדי לזהות משיכה לחרקים מועילים, כגון פוllinators. הטכניקה עשויה להיות מורחבת לנושאים שאינם חרקים, כמו גם.

Protocol

1. Follection ההפכפך

  1. בדוגמה זו, אנו משתמשים בדגימות נדיפים ממ ' פרחי lewisii - יליד אלפיני פרחי בר בקליפורניה. נדיפים נאספים באמצעות שיטות ספיחה דינמיות לפי Riffell et al. 14. בקצרה, שיטה זו מעסיקה מערכת השמנת לולאה סגורה שבו פרחים מוקפים בשקית טפלון. שימוש במשאבת ואקום אינרטי, האוויר סביב הפרחים נשאב באמצעות "מלכודת" המורכבת מפסטר פיפטה מלאה Porapak Q מטריצה. אוויר ההחזרה מהמשאבה מסונן על ידי פחם פעיל. לאחר פרק זמן שנקבע, במקרה שלנו 24 השעות, Porapak Q מטריצת eluted עם הלא קוטבי ממס, בדרך כלל הקסאן, לאסוף את התמצית המרוכזת. אז התמצית מאוחסנת ב-80 ° C עד ניתוח. במידת צורך, דגימות יכולות להיות מרוכזות לקראת ניתוח תחת זרם של גז חנקן. אם המדגם הוא גם מאופיין כבר, לרוץ aliquot שלו דרךגז כרומטוגרף מסת ספקטרומטר (GC-MS) כדי לזהות רכיבים תנודתיים לפני שימוש במדגם.

2. הכנת אלקטרו

  1. חותך כ 1 סנטימטר מהקצה של קצה פיפטה 1000 μl. הנח דבורה (רקפת Bombus) לבסיס של קצה פיפטה ודחף בעדינות לכיוון הקצה השני של הקצה עד שרק ראשו חשוף.
  2. ממס שעוות שיניים ולעצב אותו סביב ראשו החשוף, ולוודא כי נדבק השעווה על העיניים המתחמות לביטחון וכדי שהראש של הדבורה נייחת לחלוטין. הקפד שלא לקבל כל שעווה על האנטנה של הדבורה.
  3. ברגע שראשו כבר מובטח, להפוך את הכיכר, חתך, חלון דמוי לתוך כמוסת הראש באמצעות תער להב מפסק או בגודל מתאים אזמל כדי לחתוך את הציפורן. שימוש בלהב המפסק, להתחיל מהצד הגבי של כמוסת הראש, מייד מאחורי אחד האנטנה וסמוך לעיניים המורכבות. חותךקו ישר, מעין אחת למתחם העין המתחמת הנגדית. לאחר חיתוך קו ישר לעין המורכבת ההפוכה, להתחיל לבצע חתך dorsally עד עקומות ראש הקפסולה ומסתיימת באזור בית החזה שלה. בשלב זה, מתחיל לחתוך לכיוון הקצה השני של הקפסולה בראש. לבסוף, לאחר השורה נחתכה לקצה השני, לחתוך קו בחזרה למצב ההתחלתי של החתך הראשוני. חשוב להסיר את הציפורן שנמצאה בסמוך לאנטנה, כפי שזה יעכב את הכניסה של האלקטרודה.
  4. ברגע שהציפורן היא לחתוך, השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר את ציפורן הדבורה, שאמור לחשוף ואז המוח של הדבורה, וחשוב יותר, את אונות מחושים. מייד מתחיל superfusing המוח עם מלח חרקים, כך שהמוח אינו הופך מיובש. אחרי המוח חשוף, להשתמש בזהירות זוג מלקחיים עדינים מאוד כדי להסיר את נדן perineural מייד מעל אונות מחושים. להיות זהיר מאוד שלאלנקב המוח של הדבורה עם המלקחיים.

3. כרומטוגרפיה של גז עם הקלטה מרובים ערוצים

  1. הדבורה "ההכנה" - קבועה בצינור עם המוח שלה נחשף - עכשיו הוא מוכן להקלטת אלקטרו. הנח את הדבורה במלחציים, מחובר לבסיס מגנטי שנמצא על שולחן אוויר.
  2. סדר שקית האינפוזיה, בקר זרימה, וצינור (מלא בתמיסת מלח חרקים) כך שמלוח ברציפות superfuses המוח.
  3. שימוש micromanipulator, אלקטרודה insertareference, עשוי חוטי טונגסטן, לתוך העין של הדבורה.
  4. שימוש micromanipulator נפרד, הכנס אלקטרודה ערוץ רב, כגון tetrode מפותל תיל, או האלקטרודה רבה ערוצי סיליקון (טכנולוגיות Neuronexus), לאונות המחושים של הדבורה. אלקטרודה זו מחוברת למגבר מראש כגון סדרה של מערכת TDT S-3 Z למעבד bioamp Z-אוטובוס של מערכת TDT. פלט מהגז Chroהגלאי של matogram באמצעות כבל BNC מסוכך יכול להיות ממשק עם מערכת רכישת המגבר ונתונים כגון ששניהם אות העצבית ומסונכרנת GC.
  5. יש להמתין כ 30-60 דקות להקלטות העצביות לייצוב. ברגע שהפעילות ספונטנית ובצורת גל של יחידות בערוצי ההקלטה הפכו עקבית, השתמש במזרק ריח כדי לעורר את הדבורה ולבחון את התגובה של ערוצי ההקלטה לריח.
  6. הקלט קוצים תאיים מתאי עצב על ידי קביעת ערכי סף אוטומטי את ערוצי ההקלטה של ​​3.5-5 סיגמא של האות בערוצי ההקלטה הבודדים. thresholding הידני עשוי להידרש לערוצים מסוימים, כדי למנוע זיהום מרעש חשמלי. את פוטנציאל הפעולה מהנוירונים יופיע כקוצי מתח בערוץ ההקלטה. כאשר המתח של הערוץ עולה על הסף, המערכת אוגרת וחוסכת את כמה אלפית לפני ואחרי חציית הסף, ובכך לוקחתga Snap-זריקה של הגל, או ספייק.
  7. מייד בסמוך לשולחן האוויר הוא GC. לפני הזרקת התמצית הפרחונית לGC, לוודא שהשיטה לרמפת הטמפרטורה של ריצת GC היא נכונה. בדוגמא שלנו, אנו משתמשים בשיטת הטמפרטורה מתחילה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות אחרי עלייה של טמפרטורה בשיעור של 10 מעלות צלזיוס / דקה. עד 220 מעלות צלזיוס, שבזמן שאנו מחזיקים GC ל6 דקות נוספות. אנו משתמשים DB-5 עמודת GC (J & W מדעי, פולסום, קליפורניה, ארה"ב), עם הליום כגז המוביל. הכניסה היא splitless, עם טמפרטורה להגדיר עד 200 ° C. טמפרטורת גלאי להבת היינון מוגדרת עד 230 ° C.
  8. הזרק מדגם התמצית של אמיץ הפרחוני ליציאת ההזרקה המחוממת של GC לשחרר את נדיפים adsorbed לעמודת GC. השפכים מהעמודה מפוצלים 01:01 בין גלאי להבת היינון (FID) ואנטנת הדבורים באמצעות זכוכית "Y" מחבר (J & W מדעי). בגין recציוד רפואי ומדעי מאלקטרודה כפי שאתה מזריק לתוך מדגם GC.
  9. לאחר ריצת GC סיימה, הניח להכנה במשך 5 עד 15 דקות. אז או להזריק דוגמה נוספת לGC או לעורר באמצעות הכנת תרכובות נדיפות בודדות או תערובות של תרכובות. בשיטה שנייה זה של גירוי ההכנה, פולסים של אוויר מזרם אוויר קבוע מופנים באמצעות מזרק זכוכית המכיל פיסת נייר מסנן שבו התרכובות הופקדו. גירוי הריח היה פעם באמצעות שסתום סולנואיד הופעל נשלט על ידי התוכנה.
  10. אם פעילות של יחידה מפסיקה לפתע או שינויים, בדוק את עירוי תמיסת המלח ולהניח להכנה במשך 15 דקות. אם הפעילות הספונטנית אינה להשיב את רמתה הקודמת ולאחר מכן את ההכנה אמורה להיות מושלכת ועוד דבורה בשימוש אם הוא זמין.
  11. לאחר הניסוי, לתקן את המוח עם 5% פורמלין למשך 20 דקות עם הבדיקה עדיין ברקמה. בשלב הבא, בלו המוחולמקם אותו בglutaraldehyde 2% ל 4 שעות, ולאחר מכן לעשות סדרת התייבשות אתנול מדורגת ולנקות את המוח עם סליצילט תיל. בהתבסס על התיקון והניקוי של רקמות, מקומות בAL בי האלקטרודות נקבה את הרקמה צריכה להיות ניכרת היטב על ידי מיקרוסקופיה confocal.

4. ניתוח נתונים

  1. לנתח נתונים שנאספו לאחר הניסוי להפריד ולזהות את היחידות העצביות המוקלטות. השתמש בתוכנות טיפוסיות (סדרן מנותק, MClust, וSClust) לגל נפרד, או "קוצים", המבוסס על צורות ספייק, כמו שיא או העמק אמפליטודה, חץ רוחב שיא, וכו ', או באמצעים מופחתים (רכיבים עיקריים) 17 , 18 (איור 2). השתמש רק בצבירים אלה של קוצים שהפרידו במרחב תלת ממדי (PC1-PC3) ובחינה סטטיסטית שונה אחד מהשני (ANOVA הרב המשתנה, p <0.05) (איור 2) לניתוח נוסף. עייןצל"ש # של 17-19 לתיאור מלא של הקלטת tetrode ומתודולוגיות ספייק מיון-.
  2. קוצי חותמת זמן בכל אשכול, ולייצא נתונים אלה לניתוח באמצעות MATLAB או Neuroexplorer (טכנולוגיות Nex, ווינסטון סאלם, צפון קרוליינה) ליצירת חלקות רסטר ותגובות קצב ירי (איורים 2, 3 א).
  3. זהה את זמני השמירה של נדיפים תוך שימוש בנתוני GC נרשם בו זמנית. השתמש בזמני השימור של נדיפים, שנקבעו על ידי השיא של השיא מהכרומתוגרמה, לבחון תגובות יחידה בנקודתי הזמן אלה.
  4. כדי לבחון תגובות יחידה בודדות באמצעות הפעלת GC, ייפטר מספר הקוצים במרווחי 100 msec ולבחון את הזמן במהלך ירי תגובת שיעור תוך התייחסות לזמן השמירה של משחררי נדיפים. Binning שיבולים במרווחי 100 msec מספק מספיק פרטים, או אות, על הזמן כמובן של התגובה העצבית לodorant משחררים מGC.
  5. לExaלכרות את תגובות אוכלוסייה לנדיפים המשחררים השונים, לשלב את תגובות קצב הירי של יחידות בודדות מעל חלון 3 שניות דגימה, 1.5 שניות לפני, ו -1.5 שניות אחרי, זמן השמירה של נדיף (איור 3). פרק זמן זה הוא אופייני לתקופת משחררים הפכפכים מGC. אנחנו מראים ירי תגובות תעריפים, ביחידות על ידי קידוד צבעיהם (אדום הוא תגובת קצב ירי גבוהה; הכחול הוא תגובה נמוכה) וסידורם כמטריצת פעילות עם כל שורה מייצגת את התגובה להרכב שפכי GC (עמודות) ( איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בבדיקה באמצעות GCMR מ ' ניחוח פרחוני lewisii, אנחנו מזריקים 3 μl של התמצית לGC. המספר הכולל של נדיפים משחררים דרך GC הוא בדרך כלל 60-70 נדיפים. הריח של מ ' lewisii מורכב בעיקר מmonoterpenoids, כולל myrcene β (אציקליים) וα-pinene, יחד עם שארית הריח המורכב מנדיפים שש פחמן, כגון 2-hexanol וsesquiterpenoids המרכיבים <1% מאמיצים.

GCMR מנצל את הרגישות של תאי עצב באונת מחושים כמו גם העיבוד העצבי של נדיפים ביולוגיים חשובים. עם זאת, הקלטות מרובות ערוצים מסוג זה, למעשה, לוקחים מדגם אקראי של תאי עצב באונת המחושים. הסיבה לכך היא שינויים קלים במיקום של עמדת הבדיקה בין הכנות שונות יכולים לגרום למערך ההקלטה לטעום נוירונים שונים. יתר על כן, את העמדות המדויקות ומוrphologies של הנוירונים המוקלטים אינם ידוע משום שההקלטה היא תאית. כדי להתאים לתופעות אלה, בדרך כלל להריץ ניסויי GCMR עם 8-16 הכנות, עם 8-18 יחידות עצביות בכל הכנה. לצורך ההמחשה, לעומת זאת, אנחנו נשתמש בנתונים מהכנה אחת בלבד (8 יחידות).

מניסויי GCMR, מצאו כי יחידות הן סלקטיבית מפתיעה בתגובתם לנדיפים, כמתואר באיור 3 א. העקבות התחתונות (בשחור) מציינות הכרומתוגרמה היון, שבו שיא כל המקבילה תנודתי בהתחשב בכך שהוא מגיע לגלאי לאורך זמן. העקבות העליונות (כחול) מראות את תגובות קצב הירי של יחידה. תגובות יחידה חושבו על ידי binning את המספרים של דוקרנים המיוצרים במרווח 100 אלפיות שני, והחלוקה ידי שמסגרת זמן כדי לייצר קצב. בדוגמא, היחידה העצבית היא סלקטיבי בתגובה ל D-limonene. שים לב, כי ביחידה זו, firin הספונטנישיעור גרם עדיין יכול להיות משתנה ונתון לתנודות אקראיות. עם זאת, תגובות לD-limonene היינו הרבה מעל 95%, כפי שמחושבים על ידי השונות בתגובות קצב הירי לאורך זמן.

לא כל היחידות, לעומת זאת, הגיבו לנדיפים משחררים מGC. למעשה, בממוצע כ 50% מיחידות שנרשמו בכל הרכב היו מגיבים (איור 3 ב '). זה מפתיע בהתחשב במגוון של תרכובות נדיפות באמיצים הפרחוני המשחררים מGC. עם זאת, חלקם של יחידות שאינן מגיבים כלל בהרכב הוא עקבי מפתיע בין הכנות, כפי שנמצאו במחקרים קודמים, 13,14.

מעבר לתגובות של יחידות בודדות, מערכת GCMR גם מאפשרת הניתוח של תגובות אוכלוסייה ברמה לodorants משחררים מGC. בדוגמא שמוצגת כאן, יש סלקטיביות הרכב חזקה לקבוצה של כמה odorants ( וטרנס β-ocimene, בהתאמה) לתגובות חזקות בהרכב, כפי שהוא מיוצג על ידי קצב הירי המנורמל של כל יחידה בהרכב (בסולם צבעים).

איור 1
איור 1. תרשים סכמטי של אמיץ את הספיחה ומערכת GCMR. (א) בסכמטית, פרח סגור בתוך שקית טפלון, ובאמצעות משאבת ואקום, האוויר מהשקית נשאב דרך מלכודת נדיף (Porapak ש) להתרכז נפלט נדיפים. האוויר מסונן וחזר לפרח הסגור. (ב) מדגם התמצית של אמיץ הפרחוני הוא להזריקאד GC והשפכים מהעמודה חצוי של הזרימה כזאת שנכנסה לגלאי יינון הלהבה של GC או, ובמחצית השנייה של השפכים מתבצעת על ידי העברת קו מחומם ומגיע במקביל באנטנה של הדבורה. פוטנציאל פעולה מההרכב העצבי AL נרשם ברציפות extracellularly במהלך 20 דקות של מסירת ריח באמצעות GC. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. מיון של יחידות הוקלט באמצעות מערך הקלטה רבה ערוצית (MR) באל של הדבורה. שני אנקס הם מרווחים באופן שהמערך מקיף נפח גדול של אל. () אופייני צורת הגל (לדוגמא מגבר litude, עמק) של כל אחד "ספייק" בהקלטת tetrode ניתן להתוות בחלל תלת ממדים. בדוגמא שמוצגת כאן, הגובה של כל ספייק ב3 של 4 ערוצי ההקלטה זמם ב 3-D. מכיוון שכל יחידה תהיה צורת ספייק שלו, את הקוצים מיחידה נתונה אשכול יחד, ובכך מאפשרים ליחידות להיות מזוהות וממוינים אחד מהשני. יחידות מיון הראו הבדלים ברורים בתגובות ירי (B; עלילת רסטר) וצורת גל (C) מיקום של ארבעת הערוצים בכל שוק שמספקים הקלטה של אזורים רחבים בעיבוד glomeruli וneuropil. פעילות עצבית נרשמה בכל אחד מארבעת הערוצים, זמם בחלל 3-ממדי (כפי שמוצג ב), ומסודר על פי מאפייני צורת גל. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

דרכים "> איור 3
איור 3. () ירי היסטוגרמות שיעור של תגובות יחידה לתרכובות משחררים ממ ' lewisii אמיץ את התמצית (3 הזרקת μl) (עקבות תחתונות, שחור). odorants מסוים (לדוגמא D-limonene; חץ אדום) עורר תגובות משמעותיות ביחידות (ב ') תגובה של כל היחידות שנרשמו מMR לכל odorant eluted מGC.. עלילת המשטח מקודדת באמצעות צבע בהתאם לתגובות קצב הירי המנורמלות של היחידות הבודדות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התנהגויות חרקי חוש ריח בתיווך לנהוג תהליכים רבים ושונים, כולל רבייה, בחירת מארח אתר, וזיהוי משאבי מזון המתאימים. חקר התהליכים הללו מחייב את היכולת לזהות את נדיפים הנפלטים מהמקור, כמו גם את היכולת לזהות תרכובות אלו המתווכים את ההתנהגויות. מסבך עניינים הוא שריחות מורכבים מעשרות עד מאה הבודדות של תרכובות היוצרות שילוב ניחוח ייחודי שנתפס באופן שונה מהמרכיבים הבודדים 6,7,13,19,20. מחקר, שנערך בתחילה במערכת מין פרומו 12, ולאחרונה בריחות מזון והטלה הקשורות 13,20, הראה כי היעילות ההתנהגותי של התערובת מתגוררת כפונקציה של כמה נדיפים, מפתח בתערובת, ו כי התערובות לעורר תגובות התנהגותיות גבוהה משמעותיות מהמרכיבים הבודדים. לזהות את אלה מפתחמרכיבים הם אפוא מרכיב חשוב באקולוגיה הכימית של ימינו, כמו גם ריח נוירוביולוגיה.

מגוון טכניקות שהתעורר בחמישים השנים האחרונות לזיהוי של תרכובות ביו שלנהוג התנהגות בחרקים. הטכניקה העיקרית לגילוי נדיפים ידי אנטנת החרקים היא גז כרומטוגרפיה electroantennography (GC-EAG). EAG פותח במקור על ידי 21 שניידר, שנרשם תנודות מתח קטנות בדרך כלל מניחים להיגרם על ידי depolarisations החשמלי של תאי עצב הרחה רבים בין הקצה ובסיס אנטנת חרקים בזמן הגירוי. EAG מאוחר יותר משולב עם GC לזיהוי מדויק של נדיפים אמיצים שיעוררו תגובות מחושים 12,22. בנוסף, ההקלטה של נוירונים הקולטן בודדים מאנטנת החרקים מאוחר יותר פתחה 11,23 ויחד עם GC לספק הקלטות חד sensillum, או GC-SSR.lthough GC-SSR הוא יותר זמן אינטנסיבי וקשה מאשר GC-EAG, את ההקלטות מספקות מידע על תגובות תא הבודדות באמצעות פוטנציאלי פעולה בתגובה לGC-שפכים, ומאפשרות זיהוי של קולטנים המתמחים לתרכובות מסוימות ה לא יכול להבחין 24 GC-EAG.

GC-EAG וטכניקות GC-SSR להציע זיהוי של נדיפים אלה שיעוררו תגובות בפריפריה, ובכך מעורבים בקבלת odorant. טכניקות מאוחרות יותר החלו לבחון תגובות במערכת העצבים המרכזית של שני יונקים וחרקים, ולכן הם מעורבים בתפיסת odorant. טכניקות אלה נופלים תחת שתי קטגוריות רחבות: שיטות הדמיה 25 כינה GC-I (גז כרומטוגרפיה הדמיה) ושיטות אלקטרו ישירים (למשל GCMR). GC-אני וGCMR מציעים מספר יתרונות בגלל ההתכנסות של תאי העצב התחושתי להקרנה, או הפלט, נוירונים באל על, כמו גם ששיטות אלו מאפשרות לקבוע כיצד odorants מיוצג במוח החרק. יתר על כן, בשיטות דומות כיום בשימוש במוח של היונקים 25.

למרות יתרונות אלה, GCMR וGC-אני מציע גם מגרעותיו. ניתוח נתונים יכול לגזול זמן רב, ובמקרה של GCMR, תחזיות גלומרולרי של היחידות העצביות המוקלטות אינן ידועות בשל היותם הקלטות תאיות. יתר על כן, אל על החרק מעוצבבים על ידי מספר סוגים עצביים שונים, כוללים נוירונים הקרנה (PNS) וinterneurons המקומי (LNS) ובכך הופך את זיהוי של היחידות הקשות המוקלטות. עם זאת, בעש, מ ' סקסטה, העבודה אחרונה הוכיחה שניתן לזהות PNS וLNS ידי התנהגות spiking של הנוירונים, ובכך מאפשרים לזיהוי סוגי תאי עצב אלה על ידי הפעילות הספונטנית שלהם 26. עם זאת, GCMR וGC-אני מאפשר זיהוי של odorants שactivatדואר נוירונים הקולטן ייחודיים שלא יכול לעורר תגובות חזקות EAG, כמו גם קביעה כיצד האוכלוסייה של תאי עצב במוח בתהליך נדיפים. מחקר שהשווה בין שיטות שונות אלו טרם נערך, למרות שהנתונים הראשוניים שלנו עולים כי GCMR עשויה להיות מתאים יותר מאשר GC-EAG לתרכובות שנמצאות ביו אך נמצאים ברמות קורט בתמצית (לא פורסמו תוצאות Riffell). עבודה עתידית עשויה לבחון את התחלופה ברגישות של גילוי odorants יו עם זמן הניתוח בין מתודולוגיות השונות.

אמנם יש לנו התמקדנו כאן במפרט את שיטות assay אנו משתמשים לB. דבורי רקפת וריח ממ ' lewisii, התמצית ומיני החרקים משמשים יכולים להיות שונים אם שינויים מסוימים עשויים. מיני חרקים ניתן להציב לתוך פיפטה טיפים שונים (10-200 μl) בהתאם הגודל שלהם. מין גדול יותר, כמו הפרפר, Manducaסקסטה, ניתן להציב לתוך 6 בקבוקונים מדגמים מ"ל. באופן כזה, ההכנה היא כל זמן בחיים ובכך לאפשר הקלטות יציבות כמה שעות בזמן.

יחדיו, שיטות אנליטיות לבידוד של תרכובות יחד עם הקלטות אלקטרו בכלי חרקי המוח הנוכחיים הרבים העצמה לזיהוי תרכובות ביו, וכאשר משתמשים בו במקביל לניסויים התנהגותיים, עשוי להציג באמצעותו לקבוע נדיפים חשובים הלקשורה מזון התנהגויות בחרקים 13, כמו גם את אלה העוסקים במארח האתר 2, והתנהגויות הקשורות בדם מארח 27 שחשובים למזיקים ווקטורים של מחלה חקלאיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF IOS 1121692, ועל ידי אוניברסיטת קרן המחקר של וושינגטון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Porapak Type Q 80-100 mesh Waters WAT027060
Reynolds Oven Bags Reynolds
GC Agilent 7820A
GC column J&W Scientific, Folsom, CA, USA DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
Analytical helium carrier gas Praxair HE K 1 cc/min
16-channel silicon electrode Neuronexus Technologies a4x4-3mm50-177
Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) Sandvik Kanthal HP Reid PX000004 For making custom tetrodes and stereotrodes
Pre-amplifier Tucker-Davis System PZ-2
Amplifier Tucker-Davis System RZ-2
Data acquisition system - OpenEx suite Tucker-Davis System
Online spike-sorting software - SpikePac Tucker-Davis System
Offline spike-sorting software - Mclust Spike-sorting toolbox David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html MATLAB toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  2. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
  3. Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
  4. Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
  5. Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
  6. Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
  7. De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
  8. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
  9. Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
  10. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
  11. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
  12. Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
  13. Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 Forthcoming.
  14. Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
  15. Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
  16. Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. e3440 (2011).
  17. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. e1098 (2009).
  18. Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. e3282 (2011).
  19. Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
  20. Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
  21. Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
  22. Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
  23. Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
  24. Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
  25. Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
  26. Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
  27. Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics